通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸组织形态学及生精细胞凋亡的影响

中国中医药科技2009年7月第16卷第4期july

2009V01．16No．4

通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸

形态学及生精细胞凋亡的影响

崔云冯奕郑武郑军状1

(浙江中医芮大学附属宁波中医院

宁波315010

1浙江中医药大学

杭州310053)

组织

*

摘要目的：探讨通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸病理改变及生精细胞凋亡的影响。方法：采

用部分缩窄左肾静脉法建立实验性精索静脉曲张大鼠模型，遣模后再随机分为模型组。通精灵低剂量组、中剂量组、高剂量组，并取10只作假手术组，造模1个月后开始给药，连续给药2个月。光镜观察睾丸组织结构改变；透射电镜观察睾丸起微结构改变；原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(，11INⅡ．)检测睾丸生精细胞凋亡。结果：模型组大鼠睾丸组织可见明显的病理性改变，通精灵各组大鼠睾丸组织的病理性改变较模型组减轻，模型组生精细胞凋亡明显增加，通精灵备组凋亡率低于模型组。结论：通精灵对实验性精索静脉曲张造成的睾丸组织形态学改变有保护作用，并能降低精索静脉曲张造成的生精细胞过度凋

亡。

主题词精索静脉曲张，中医药疗法@通精灵，治疗应用精索静脉曲张，病理学细胞凋亡大鼠精索静脉曲张可损害睾丸的组织结构与超微结构，引起生精细胞的过度凋亡，其机制可能与皋丸淤血缺氧、温度升高及毒素返流等多种因素有关…。细胞凋亡在精子发生的生理、病理过程中充当了重要的角色，可能是人体清除剩余或缺陷细胞的正常生理机制，也可能是引起不育的病理环节。生精细胞的凋亡在控制精子数量方面起关键作用【2】，是生精过程中发生的一种生理现象。生精细胞凋亡的异常增多，使得功能细胞减少，势必影响生育能力。临床研究证实，通精灵能有效地促进精索静脉曲张不育症患者手术后睾丸生精功能的恢复。本实验研究主要探讨通精灵对实验性精索静脉曲张所致的睾丸组织病理学改变及生精细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。1材料与方法

1．1

刚法【引。用3％戊巴比妥钠按40m∥kg体重腹腔注射麻

醉，常规消毒，左侧腹部切口，小心暴露左侧肾静脉，用玻璃探针轻轻剥离靠近下腔静脉的左肾静脉、肾上腺静脉、精索静脉、下腔静脉；于肾上腺静脉和精索静脉的内侧、下腔静脉外侧，用微血管钳小心分离左肾静脉深面，置一直径Inert的光滑金属探针于左肾静脉之上，将其和左肾静脉一起结扎，借此使左肾静脉缩窄，抽出探针，使肾静脉部分复通，结扎后，可见左肾静脉迅速扩张，逐层缝合腹壁。假手术组只行左肾静脉分离，不结扎左肾静脉。

1．5给药方法假手术组与模型组：手术1个月后予以生理盐水，按lml／1009体重灌胃。通精灵低、中、高剂量组：手术1个月后，分别予以含生药0．69／ml、1．29／IId、2．49／ml通精灵水煎剂，按Iml／1009体重灌胃。每日1次，连续60天。1．6标本的制备末次给药后，将实验大鼠用乙醚吸人麻醉，开腹取出左右侧睾丸，用冷生理盐水冲洗，除去血液，去除被膜血管，滤纸吸干，电子天平称重后，放人10％中性缓冲福尔马林(pH'／．4)溶液固定，24小时后梯度酒精脱水。二甲苯透明，浸蜡、包埋备检。1．7观察指标及检测方法

1．7．1组织病理学变化及超微结构改变光、电镜观察。1．7．2生精细胞凋亡检测脱氧核苷酸转移酶介导的原位

实验动物清洁级成年雄性Wistar大鼠50只，体重

220．2408，浙江中医药大学实验动物中心提供。

1．2实验试荆及药物1r17NⅡ．原位末端标记试剂盒：武汉博士德生物制品公司。免疫组化检测试剂盒(两步法)：美国

LabVi

sion—NeoMarkers公司产品。DAB显色试剂盒：武汉博

士德生物制品公司。通精灵药物组成：丹参、红花、菟丝子、五加皮、枸杞子、三七粉、柴胡、炒露蜂房、煅龙骨、煅牡蛎等，将上述药物水煎浓缩．配制成0．69／n,．t(含生药量)、1．29，Inl、冰箱备用。2．49／mI3种浓度的药液，灭菌后于4。C

1．3动物分组大鼠称重后随机分组、编号，即假手术组10只、模型组10只、通精灵低剂量组lO只、中剂量组IO只、高剂量组lO只。

1．4模型制作方法将实验大鼠普通饲料饲养，自由饮食、饮水1周，观察无异常后，即可造模。模型的制备方法参照

缺口末端标记(1rI唧．)法。检测严格按试剂盒说明书操作

步骤进行。参考相关文献计分方法¨J，在光学显微镜200倍视野下计数正常细胞和调亡细胞，并求出凋亡指数(．poptod8index，AI)，凋亡指数(％)=视野内的阳性细胞数／视野内总细胞数×100％。

1．8统计擘处理统计学处理用SPSSl3．0统计软件完成，采用t检验和单因素

差分析。

2结果

*浙江省宁波市医学科技计划项日No．2007015

中国中医药科技2009年7月第16卷第4期岫2009

V01．16N0．4

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2．1通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸组织形态学的影响

2．1．1光镜观察假手术组：左右侧睾丸曲细精管未见萎缩，未见生精上皮脱落，曲细精管结构清晰，层次分明，各级生精细胞形态正常，曲细精管管腔内可见精子细胞及大量精子，支持细胞，间质细胞可见。模型组：左侧睾丸可见到正常与异常的曲细精管交错存在，呈典型的。斑点样”改变(病变部位呈局灶性)，生精上皮变薄，基底膜变厚，各级生精细胞减少．出现生精阻滞，阻滞在精子细胞和精母细胞阶段，未成熟的生精细胞向管腔内脱落，曲细精管内可见到少量的精子细胞、精子；睾丸间质可见水肿，间质细胞空泡样变性；右侧睾丸出现与左侧相似的病理改变，但程度明显比左侧轻。通精灵低剂量组：左侧睾丸在低倍镜下见到典型的。斑点样”改变，在高倍镜下见到部分曲细精管萎缩，少见曲细精管塌陷。精原始细胞和支持细胞减少，存在生精阻滞，阻滞在精子细胞与精母细胞阶段；睾丸间质水肿，问质细胞变性；右侧睾丸也出现相似病变，但较左侧为轻。通精灵中剂量组：左侧睾丸在低倍镜下见到“斑点样”改变，但异常曲细精管明显减少，在高倍镜下见部分曲细精管萎缩，管壁层次较为清晰，精原细胞和支持细胞比模型组明显增多，精子细胞多见；右侧睾丸病理改变与左侧相似，程度比左侧轻。通精灵高剂量组：左侧睾丸在低倍镜下见到“斑点样”改变，异常曲细精管较少，在高倍镜下见部分曲细精管萎缩，管壁层次较清晰，精原细胞和支持细胞比模型组明显增多，精子细胞较多；右侧睾丸也出现相似病变，但较左侧轻。

2．1．2透射电镜观察假手术组：生精细胞与支持细胞之间的细胞连接正常，支持细胞位于基膜上，核膜清晰，核周隙窄而均匀，细胞器无变性；各级生精细胞排列层次清晰，核形态正常，核仁清晰，核周间隙窄而均匀，精子细胞细胞形态正常，细胞器类型、位置、数目正常。模型组：生精上皮基膜明显增厚，呈现波浪状，界膜明显增厚，胶原纤维增多；支持细胞结构改变不一，线粒体增多，肿胀，内有大量大小不等的空泡及自噬体，内质网扩张；各级生精细胞受到不同程度的损伤，精原细胞排列紊乱，核周隙增宽，线粒体肿胀、髓鞘样变；精母细胞内可见核周隙明显，胞浆内出现空泡，部分内质网扩张，甚至可见到核固缩、核消失；可见到凋亡小体，生精细胞凋亡增加。通精灵低剂量组：界膜增厚，支持细胞内见大量空泡，线粒体肿胀，各级生精细胞均不同程度损害，损害程度较模型组减轻，精子细胞较少，且形态异常。中剂量组：病理损害较模型组明显减轻，支持细胞及各级生精细胞的损伤减轻，可见到较多的精子细胞、精子。高剂量组：生精细胞核膜、细胞膜完整，细胞器变性较少见，各级生精细胞可见，支持细胞细胞器可见轻度变性。

2．2通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的影响凋亡的阳性细胞细胞核呈黄色或棕色，假手术组出现较少的、散在的生精细胞凋亡；模型组及通精灵各组均出现较多的凋亡细胞，染色的阳性细胞主要分布在各级生精细胞，凋亡主要发生在各级精母细胞，精子细胞少见，模型组及通

精灵各组右侧皋丸也可见到凋亡的阳性细胞。各组凋亡指数比较见表l。

表1

各组大鼠左侧睾丸生精细胞凋亡的比较(；±s，％)

与假手术组比较△P<0．c15，△△P<0．01；与模型组比较*P‘

0．05．**P<0．0l

3讨论中医学理论对于精索静脉曲张不育症的认识，尚存不同的观点，笔者经多年前期临床研究，认为精索静脉曲张不育症的病机当从肝肾立论，肝络瘀阻、肾精不足是本病的基本病机；基本治则是疏肝通络强精。通精灵是笔者从多年治疗精索静脉曲张不育症处方中优选出来的有效组方，临床研究表明，手术后加服该方治疗能有效促进患者生精功能的恢复，在精子密度、正常形态精子率及配偶妊娠率方面均优于单纯手术治疗者bJ。组方中，柴胡、炒露蜂房人足厥阴肝经，疏肝通络；红花、丹参活血化瘀、祛瘀生新；菟丝子、枸杞子、五加皮、三七粉补肾强精；煅龙骨、煅牡蛎人肝经，疏散郁结；全方具有疏肝通络祛瘀、补肾强精之功效。

正常的生精过程存在生精细胞凋亡，这是维持生精细胞与支持细胞适当比例从而保证正常生育的重要调节机制。但凋亡过多，可导致生精障碍，甚至不育。夏强等进行成年大鼠精索静脉曲张生精细胞凋亡的实验研究时，发现实验组患侧睾丸生精细胞凋亡增多，凋亡指数改变较对照组相比差异有显著性。提示生精细胞凋亡在精索静脉曲张不育机制中具有重要作用【4J。本实验结果表明，实验性精索静脉曲张直接导致了大鼠皋丸组织结构及超微结构的改变，引起生精细胞的过度凋亡，从而影响了睾丸的生精功能。通精灵能不通程度地减轻精索静脉曲张对睾丸的组织形态学影响，减少生精细胞的凋亡，说明通精灵对精索静脉曲张引起的睾丸病理损伤有保护作用。

参考文献

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超微结构的影响．中国中医药科技，2006，13(6)：3鼹．

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(收稿：2006一∞一17)