家鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(COⅢ)基因的克隆及序列分析

维普资讯 http://www.cqvip.com 中国生物工程杂志Ｃｈｉｎａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（３）：５４～５９　家鸭细胞色素Ｃ氧化　酶Ⅲ（ＣＯ　Ｉｌ１）基因的克隆　及序列分析　张娟　张利平ｈ宗　卉２　吴建平　朱建勇　杨联　孙永峰　（１甘肃农业大学动物科学技术学院兰州７３００７０　２深圳检验检疫局深圳５１８００ｏ）　摘要线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器，是细胞进行氧化磷酸　化的场所。不同脊椎动物同源基因序列的比较显示，细胞色素ｂ（Ｃｙｔｂ）、细胞色素Ｃ氧化酶Ｉ　（ＣＯ　Ｉ）、细胞色素Ｃ氧化酶Ⅱ（ＣＯ　ＩＩ）、细胞色素Ｃ氧化酶Ⅲ（ＣＯ１１Ｉ）基因最保守，同源性最高，　ＡＴＰａｓｅ６、ＡＴＰａｓｅ８基因、ＮＤ基因变异比较大。以家鸭（Ａｒｉａｓｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ）肝脏的线粒体ＤＮＡ为　模板，按照ＧｅｎＢａｎｋ已经公布的潜鸭族（ＡＦ０９０３３７）的全序列及其绿头鸭的ｍｔＤＮＡ部分序列　（Ｌ２２４７６、Ｌ１６７７０、［２２４７７）设计合成特异引物进行ＰＣＲ扩增，克隆并测定了线粒体细胞色素Ｃ氧　化酶Ⅲ亚基（ＣＯＩｌＩ）的全序列７８４ｂｐ以及ＡＴＰａｓｅ６基因的３　端和ｔＲＮＡ—Ｇｌｙ基因的５　端序列共　９３４ｂｐ。用ＤＮＡＳｔａｒ分析软件对家鸭与ＧｅｎＢａｎｋ中７种禽类的ＣＯ１１Ｉ序列进行比较分析，显示家鸭　与这些动物的ＣＯ１１Ｉ基因具有较高的同源性，与同科潜鸭属中的Ａｙｔｈｙａ口　ｎⅡ的相似性最高为　９０．６％，与同目不同科的加拿大雁、小天鹅、白额雁的相似性分别为８９％、８８．６％、８８．６％。根据　家鸭与其他７种禽类的ＣＯ１１Ｉ基因序列相似性所建立的进化树，与传统的分类地位基本吻合。　关键词家鸭细胞色素Ｃ氧化酶Ⅲ（ＣＯ１１Ｉ）　同源性　系统学　Ｑ７８５　实验拟用分子生物学方法对家鸭ＣＯ　１９基因进行研究，　通过ＰＣＲ扩增，克隆测序得到线粒体细胞色素氧化酶　Ⅲ（ＣＯ１９）基因的全序列及其ＡＴＰａｓｅ６和ｔＲＮＡ—Ｇｌｙ基　中图分类号线粒体是共价闭合的双链ＤＮＡ，是生物有氧呼吸　的主要场所。线粒体基因组结构简单，发生变异的几　率相对稳定，被广泛用于系统的起源、进化和亲缘关系　的研究¨　Ｊ。动物线粒体基因组（ｍｔＤＮＡ）中含有细　因的部分序列。目的是对家鸭的ＣＯⅢ基因进行全面　的认识，为进一步研究线粒体ＤＮＡ在分子遗传学和发　育生物学中的作用提供理论依据。　胞色素氧化酶３个亚基单位（ｅｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｉ，Ⅱ，Ⅲ，缩写ＣＯ　Ｉ，ＣＯ　ｌＩ，ＣＯⅢ）、Ｃｙｔｂ、ＡＴＰａｓｅ６、　ＡＴＰａｓｅ８等１３个蛋白质基因，都是线粒体内膜呼吸链　的重要组分【４。，其中ｃＯ　Ｉ，ｃＯⅡ，ｃＯⅢ最保守，同源性　达８０％左右，对其序列进行克隆和分析是研究远缘物　种分子系统演化和分类的有效基因之一【　，６ｌ。　ｌ材料和方法　１．１实验材料　实验家鸭购自兰州禽类市场和深圳禽类市场各３　只（家鸭系雁形目鸭亚科河鸭族河鸭属的绿头鸭），Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｓ，ｈＩ、ＳａｌＩ、ＲＮａｓｅ、Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２０００为　１９８１年Ａｎｄｅｒｓｏｎ等…测定了人线粒体基因组的　全序列，到目前为止已有多种动物的线粒体基因组全　序列被测定出来　Ｊ。家鸭是由绿头鸭和斑嘴鸭驯化　而来¨ｕＪ其ＣＯⅢ序列至今在国内外未见相关报道，本　ＴａＫａＲａ公司产品，ＤＮＡ快速纯化回收试剂盒、ｘ—ｇａＪ、　ＩＰＴＧ等主要试剂均购自北京拜尔迪生物技术有限公　司，Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、ｐＧＥＭＯ＿Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产　收稿日期：２００６－ｌ１－２０修回日期：２００７－０１－１０　｝通讯作者，电子信箱：ｚｈａｎｇｌｉｐｉｎｇ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃａ　品，菌株Ｅ　ｃｏｌｉ．ＪＭ１０９由中国农业科学院兰州兽医研　究所刘爱红博士提供。　维普资讯 http://www.cqvip.com 张娟等：家鸭细胞色素ｃ氧化酶Ⅲ（ｃＯⅢ）基因的克隆段序列分析　５５　１．２家鸭线粒体ＤＮＡ的制备　活体解剖，取肝脏组织２ｇ．采用一种改进的碱变性　产物与质粒ｐＧＥＭ。一Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ连接，然后转化大肠杆菌　ＪＭ１０９，蓝白斑筛选后经菌落ＰＣＲ及酶切搽定，最后选　取两个阳性的重组子送上海博亚生物技术有限公司测　序，测序仪为ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７掣：　１．５序列分析　法提取线粒体ＤＮＡ¨‘１：　１．３引物设计与ＰＣＲ扩增　根据ＧｅｎＢａｎｋ已经公布的潜鸭旗（ＡＦ０９０３３７）的　全序列及其绿头鸭的ｍｔＤＮＡ部分序列（Ｌ２２４７６、　Ｌ１６７７０、１／２４７７），利用ＣＩ　ＵＳＴＡＩ　ｗ１．８３软件Ⅲ　和　ＢＬＡＳＴ软件　”Ｊ进行序列比较，再用　ｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５　０＿＿　设计用于扩增细胞色素Ｃ氧化酶Ⅲ基因的特异　ＤＮＡ序列采用ＣＩｕｓｔａ］ｘ软件进行比对，并将家鸭　ＣＯⅢ与其他７种禽类的ＣＯｍ进行核苷鳆序列午＂氨基　酸序列的同源性比较。利用Ｄｎａ．ｓｔａｒ戟件ｉｌ算遗传距　离及其构建分子系统树。　性引物即ｈ游特异引物（２４ｂｐ）：５　一ＣＣＡＧＡ　Ｐ】（２２ｂｐ）：５。一　ＧＣＣＡＴＣＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＣＣＡ－３　；下游特异引物Ｐ２　２结果与分析　２．１　ＰＣＲ、菌落ＰＣＲ、酶切鉴定　ＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＡ－３　，由北　京奥科生物工程公司合成：　ＰＣＲ扩增的反应体系：ＤＮＡ摸板】　．ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　（含Ｍｇ“２０　ｅｒｏｏｌｔ／１　）２．５　【，ｄＮＴＰ（２．５　ｎｌｍｏＩＪＬ）２，０　，利用设计的引物Ｐ１和Ｐ２扩增目的ＤＮＡ，获得约　９３４ｂｐ的ＤＮＡ片段（图１），与预期扩增的片段长度相　符。　上下游引物（１０ｐｍｏｌ／１．ｄ）各１ｔｔ１．ＴａｑＤＮＡ聚合酶　ＰＣＲ扩增的反应条件：９４℃预变性５ｒ．ｉｎ，９４＋Ｕ堂性　以Ｐ１和Ｐ２为特异引物，从琼脂糖平板上的菌落　中选取单克隆菌落１、２进行菌落ＰＣＲ　结果表明菌落　１、２中均有目的片段插入。（图２）　提取重组质粒ＤＮＡ，崩却　Ｉ和Ｓａｔｌ进行双酶切鉴　定，表明在ｐＧＥＭ０一Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ巾已成功插人目的片段　（网３）。　（２Ｕ／ｔｘ１）０．５　，加水补足２５　。　１ａｉｒｎ，６０ｔ退火Ｉａｉｒｎ，７２℃延伸８０ｓ．３５个循环，最后　７２℃延伸１０ｒａｉｎ　１．４　目的基因克隆与测序　回收ＰＣＲ产物后　在　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ作用下使回收　ｂＰ　・　ｌ　ｌＥＸ　￣．１２９３４　钿　图２阳性克隆的菌体ＰＣＲ鉴定　Ｍ：Ｉ）ＮＡ　Ｍａｒｋｅｒｓ；１、２：　悱　拒峰帅ＰＣＲＩ　物　图３重组质粒的ＤＮＡ酶切鉴定　Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅ￣：１：　Ｒ　增临　图１　ＰＣＲ产物电泳图　Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅ￣；Ｉ：扩增片段　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ＣＯＩＩＩ　ＰＣＲ　ｐｒ０ｄｕｎｓ　Ｆｉｇ．２　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｂｙ　ＰＣＲ　Ｆｉｇ．３　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　维普资讯 http://www.cqvip.com ５６　２．２测序与序列分析　中国生物工程杂志Ｃｈｉｎａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖ０ｌ＿２７　Ｎｏ．３　２００７　码子（Ｔ）以及３　端下游的ＡＴＰａｓｅ６基因和５　端上游的　序列分析表明，　２．２．１　家鸭ＣＯｍ基因的序列分析ｔＲＮＡ—Ｇｌｙ基因。家鸭线粒体ＣＯ　ｍ具体的氨基酸序列　见图４。克隆的基因序列登录号为ＤＱ６５５７０６。　所克隆的片段长为９３４ｂｐ，其中包括ＣＯ　ｍ基因全长　７８４ｂｐ，含一个起始密码子（ＡＴＧ）和一个不完全终止密　１　ａｔｇｇｃａｃａｃｃａａｇｃａｃａｃｔｃｃｔａｃｃａｃａｔａｇｔｃｇａｃｃｃｃａｇｃｃｃｃｔｇａｃｃａａｔｃｔｔｔｇｇａ　１　Ｈ　ｎ　Ｈ　ｑ　ｎ　Ｈ　Ｓ　Ｖ　Ｈ　Ｈ　Ｕ　Ｄ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　¨Ｐ　Ｉ　Ｆ　Ｂ　６１　２１　１２１　ＪＩ１　１８１　６１　２ＪＩ１　８１　３口１　１口１　３６１　１２１　ＪＩ２１　１　ＪＩ１　ｌ　１　１６１　ＳＪＩ１　１８１　６０１　２０１　６６１　２２１　７２１　２４１　７８１　２６１　ｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｔａｃｔｃａｃａａｃｃｔｃａｇｇｇｃｔａｇｔｃａｔｇｔｇａｔｔｃｃａｃｔａｃａａｃｔｃａｔｃｔ　ｎ　ｎ　ｎ　ｎ　Ｌ　Ｌ　Ｔ　Ｔ　Ｓ　Ｇ　Ｌ　Ｕ　Ｈ　¨　Ｆ　Ｈ　Ｖ　Ｈ　Ｓ　Ｓ　ａｔｃｃｔｇｃｔａｇｃｃｇｃｃｇｇｃｃｔｃｔｔａｔｃａａｔｇｃｔｃｃｔａｇｔｇａｔａｃｔｃｃａａｔｇａｔｇａｃｇｇｇａｃ　Ｉ　Ｌ　Ｌ　ｎ　ｎ　Ｂ　Ｌ　Ｌ　Ｓ　Ｈ　Ｌ　Ｌ　Ｕ　Ｈ　Ｌ　ｑ　¨　¨　Ｒ　Ｄ　ａｔｔｇｔｃｃｇａｇａｇａｇｃａｃｃｔｔｃｃａａｇｇｃｃａｃｃａｃａｃａｃｃｔａｃａｇｔｃｃａａａａａｇｇｃｃｔａｃｇａ　Ｉ　Ｕ　Ｒ　Ｅ　Ｓ　Ｔ　Ｆ　ｑ　Ｂ　Ｈ　Ｈ　Ｔ　Ｐ　Ｔ　Ｕ　ｑ　Ｋ　Ｂ　Ｌ　Ｒ　ｔａｃｇｇｃａｔａａｔｃｃｔｃｔｔｃａｔｃａｃａｔｃｃｇａａｇｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔａｇｇａｔｔｔｔｔｃｔｇｇｇｃａ　Ｖ　Ｂ　Ｈ　Ｉ　Ｌ　Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｓ　Ｅ　ｎ　Ｆ　Ｆ　Ｆ　Ｌ　Ｂ　Ｆ　Ｆ　¨　ｎ　ｔｔｃｔｔｃｃａｃｔｃａａｇｃｃｔａｇｔａｃｃａａｃｃｃｃｃｇａａｃｔａｇｇｃｇｇｃｃａａｔｇａｃｃｃｃｃａｇｃｇｇｇｃ　Ｆ　Ｆ　Ｈ　Ｓ　Ｓ　Ｌ　Ｕ　Ｐ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　Ｌ　Ｂ　Ｂ　ｑ　¨Ｐ　Ｐ　ｎ　Ｂ　ａｔｃａａａｃｃｇｃｔｃａａｃｃｃｃａｔａｇａａｇｔｃｃｃｇｃｔａｃｔａａａｃａｃａｇｃｃａｔｃｃｔｃｃｔａｇｃｃｔｃａ　Ｉ　Ｋ　Ｐ　Ｌ　Ｈ　Ｐ　Ｈ　Ｅ　Ｕ　Ｐ　Ｌ　Ｌ　Ｈ　Ｔ　ｎ　Ｉ　Ｌ　Ｌ　ｎ　Ｓ　ｇｇｃｇｔａａｃｔｇｔｃａｃａｔｇａｇｃｃｃａｃｃａｃａｇｃａｔｃａｃａｇａａｇｇａａａｃｃｇａａａａｃａｔｇｃｃａｔｃ　Ｂ　Ｕ　Ｔ　Ｕ　Ｔ　¨　ｎ　Ｈ　Ｈ　Ｓ　Ｉ　Ｔ　Ｅ　Ｂ　Ｈ　Ｒ　Ｋ　Ｈ　ｎ　Ｉ　ｃａｃｇｃｃｃｔａａｃａｔｔｇａｃｇａｔｔｃｔｃｃｔａｇｇａｔｔｃｔａｃｔｔｃａｃｃｇｃｃｃｔａｃａａｇｃａａｔａｇａｇ　Ｈ　ｎ　Ｌ　Ｔ　Ｌ　Ｔ　Ｉ　Ｌ　Ｌ　Ｂ　Ｆ　Ｖ　Ｆ　Ｔ　ｎ　Ｌ　ｑ　ｎ　Ｈ　Ｅ　ｔａｃｃａｔｇａａｇｃｃｃｃａｔｔｃｔｃａａｔｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｃｔａｃｇｇｃｔｃｃａｃｔｔｔｃｔｔｔｇｔｔｇｃｃ　Ｖ　Ｈ　Ｅ　ｎ　Ｐ　Ｆ　Ｓ　Ｉ　ｎ　Ｄ　Ｓ　Ｕ　Ｖ　Ｂ　Ｓ　Ｔ　Ｆ　Ｆ　Ｕ　ｎ　ａｃｃｇｇａｔｔｃｃａｃｇｇａｃｔｃｃａｃｇｔｇａｔｃａｔｃｇｇａｔｃｃａｃｃｔｔｃｃｔａａｃｃｇｔｃｔｇｃｃｔｃｃｔｃ　Ｔ　Ｂ　Ｆ　Ｈ　Ｂ　Ｌ　Ｈ　Ｕ　Ｉ　Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ｔ　Ｆ　Ｌ　Ｔ　Ｕ　Ｃ　Ｌ　Ｌ　ｃｇａｃｔａａｔｃａａａｔｔｃｃａｃｔｔｃａｃａｔｃａｇａｃｃａｃｃａｃｔｔｃｇｇａｔｔｔｇａａｇｃｃｇｃａｇｃｃｔｇａ　Ｒ　Ｌ　Ｉ　Ｋ　Ｆ　Ｈ　Ｆ　Ｔ　Ｓ　Ｄ　Ｈ　Ｈ　Ｆ　Ｂ　Ｆ　Ｅ　ｎ　ｎ　ｎ　¨　ｔａｃｔｇａｃａｃｔｔｃｇｔａｇａｃｇｔｔａｔｃｔｇａｃｔａｔｔｃｃｔｃｔａｔａｔａａｃｃａｔｃｔａｃｔｇａｔｇａｇｇａ　Ｖ　¨　Ｈ　Ｆ　Ｕ　Ｄ　Ｕ　Ｉ　¨Ｌ　Ｆ　Ｌ　Ｖ　１４　Ｔ　Ｉ　Ｖ　¨　¨　Ｂ　ｔｏｔｔ　Ｓ　图４家鸭线粒体ＤＮＡ　ｃｏｒｎ基因核苷酸全序列和推测的氨基酸序列　Ｆｉｇ．４　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｄｕｃｋ　ｍｔＤＮＡ　ｃｏｒｎ　ｇｅｎｅ　维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７，２７（３）　张娟等：家鸭细胞色素ｃ氧化酶Ⅲ（ＣＯＩＩＩ）基因的克隆及序列分析　表１家鸭与其他７种禽类ＣＯＵｌ序列及推测的氨基酸序列同源性比较　Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ（％）ａｍｏｎｇ　ＣＯｌｌｆ　ｆｒｏｍ　ｐｏｒｄｔｒｙ　ｍｔＤＮＡ　５７　２．２．２家鸭线粒体ＣＯ１９与７种禽类ＣＯ１９的核苷酸序　列和氨基酸序列比较　由表１可见家鸭线粒体ＣＯ１９　３讨论　基因的序列及其推导的氨基酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库　已发表的２个目的７种禽类的ＣＯ１９核苷酸和氨基酸序　列比较，结果显示具有良好的序列相似性。与同目同　科潜鸭的核苷酸序列相似性为９０．６％；与同目不同科　的加拿大雁、小天鹅、白额雁的核苷酸序列相似性分别　为８９％、８８．６％、８８．６％；与同纲不同目的鸡、火鸡、鹌　本实验以家鸭为材料，通过提取ｍｔＤＮＡ克隆了家　鸭ｍｔＤＮＡ部分片段，测序结果表明该片段包括　ＡＴＰａｓｅ６基因３　端部分序列（１－１０２）、ＣＯｍ基因全序列　（１０２—８８５）及ｔＲＮＡ—Ｃｌｙ基因５　端部分序列（８８６—　９３４）共９３４ｂｐ。序列分析表明：ＡＴＰａｓｅ６的终止子ＴＡＡ　与ＣＯｍ的ＡＴＧ的Ａ相重叠，终止密码子为不完全终　止子，仅有一个Ｔ，与ｔＲＮＡ—Ｃｌｙ共用一个Ａ。家鸭ＣＯ　Ⅲ基因的核苷酸组成中Ａ＋Ｔ的含量为４８．５３％，与其　鹑的序列相似性分别为８４．６％、８２．５％、８３．８％。　氨基酸序列的同源性也显示相似的结果：与潜鸭　的同源性最高为９７．７％；与加拿大雁、小天鹅、白额雁　的同源性都为９５．８％；与鸡、火鸡、鹌鹑的同源性分别　为９１．３％、９３．２％、９１．７％。　他７种禽类Ａ＋Ｔ的含量相近，但低于无脊椎动物蓖麻　蚕（Ａ＋Ｔ　７１．９９％）；不少研究者支持线粒体基因的Ａ　＋Ｔ有明显的进化趋势，即从低等类群到高等类群Ａ＋　Ｔ含量依次递增，且认为高Ａ＋Ｔ增加了密码子第三位　２．２．３　以ＣＯⅢ基因为基础的分子系统进化树的构建　从同源性分析结果可以看出，动物的线粒体ＤＮＡ　ＣＯ　Ⅲ基因是相对保守的，因此可以利用他们之间的同源　性差异进行分子进化方面的分析，依据Ｄｎａｓｔａｒ软件中　点ＡＴ颠换的可能性Ｌｌ　，但从本试验的分析结果来看　支持Ｃｒｏｚｉｅｒ　Ｒ　Ｈ和Ｃｒｏｚｉｅｒ　Ｙ　Ｃｔｌ６ｊ的观点：高Ａ＋Ｔ与　氨基酸序列的变异没有显著的相关性。　目前，依据基因序列构建的分子系统进化树进行　分子系统演化研究较多，构建分子系统树所依据的基　的Ｃｌｕｓｔａｌ　ｍｅｔｈｏｄ方法，绘制线粒体ＤＮＡ　ＣＯｍ基因的　分子进化树图（５、６），图５是基于线粒体ＤＮＡ　ＣＯ１９核　苷酸序列同源性的８种禽类的分子系统树，图６是基于　因不同，结果往往受到很大的影响。Ｍｉｙａ　Ｍ等（２０００）　对ｍｔＤＮＡ上的基因序列作为分子系统分类的依据进行　研究，分为五级，最好：ＮＤ５、ＮＩＭ、ＣＯｍ、ｃｏ　Ｉ，好：ｃｏ　线粒体ＤＮＡ　ＣＯｍ编码氨基酸序列同源性的８种禽类　的分子系统树。　根据线粒体ＤＮＡ　ＣＯ　ｍ的结构构建的分子系统树，　与从形态学角度进行的系统分类的比较来看，结果基　１ｉ、ｃ　，中等：ＮＤ３、ＮＤ２，较差：ＮＤ１、ＡＴＰａｓｅ６，很差：　ＮＩＭＬ、ＮＩ）６、ＡＴＰａｓｅ８。而Ｚａｒｄｏｙａ等【　Ｊ则分为三级，　好：ＮＩＭ、ＮＤ５、ＮＤ２、ｃｙｔｈ和ＣＯ　Ｉ。中等：ＣＯ　１１、ＣＯ　９、１　ＮＤ１和ＮＤ６，差：ＡＴＰａｓｅ６、ＮＤ３、ＡＴＰａｓｅ８和ＮＩＭＬ。两　本吻合。８种禽类的分子系统进化树中，白额雁与加拿　大雁距离最近，潜鸭与家鸭聚为一小类，小天鹅与白额　雁、加拿大雁关系比较密切，这五种聚为一个类别。这　与形态学所进行的分类完全一致，前三个为雁族中不　同的属，后两个虽不属于同一个属，但这五个均属于雁　形目。火鸡、鸡、鹌鹑同属于鸡形目与前五个的遗传距　离越来越大。这与形态学分类相似。　位学者对线粒体ＤＮＡ　ＣＯｍ基因作为分子分类的依据　优劣评价不同，可能与所研究的物种不同有关系　Ｊ。　从本试验依据线粒体ＤＮＡ　ＣＯ　９基因构建的分子　１系统树分析的结果看，不论是基于线粒体ＤＮＡ　ＣＯ１９核　苷酸序列同源性的８种禽类的分子系统树，还是基于　维普资讯 http://www.cqvip.com ５８　中国生物工程杂志Ｃｈｉｎａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖ０１．２７　Ｎｏ．３　２００７　氨基酸构建的分子系统树，家鸭与同科的潜鸭亲缘关　系最近，５种雁形目的禽类基本聚为一类，这与传统的　形态分类结果基本吻合。所以从本试验的分析结果来　看，根据线粒体ＤＮＡ　ＣＯ１１Ｉ基因的数据结果构建的分子　系统树基本上可反映这一组物种的亲缘关系规律。同　时也支持Ｍｉｙａ　Ｍ等（２ｏｏｏ）研究认为线粒体ＤＮＡ　ＣＯ１１Ｉ　的基因序列作为分子系统分类的依据效果最好的　结论。　Ｂｒａｎｔｓｅａｎａｄｅｎｓｉｓ　Ｃｙｇｎｕｓ　ｅｏｌｕｍｂｉａｎｕｓ　Ａｎｓｅｆａｌｂｉｆｒｏｏｓ　Ａｒｉａｓｐｆａ妒而ｙ玎ｃ　∞　Ａｙｔｈｙａａｍｅｒｉｃａｎａ　ＡｌｅｅｔｕｒａＩｓｔｈａｍｉ　Ｇ　Ｕ８厶ａｎｋｉｖａ　Ｃｏｔｕｍ　ｃｈＩｎｅＢ８ｉｓ　ｌ６．７　ｌ６　ｌ４　ｌ２　ｌ０　８　６　４　２　０　图５基于线粒体ＤＮＡ　ＣＯｒｎ基因核苷酸序列的８种禽类的系统进化树　（８种禽类的中文名见表１）　Ｆｉｇ　５　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＣＯｒｎ　ｎｕｄｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ８　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｐｏｕｌｔｒｙ　Ａｎａｓ曲々　而　ｃ＾∞　Ａｙｔｈｙａａｍｅｒｉｃａｎａ　Ｂｒａｎｔｓｅａｎａｄｅｎｓ西　ＡＯＳｅＥａｌｂｉｆｒｏｎｓ　Ｃｙｇａｕｓ　ｃｏｌｕｍｂｉａｎｕｓ　Ａｌｅｃｔｕｒａ　ｔｈａｍｉ　ｃａｌｌｕｓｂａｎｋｉｖａ　Ｃｏｔｕｍ矗ｃｂｉｎｅｎｓ￣　４　２　０　图６基于线粒体ＤＮＡ　ＣＯｒｎ基因编码氨基酸序列的８种禽类的系统进化树　（８种禽类的中文名见表１）　Ｆｉｇ　６　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＣＯｒｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ８　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｐｏｕｌｔｒｙ　参考文献　［１］Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｓ，Ｂａｎｋｅｒ　Ａ　Ｔ。Ｂａｒｒｅｌｌ　Ｂ　Ｇ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉＭ　ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ，　氧化酶亚基ＩＩＩ的序列及其分子进化分析．昆虫学报，２００２。　４５（２）：１９３—１９７　ｗｌｅｉ　ｚ　Ｊ，Ｚｈａｏ　Ｑ　Ｌ，Ｚｈａｎｇ　ＺＨ　Ｆ，ｅｔ　１．Ａｅｔａ　Ｅｎｔａｏｍｏｌｇｉｏｃａ　Ｓｉｎｉｃａ　４５（２）：１９３—１９７　１９８１，２９０（５８０６）：４５７—４６５　［６］Ｃａｒｅｓ　Ｒ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｌａ　ＤＮＡ：ｇｅｎｅ　ｏｒｇａｎｉａｔｚｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９８，　［２］Ｎｉｓｈｉｂｏｒｉ　Ｍ，Ｓｈｉｍｏｇｉｒｉ，Ｈａｙａｓｈｉ　Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　盯ｍ　ｍｒ／ｕｓ．Ａｎｉｍａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．　ｌ１８（４）：６４９—６６３　～　２００５，３６（５）：３６７—３７５　［７］Ｋｕｍａｚａｗａ　Ｙ．Ｏｔａ　Ｈ．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｓｎａｋｅ（Ｄ／ｎｏｄｏｎｓｅｍ／ｃａｒ／ｎａｔｓ）ｍｉｕｔｏｃｈｏｎｄｒｉｌａ　ｇｅｎｏｍｅ　ｗｉｈ　ｔｔｗｏ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９８，１５０（１）：３１３—３２９　［３］Ｍｅｙｅｒ　Ａ．ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　Ｆｉｓｈ．Ｉｎ：ｅｎｅＧｉｔｃｓ　ｎｄ　ｅｖｏｌａｕｔｉｏｎ　ｏｆａｑｕａｔｉｃ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎａｎｄ　Ｈａｌｌ，　２１９—２４９　［８］Ｌｅｅ　Ｗ　Ｊ，Ｋｏｃｈｅｒ　Ｔ　Ｄ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｓｅａ　ｌａｍｐｅｙ　（Ｐｅｔｒｏｍｙｍｎ　ｍａｒ／ｎｕｓ）　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｌａ　ｇｅｎｏｍｅ：ｅａｒｌｙ　ｓｔｅａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅ　ｖｅｒｔｔｅｂｒａｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｒｇａｎｉａｔｚｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　［４］Ｂｒｏｗｎ　Ｗ　Ｍ．Ｅｖｏｌｕｉｔｏｎ　ｏｆ　ｎｉａｍａｌ　ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉＭ　ＤＮＡ．Ｉｎ：Ｎｅｉ．　Ｍ．ａｎｄ　Ｒ．Ｋ．Ｋｃｅｈｎｄ（ｅｄｓ）．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｔｉｏｎ　Ｉｎｅ　Ｐｒｅｓｓ，１９８３．６２—６８　１９９５，１３９（２）：８７３—８８７　［５］魏兆军，赵巧玲，张志芳，等．蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素　［９］Ｗｏｌｓｔｅｎｈｏｌｍｅ　Ｄ　Ｒ．Ａｎｉｍａｌ　ｍｌｕｃｈｏｎｄｒｔｉａｌ　ＤＮＡ：ｓｔｕｃｔｒｕｒｅ　ａｎｄ　维普资讯 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２００７，２７（３）　张娟等：家鸭细胞色素ｃ氧化酶Ⅲ（ｃｏｒｎ）基因的克隆及序列分析　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，２１５：４０３—４１０　５９　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎｔ　Ｒｅｖ　Ｃｙｔｏｌ，１９９２，１４１：１７３～２１６　［１０］郑作新，张荫荪，唐詹珠，等．中国动物志鸟纲第二卷雁　形目．北京：科学出版社，１９７９．７３～７４　Ｚｈｅｎｇ　Ｚ　Ｘ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ　Ｓ，Ｔａｎｇ　Ｚ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｆａｕｎａ　Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　Ａｅａｄｅｍｉａ　Ｓｉｎｉｃａ．ＡＶＥＳ　Ｖｏ１．２：Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ．　［１４］Ｓｉｎｇｈ　Ｖ　Ｋ，Ｍａｎｇａｌａｍ　Ａ　Ｋ，Ｄｗｉｖｅｄｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ：　ｐｍｇＴａｍ　ｆｏｒ　ｄｅｓｉｎ　ｏｆｇ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９８，２４：３１８～３１９　［１５］Ｆｏｈｎｅｒ　０，Ｂｌａｃｋ　Ｍ，Ｈｏｅｈ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ａｍｐｌｉｉｃａｔｆｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｅｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｉｆｏｍ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｍｅｔｒａｚｏａｒｔ　ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｍｏｌ　Ｍａｒ　Ｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ．１９７９．７３—７４　［１１］王文，施立明．一种改进的动物线粒体ＤＮＡ提取方法．动　物学研究，１９９３，１４（２）：１９７—１９８　ＷａｎｇＷ，ＳｈｉＬＭ．ＺｏｏｌｏｇｉｃａＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，１４（２）：１９７—１９８　１９９４，３（５）：２９４～２９９　［１６］Ｃｒｏｚｉｅｒ　Ｒ　Ｈ，Ｃｒｏｚｉｅｒ　Ｙ　Ｃ．Ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｌａ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｎｅｙｂｅｅ却　ｍｅｌｌ￣ｒｅｒａ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９３，１３３（１）：９７～１１７　［１２］Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｊ　Ｄ，Ｈｉｇｇｉｎｓ　Ｄ　Ｇ，Ｇｉｂｓｏｎ　Ｔ　Ｊ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｍｕｌｉｔｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｉｔｏｎｓ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｇａｐ　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｗｅｉｈｔｇ　ｍａｔｒｉｘ　ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９４．２２：４６７３～４６８０　［１７］Ｚａｒｄｏｙａ　Ｒ，Ｍｅｙｅｒ　Ａ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｌａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　－ｃｏｄｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ａｍｏｎｇ　［１３］Ａｈｓｃｈｕｌ　Ｓ　Ｆ，Ｇｉｓｈ　Ｗ．Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｎｍｅｎｔｇ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏ１．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｅｖｏｌ，１９９６，１３（７）：９３３～９４２　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏ　ｍ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｄｕｃｋ　ＺＨＡＮＧ　Ｊｕａｎ‘ＺＨＡＮＧ　Ｌｉ—ｐｉｎｇ‘ＺＯＮＧ　Ｈｕｉ　ＷＵ　Ｊｉａｎ—ｐｉｎｇ‘ＺＨＵ　Ｊｉａｎ—ｙｏｎｇ　ＹＡＮＧ　Ｌｉａｎ‘ＳＵＮ　Ｙｏｎｇ—ｆｅｎｇ‘　（１　Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ　Ｆａｃｕｌｔｙ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）　（２　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５１８０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｏｒｇａｎｅｌｌｅ　ｉｎ　ｍｏｓｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｃｙｔｅ．Ｉｔ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｐｌａｃｅ　ｏｆ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ　（Ｃｙｔｂ）、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　Ｉ（ＣＯ　Ｉ）、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ＩＩ（ＣＯＩＩ）ａｎｄ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ＩＩＩ（ＣＯＩＩＩ）ａｒｅ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ．Ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＴＰａｓｅ６、ＡＴＰａｓｅ８　ａｎｄ　ＮＤ　ｉｓ　ｍｕｃｈ　ｂｉｇｇｅｒ．　ｈｅ　ｍｉＴｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ＩＩＩ（ＣＯ　ＩＩＩ）ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｔＲＮＡ—Ｇｌｙ、ＡＴＰａｓｅ６　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｄｕｃｋ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｏｆ　ＣＯ　ＩＩＩ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　７８４ｂｐ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｔｈｅ　ＣＯ　ＩＩＩ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｄｕｃｋ　ｓｈｏｗｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｐｏｕｌｔｒｙ　ｒｅｃｏｒｄｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｎｄ　ｉｔ　ｈａｓ　９０．６％ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　Ａｙｔｈｙａ　ｏ，　ｎⅡ耽，８９％ｗｉｔｈ　Ｂｒａｎｔａ　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，８８．６％ｗｉｈ　ｔＡｎｓｅｒ　ａｌｂｉｆｒｏｎｓ　ａｎｄ　８８．　６％ｗｉｈ　Ｃｙｇｎｕｓ　ｃｏｌｕｍｂｉｔａｎｕｓ．Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｉｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｒｅｓｕｌｔｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｄｕｃｋ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｆｉｌａ　ｇｅｎｏｍｅ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｍ（ｃｏ　ｍ）Ｈｏｍｏｌｏｇｙ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉ０ｎ