Bio-Plex悬液芯片技术在生命科学与医学研究中的应用

2.1 Bio-Plex悬液芯片技术应用概述

悬液芯片技术自发明以来的十几年中主要应用于三个领域：基因组学、蛋白质组学和临床诊断检测。在蛋白质组学领域的应用，悬液芯片技术显示出其巨大的优势，其操作与免疫检测技术（ELISA）几乎相同，已经广泛应用于蛋白质的表达谱，蛋白质翻译后修饰如磷酸化、糖基化，以及对蛋白质功能和相互作用的筛查的研究中，主要领域有各种疾病、生理过程的细胞因子表达谱分析、聚焦蛋白质组学（focused proteomics）研究、转化医学、病理与药理和新药筛选等。在核酸检测方面，平板的DNA芯片技术广泛的用于高通量基因表达的平行分析，但是由于一些特殊的DNA应用的出现，研究的范围可能仅限于某一类功能基因组，如某一类疾病的研究、SNP分析验证、病原体检测、micro RNA等，这类应用显然无需巨大通量的DNA固相芯片，而液相芯片更加合适，操作更加简便，芯片组的选择也更加灵活。而在临床诊断领域，悬液芯片是很好的疾病筛查、诊断和监控的工具，现已有广泛的应用，包括呼吸道病原体、肠道疾病病原体的筛查和检测，和一些疾病标志物的检测等等。关于悬液芯片技术在各领域的应用，详细如下表所示：

Bio-Plex悬液芯片技术的应用

基因组学（Genomics）

基因分型（Genotyping） - 基因多态性分析 - 基因突变分析

基于寡核苷酸微球的悬液芯片技术是高效率高通量的SNP分析平台（Ye et al. 2001）；也是进行寡核苷酸配基检测（lannone et al. 2000），单碱基突变分析（Chen et al. 2000），以及聚合酶介导的寡核苷酸单碱基延伸检测（Cai et al. 2000）的有效手段；也证明该技术是进行疾病特异性突变分析的有效手段（(Dunbar and Jacobson 2000, Ward et al. 2002)。

悬液芯片技术最适合进行较小通量的多重基因检测，如单次反应在100个以内，这只需要1小时即可完成96个样品的多重检测。

基因表达（Gene Expression） - 疾病标志物 - 发育过程 - 基因调控

蛋白质组学（Proteomics）

蛋白表达谱分析（Protein Profiling）

- 多重细胞因子检测 翻译后修饰

细胞信号转导蛋白 蛋白功能与相互作用 (Iannone et al. 2001)

对刺激和非刺激细胞、检验组和对照组的细胞因子定量分析已经是悬液芯片技术最普遍的应用。这些因子，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和脂肪因子等，是一群细胞信号蛋白，对这些蛋白的同步检测能揭示细胞、组织或机体免疫反应的复杂机理。（Carson and Vignali 1999, de Jager et al. 2003).

同步检测细胞内多重磷酸化蛋白是理解胞内信号转导所必需的，使用悬液芯片技术是更加高效的磷酸化蛋白的检测手段。(Gao et al. 2003) - 受体-配体结合 - 酶活性

- 蛋白-蛋白相互作用 - 抗体交叉反应与特异性 - 抗原表位扫描

- SNP

- 疾病相关突变检测 - HLA分型

- 血库(Smith et al. 1998). - 转染性疾病筛查

- 疫苗免疫效果筛查(Bellisario et al. 2001, Prevost et al. 2003). - 自身免疫检测 - 过敏反应检测

- 生物标志物检测（如激素、调控蛋白、多肽等等）

(Bellisario et al. 2000, de Jager et al. 2003, Lukacs et al. 2003).

临床诊断(Clinical Diagnostics)

分子诊断

(Colinas et al. 2000) 多重免疫诊断

2.2 Bio-Plex悬液芯片技术在多重蛋白质检测中的应用

现在市面上有很多基于悬液芯片技术的蛋白检测产品，如Bio-Rad公司，包括有细胞因子、趋化因子、生长因子和脂肪炎性因子，磷酸化蛋白、总靶蛋白，以及一些疾病研究的试剂盒，包括糖尿病、血管生成、急性期以及抗体分型等等。如下表所示。这些试剂使用方便，已经广泛的应用与群体蛋白质组学、转化医学和新药筛选等等领域中。

2.2.1 Bio-Plex悬液芯片技术与蛋白质组学研究

蛋白质组学的范围是极其广泛的，传统的生物化学一般只研究一种蛋白质，其代表技术是色谱的分离纯化与分析、一维凝胶电泳分析、ELISA、Western blotting、蛋白质相互作用、晶体结构等等。然而，过去十几年来，两种技术的联姻——2D电泳和质谱，产生了无偏的（Unbiased）或导向发现的（discovery- oriented proteomics）蛋白质组学。而在传统生物化学和蛋白质组学之间还有一种可称为“聚焦”蛋白质组学（focused proteomics）或者“导向系统的”蛋白质组学（System-oriented proteomics），这种蛋白质组学的代表研究技术就是悬液芯片系统。如下图所示。（Gavin MacBeath, Nature Genetics 32, 2002）

传统的蛋白质化学对单个蛋白的结构和功能有很清晰的了解，从而揭示其在细胞或机体中所扮演的角色，但却不能知道该蛋白质是否影响以及如何影响细胞或机体其它蛋白质表达，进而揭示细胞或系统整体性状的改变。虽然“无偏的”蛋白质组学往往可以做到这点，所谓“导向发现”的意思是可以获得一些导致差异（如不同发育、发展阶段，疾病与对照等）的未知蛋白质标志分子；但这种技术仍然有很多的局限性，例如定量问题、样品的通量问题、2D电泳本身的重现性和灵敏度问题等等都限制了该技术的发现能力。例如在研究者准备分析一种特殊的生物样品，如癌症病人的肿瘤组织切片的研究中，不可避免的涉及一次“完全的蛋白质组学”分析，却存在样品中诸多如蛋白的丰度、修饰、活性、定位和相互作用的问题，因此在实际实验设计中，研究者往往只能限定于上述的一到两个参数，或者限定于整体蛋白质中的某一类，如炎性蛋白、血管生成标志蛋白、磷酸化蛋白等等。因此这种类型的实验其实是蛋白表达谱（expression profiling），现在已被广泛的称之为蛋白谱（Protein profiling）的分析。对于一组给定的样品，包括检测组和对照组，聚焦某一类蛋白质的蛋白谱的分析往往能导向新的发现。

Martin Keller et al于2007年研究了活化的Caspase 1是非传统蛋白质分泌的调节因子, 所谓传统的蛋白质分泌途径是蛋白质经核糖体合成后，通过内质网/高尔基体途径，以小泡的方式与细胞膜融合，然后将蛋白质分泌到胞外；然而，某些蛋白质却不通过上述途径分泌到胞外，但其分泌机理却不清楚，这些途径称为非传统蛋白质分泌途径，比如一些炎性蛋白，像IL-β,IL-18和IL-33等，这些炎性蛋白必需由Caspase 1的激活才有活性，为此，作者将Caspase 1进行RNAi处理，以研究该蛋白质在上述炎性蛋白质分泌过程中的作用。对角质化细胞进行Caspase 1的RNAi处理，以研究Caspase 1的功能。对Caspase 1的RNAi细胞和对照组细胞在培养过程中进行紫外照射，刺激其分泌细胞因子。然后测定这些样品的胞外、胞内的27种细胞因子。结果发现对照组的IL-1β胞外浓度是Caspase1 RNAi组的3倍，同时其它如TNF-α,IL-1α,IFN-γ等细胞因子的对照组浓度也比RNAi组的高，这是因为这些蛋白质的表达和分泌受到细胞外环境中IL-1β浓度的影响。因此，这些结果为Caspase 1在非传统蛋白质分泌中的重要角色提供了重要的证据，通过这种机制，也说明应激诱导的

Caspase 1活化是炎症与细胞保护、细胞存活和再生过程的直接关联。

因此，对基于RNAi技术的功能基因组学或蛋白质组学的研究，除了传统的Western blotting或ELISA对单个蛋白质的表达进行分析以表征RNAi的效果，以及用2D电泳技术对整体蛋白质组学进行分析以表征RNAi之后整体蛋白质的表达谱以外，我们还可以用悬液芯片技术，对与研究相关的某一类蛋白质谱进行表征，以寻求之间表达的差异，从而揭示一些规律，应用该技术的好处是样品通量很大，可以单次做到几十个到几百个，这是2D电泳远远不能比拟的，单个样品一次可以同时测定几十种目标蛋白，另一个好处是分辨率很高，可以表征丰度低至0.2pg的蛋白质，还有一个好处是数据处理的自动化，是否有差异可一目了然。

基因组学

RNAi平台

蛋白质组学

蛋白质表达谱分析： －2D 电泳技术 －Bio-Plex悬液芯片

目标基因的功能 生物标志物 。。。

驱动发现的蛋白质组学研究路线

•细胞因子（免疫学相关）

•磷酸化蛋白（细胞信号转导） •脂肪炎性因子（肥胖与糖尿病） •血管增生标志蛋白（肿瘤） •… …

2.2.2 Bio-Plex悬液芯片技术在转化医学中的应用

Bio-Plex悬液芯片的蛋白质组学研究流程

转化或转换医学（Translational Medicine, Translational Research）是近2、3年来国际医学健康领域出现的新概念，其主要目的是为了打破基础医学与药物研发、临床医学之间固有的屏障，在其间建立起直接关联，从实验室到病床，把基础研究获得的知识、成果快速转化为临床上的治疗新方法。 转化医学最早由EA. Zerhouni提出的NIH路线图计划（NIH Roadmap），提出将医学生物学基础研究成果迅速有效的转化为可在临床应用的理论、技术、方法和药物的概念。因此，转化医学具有2个层面的涵义，其一是将基础研究的结果直接用于临床的应用，其二是实验室成果迅速产业化。因此转化医学具有双向、开放，提供新疗法、新药物，对疾病进程和特性提供反馈意见，以及“驱动临床研究引擎的激发器”等特点。

早在2005年，Julio E. Celis等就提出悬液芯片技术可作为“驱动发现”的乳腺癌转化型研究的标准技术。之后Bio-Plex悬液芯片技术广泛的用于转化医学的研究，这些研究主要聚焦在对不同样品，如疾病与对照等的各种炎性因子表达谱的分析，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和脂肪因子等，从而找到能预警疾病、表征疾病不同发展阶段和指导用药的生物标志分子或标志分子的特定组合。

最简单的例子是Gerd G Gauglitz等于2008年研究细胞因子是否能预测吸入式损伤的烧伤病人能否存活，其背景是在以往的案例中，吸入式损伤程度相同的病人采用同样的抢救措施，但有些病人能存活下来，而有些病人却不能存活。作者从炎症的角度出发，旨在寻找能预测存活的细胞因子。在一次火灾后，有28个伤员进入医院，经测定这些病人吸入式损伤程度相同或基本相同，在进入医院的24小时内对这些病人第一次采血，然后进行常规的抢救，经过3－5天，发现有15人存活，而另外13人却不能存活，这时对他们进行第二次采血，然后对这些血液样品同时测定17种细胞因子，结果发现在刚进入医院的24小时内，不能存活的13个病人其IL-4，IL-6，IL-7，IL-10和IL-13的血清水平比存活组高出很多，经过统计学分析，作者得到结论，如果吸入式损伤的烧伤病人在刚进入医院24小时内其IL-6，IL-7和IL-10的水平比正常水平高出很多，则说明这类病人很可能不能存活，除了常规的抢救措施之外，必需采取更紧急有效的措施进行抢救。

香港中文大学的Vincent Wai-Sun Wong于2009年研究了中国人群中肥胖的乙肝病人的脂肪炎性因子（adipokine）和乙肝病毒对肝损伤的相互关系。全世界有3.5亿乙肝病人，而且其中不少会发展为肝硬化和肝癌。疾病的发展与很多因素有关，包括病人自身情况、病毒方面的因素、生活方式、以及病毒的超感染等。同时肥胖和代谢综合症在发达国家和发展中国家流行，近期数据表明代谢因素也会影响慢性乙肝的自然发展，而且已有研究表明患有代谢综合症的慢性乙肝病人具有更高的肝硬化和肝纤维化的风险，为此，作者研究了乙肝病人中脂肪炎性因子对肝损伤的作用，也研究了病毒方面的因素是否会影响脂肪因子、胰岛素抵抗和肝硬化等。脂肪炎性因子（adipokine）是脂肪组织分泌一系列生物活性蛋白，包括瘦素（leptin）、脂联素（adiponectin）、抵抗素（resistin）、TNF-α、IL-6等，这些蛋白质影响胰岛素抵抗和炎性。作者选择了来自香港Prince of Wales医院的266个慢性乙肝病人，做组织切片，常规的临床检查，在实验室检测中则采用了Bio-Rad的糖尿病检测试剂盒检测这些样品的脂肪炎性因子。其中最主要的结果是BMI指数、腰围与血清中adiponectin负相关，大量的肝坏死与血清中升高的TNF-α和IL-6有关，而且这两种因子的高水平将促进肝癌发生，血液中的乙肝病毒量和病毒基因型与反常的TNF-α和IL-6水平无关，这说明脂肪炎性因子和乙肝病毒分别独立影响着肝损伤，最重要的是更高的HBV DNA将有更高的血清中adiponectin，这有助于减少脂肪肝，因此慢性乙肝病人由于adiponectin（脂联素）的升高而使代谢综合症的风险降低。这其实说明肥胖的乙肝病人中的脂联素与TNF-α和IL-6的水平存在一个平衡，一旦这个平衡被打破，如脂联素下降，则该肥胖病人将有更高的肝硬化和肝癌的风险。

悬液芯片技术在用药指导的研究方面，南方医科大学附属珠江医院的肾移植研究所的刘占国等在2008年研究了全血细胞因子表达谱评估免疫抑制剂对人免疫的效果，寻求在临床上灵敏而准确的测定方法以评估移植病人的免疫状态，医师可以根据检测结果决定使用何种免疫抑制剂以及剂量，以降低排异或感染的发生。研究者对3个20－30岁健康志愿者，抽血，血细胞96孔培养3-12小时，不同时间用不同试剂刺激，上清收集，-20℃保存用于分析。然后用Bio-Plex悬液芯片同时检测17种细胞因子。结果表明：1、每种免疫抑制剂具有独特的细胞因子谱标志，这有助于临床医师通过测定病人的细胞因子谱及时确定免疫抑制剂是否不足或过量；2、不同组合联合使用免疫抑制剂也具有独特的细胞因子谱；3、医师应该仔细而且快速的测定病人的细胞因子谱，以决定之后的免疫抑制剂的使用，从而减少排异或感染的发生；4、同步多重检测细胞因子对评估病人

的免疫状态是非常强大的工具，尤其是不同类型、不同剂量和不同组合都有各自的细胞因子谱标志，这有助于临床医师及时调整药物类型和剂量；5、该技术也可应用于癌症、自身免疫疾病、或对免疫抑制剂的过敏紊乱等。

除了上述的几个例子，悬液芯片技术在转化医学的其它各种疾病的研究都有广泛的应用，包括转移性黑色素瘤（Erika von Euw et al，2009），肾细胞癌的疫苗治疗（Christiane Geiger et al，2005）， 糖尿病的基因治疗（Susan L Samson et al，2008），风湿等等。综上所述，转化医学的最重大的背景是机体内分子和细胞水平的病变远远早于组织和器官的病变，而基于Bio-Plex悬液芯片技术的转化医学可以回答或者部份回答是否早期已经发生分子和细胞水平的病变，其结果也可以指导医师决定用药，实现个性化治疗。因此，Bio-Plex悬液芯片技术是从分子和细胞水平进行转化型研究的重要手段。

病人选择

测定细胞因子谱

常规临床检验

统计学分析

结论 Markers profile

用于临床预测、诊断、治疗等

病人选择

结论

个体化用药

药物作用

Bio-Plex平台转化医学研究的2种实验设计

2.2.3 Bio-Plex悬液芯片技术与病理和药理研究

悬液芯片技术在病理领域的应用是最早也是最广泛的，主要是从炎性和细胞信号转导的角度阐明各种疾病的治病机理，特别是各种病原体的致病机理，如呼吸道疾病、炭疽杆菌等等，对于其它的疾病如肿瘤、糖尿病、自身免疫疾病如风湿、关节炎、红斑狼疮（Marije I. Koenders et al, 2007, Fang Du et al, 2008）等等也都有大量的报道。Jason E. Comer等与2005年研究了体内炭疽毒素对T淋巴细胞活化的直接抑制，以阐明炭疽毒素的致病机理，在这之前已有科学家报道炭疽毒素对树突状细胞和巨噬细胞这两种抗原递呈细胞的抑制，但对T淋巴细胞还未有报道，但这对于炭疽毒素对机体免疫系统的作用机理却是至关重要的。作者采用小鼠模型，将致死毒素和水肿毒素两种炭疽毒素分别注射到小鼠身上，然后取出T淋巴细胞进行原代培养，在培养过程中用抗CD3抗体和抗CD28抗体对细胞进行刺激，模拟体内抗原递呈作用以活化T细胞，然后用Bio-Plex悬液芯片检测细胞培养液的18种细胞因子。结果显示，与对照组相比，打了致死毒素的样品几乎所有的细胞因子的水平大大下降，有的甚至降到背景值，打了水肿毒素的样品的细胞因子也有不同程度的下降，而且细胞继续培养到4天，绝大部分的细胞因子的水平仍不能回复到正常水平。这说明打了炭疽毒素之后，T淋巴细胞的活化受到直接的抑制，从而机体的免疫系统崩溃，为了进一步探索炭疽毒素直接抑制T细胞活化背后机制，以阐明免疫系统崩溃的原因，作者又用Bio-Plex悬液芯片技术同时检测了打两种炭疽毒素的T细胞的胞内多种

磷酸化蛋白，以探索炭疽毒素对T细胞内信号转导的影响，结果发现，与对照组相比，打了致死毒素的样品中的p-ERK、p-AKT、p-P38、p-GSK α/β、p-ATF-2等5种磷酸化蛋白的磷酸化水平大大下降，而打了水肿毒素的样品p-JNK的磷酸化水平也有一定程度的下降，从T淋巴细胞的信号转导途径上看，很多导向各种细胞因子如IL-2等的信号途径因炭疽毒素的作用而受到阻断，从而使信号不能传递给转录因子，从而引起各种细胞因子的表达大大降低。这就从细胞信号转导和转录水平阐明了炭疽毒素的致病机理，作者也说明这些结果能为炭疽毒素疫苗的开发提供参考。

实际上，对疾病致病机理的细胞生物学水平的研究有一般的研究思路：先是从炎症的研究开始，揭示疾病的免疫状况的变化，然后再进一步研究背后的细胞信号转导，也可以用悬液芯片技术同时检测多种磷酸化蛋白，这特别对于疾病背后未知的信号通路的变化研究尤其适合。Salomon Amar等在2007年研究肥胖的小鼠的免疫应答的变化，也是从细胞因子开始，最后由该实验室的Qingde Zhou等完成信号转导变化的研究。

2.3 Bio-Plex悬液芯片技术在核酸检测中的应用

悬液芯片技术最初的设计是专用于蛋白质的检测，因此在最初引入中国时，该技术尚被称之为“蛋白质液相芯片技术”；然而，在该技术的推出市场之后即被用于核酸的检测，2005年Luminex公司的Sherry A. Dunbar对该技术在核酸的诸多应用做了回顾，包括基因表达谱分析（gene expression profiling）、HLA的DNA分型以及病原体检测等方面，而且对核酸检测的实验设计作了说明，说明xMAP悬液芯片技术可进行同时快速而且高特异性的高通量核酸检测。

悬液芯片技术的核酸检测主要有直接DNA杂交、靶点特异性引物延伸技术（Target- Specific Prime Extension，TSPE，也简称TSE）、竞争性DNA杂交等，但主流技术是第一种，即直接杂交，也广泛的应用于病原体分析、HLA分型、Micro RNA等方面。详细如下表所示：

Luminex

从上表可以看出，直接杂交的应用最广泛，也是目前主流的技术，其优点是简便、成本很低等。其原理如下图所示。先由PCR特异性扩增目标DNA，其中一条引物需要生物素标记，扩增产物变性后与靶点/等位基因

特异性探针偶联的微球杂交，之后加入链亲和霉素藻红素（Strep-R- Phycoerythrin，简称SAPE或PE），最后用悬液芯片系统检测。

用于SNP分析的直接杂交探针设计原则主要有：

1、 核苷酸长度一般为18-24个，最好超过20个， 2、 针对每个靶点的探针的长度必须相同， 3、 针对每个靶点的探针必须是相同的链， 4、 在SNP中心，多重SNP要均匀展开，

5、 与微球偶联的探针必须有12碳的臂，以减少杂交时的空间位阻 6、 针对多重靶点的探针的解链温度必须相似。

如果不是用于SNP的检测，如基因表达谱、micro RNA、病原体分析等，则为：

1、 核苷酸长度为50-70个， 2、 必须是HPLC纯，

3、 多重靶点的探针必须有相似的溶解温度。

对于直接杂交的引物设计，主要有：

1、 复制子长度应该在100-300个碱基之间，这主要是考虑到兼顾PCR的特异性

和多重PCR的效率，太短则特异性差，太长则多重PCR很难做或做不出等。 2、 靶点长度越长，也容易成功，注意：杂交效率取决于序列和靶点的二级结

构，因此靶点越长，形成二级结构的概率越高，但只要避免形成二级结构，则特异性则越高。 3、 一条PCR引物必须是5’生物素标记，以便与SAPE结合并用于悬液芯片系统的检测。 4、 复制子的生物素标记链必须与偶联在微球上的探针互补。 5、

总之，正确的设计探针和引物对该技术的成功应用至关重要，因此，研究者必须对所要研究的序列进行充分的生物信息学分析，并仔细设计引物和探针。

基于悬液芯片技术的另一种实验设计是靶点特异性引物延伸技术（Target- Specific Prime Extension，TSPE，也简称TSE）。该技术最初有Tm Bioscience公司（现已被Luminex公司收购）发明，其原理是根据结核分支杆菌

（mycobacterium tuberculosis）的基因组DNA的GC含量较少，从中选取了100种仅含有TAC三种碱基的序列，并将其偶联到微球上，称为x-TAG微球。其原理如右图所示：

1、 靶点DNA与序列标记的等位基因特异性捕获引物结合并变性，

2、 靶点DNA和引物在含有DNA聚合酶、dNTPs（其中必须生物素标记）的反应体

系中退火， 3、 特异性引物延伸

4、 获得具有序列标记的ASPE产物，用于与x-TAG微球杂交。

这种技术的优点主要有：

1、 相同的探针长度：都是24个碱基， 2、 没有交叉杂交，

3、 同一杂交温度：37℃，

4、 仅含有3种碱基，没有G（留下用于生物素标记） 5、 与样品基因组DNA或PCR产物没有杂交， 6、 对PCR产物没有长度限制， 7、 无空间位阻

毫无疑问，无论采用哪种策略，基于微球的悬液芯片技术在核酸检测方面都存在多重PCR的问题，多重PCR技术已经成为该技术在核酸应用的最大的瓶颈，因此，市面上基于该技术的核酸芯片产品的价值附加主要在于生物信息学分析及其所设计的引物与探针，另一个价值附加就是多重PCR的条件。虽然第二种技术——等位基因特异性引物延伸在设计上比较巧妙，但所解决的仍然是微球编码识别和杂交的问题，其实这两个问题在直接杂交策略中只要仔细设计引物和探针都能基本得到解决；而x-TAG技术对样品的多重PCR不仅没有解决，而且还增加了一步特异性引物延伸，这大大延长了实验的时间和增加了实验的成本以及实验的复杂性，另一方面，虽然具有不限PCR产物长度的优点，但如果复制子很长，对多重PCR是非常大的挑战。

2.3.1 多重病原体分析

悬液芯片技术在多重病原体分析方面的应用主要在呼吸道疾病、手足口病和肠道致病菌的检测，其中比较主要的有美国CDC的Collette Fitzgerald等于2007年用该技术对沙门氏菌的血清分型进行分子检测，设计了引物和探针，使用直接杂交技术，同时检测美国最普遍的6种沙门氏菌血清型：B、C1、 C2、D、E和O13，另还加了一种副伤寒的血清型paratyphi A。结果在45分钟内检测的准确性和特异性达到94.3％（384个样本中鉴定出362个），说明Bio-Plex悬液芯片检测方法是一种容易使用、高通量的沙门氏菌血清分型的方法。据说目前这种方法正在推广。另有Monica K. Borucki等在2005年也使用了悬液芯片技术对李斯特菌的亚型进行基因组DNA的检测分析。在手足口病方面，Julie Perkins等在2007年，Benjamin J. Hindson等在2008年都用该技术对手足口病进行多重检测。

对呼吸道病原体检测和筛查是最近几年的热门课题，这主要因为2003年的SARS、H1N5禽流感和2009年的H1N1猪流感的全球流行。J.Mahony等在2007年用TSPE技术开发了同时检测20种呼吸道病毒，其中包括H5N1、SARS等等，并开发成产品。另有Wai-Ming Lee等在2007年为提高这种多重呼吸道病原体检测的特异性和灵敏度，在x-TAG技术的基础上，使用异胞嘧啶和异鸟嘌呤配对的特点，开发了同时检测8种呼吸道病原体的技术，其原理如右图所示。结果其灵敏度高达20个cDNA拷贝。

Bio-Plex检测

2.3.2 SNP分析

2006年Eric P等用x-TAG技术对恶性疟原虫的耐药性进行SNP分析；2007年新加坡国立大学的Seok Hwee Koo1对ATP结合盒转运蛋白（ABC Transportor）的SNP进行分析，ABC转运蛋白的多态性与化疗后病人对药物的耐药行密切相关，对22个突变点进行了分析，一共使用了44种编码的微球，其多重PCR的解决采用分组进行，22个突变点分成4组，2组4个，另2组6个，分别做多重PCR，然后混合，在用Bio-Plex悬液芯片进行检测。

2.3.3 HLA DNA分型

悬液芯片技术在HLA DNA分型的应用比较成熟，现在已经用于各个血站的HLA分型检测。较早的报道是日本的Yoshiki Itoh等在2005年对日本人群中人白血病抗原（HLA）-A,-B,-C,和-DRB1进行分型。采用直接杂交策略，结果对HLA-A的准确度达到85.91％，HLA-B为85.03％，HLA-C为97.32％，HLA-DRB1为90.67%。

2.3.4 micro RNA研究

Micro RNA研究是最近几年的热门课题，早在2005年Jun Lu等在《Nature》杂志上就已报道悬液芯片技术用于Micro RNA表达谱分析以对肿瘤进行分类，其采用的策略是直接杂交，如右图所示。其研究背景是目前尚没有能够将弱分化的肿瘤细胞从正常细胞中区分出来的技术，而micro RNA是内源性非编码的约含22个碱基的小片段RNA，其主要作用是抑制目标mRNA的翻译。作者使用直接杂交技术，基于悬液芯片技术研究miRNA表达谱的诊断人癌症的潜力。从334个样品，其中包含各种人癌症，从中分析了217种哺乳动物的miRNA，结果发现miRNA的表达谱

的结果含有多种信息，这些信息反映了肿瘤的发展和分化的状态。作者还考察了miRNA在肿瘤中的调节，并于正常组织进行对比，结果使用miRNA表达谱能成功的分类那些弱分化的肿瘤，而在相同的样品中mRNA的表达谱的结果却高度不准确，因此作者认为这些发现说明miRNA表达谱能用于癌症的诊断。

本文作者：沈志扬，伯乐公司（Bio-Rad Laboratories）产品经理

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