苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

山西农业科学２００８，３６（７）：１４～１６　苹果　兕１基因原核表达载体的构建　及其在大肠杆菌中的表达　张传义　，孟玉平　，孙海峰　，曹秋芬　（１．山西省农业生物技术研究中心，山西太原０３００３１；２山西大学化学化工学院，山西太原０３０００６）　摘要：ＡＦＬ１基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到ＡＦＬｌｃＤＮＡ基因的基础上，将ＡＦＬ１克隆　到原核表达载体ｐＥＴ２８ｂ中，获得了重组表达质粒ｐＥＴ—ＡＦＬ１，并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株ＢＬ２１　中，经ＩＰＴＧ诱导表达、ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分析，结果显示，ＡＦＬ１基因在大肠杆菌中成功表达，表达的ＡＦＬ１融　合蛋白分子量大约为５３　ｋＤ。　关键词：ＡＦＬ１；原核表达；表达载体构建；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　中图分类号：Ｑ７８２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—２４８１（２００８）０７—００１４—０３　Ｔｈｅ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ａｐｐｌｅ　ＡＦＬ１　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｕａｎ—ｙｉ　，ＭＥＮＧ　Ｙｕ—ｐｉｎｇ　，ＳＵＮ　Ｈａｉ—ｆｅｎｇ’，　，ＣＡＯ　Ｑｉｕ．ｆｅｎ　（１．ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３００３１，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｔｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３０００６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡＦＬ１　ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｋｅｙ　ｇｅｎｅｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｌｆｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　ａｐｐｌｅ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ—ＡＦＬ１　Ｗｒｔｉｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｅ　ｃｏｉｌ　ＢＬ２１　ａｆｔｅｒ　ｈａｖｉｎｇ　ｃｌｏｎｅｄ　ＡＦＬ１　ｉｎ　ａｐｐｌｅ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ＷＳＢ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ～ＰＡＧＥ．ｓｈｏｗｉｎｇ　ｔｈａｔ　ＡＦＬ１　ｗａｓ　ｅ】【．　ｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　５３ＫＤ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＡＦＬ１；Ｐｒｏｋａｒｙｏｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ＡＦＬ１是从苹果中克隆到的拟南芥ＬＦＹ同源　试验所使用的ＤＨ５仅和ＢＬ２１菌株、克隆载　基因，长约１．４　ｋｂ，是在成花过程中控制花发育　体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌＩ　ＫＳ＋及表达载体ｐＥＴ２８ｂ由山西　的关键基因之一。ＡＦＬ１在果台枝顶芽停止营养　省园艺作物生物技术研究室保存。ＩＰＴＧ、限制性　生长转向生殖生长后持续表达，在苹果的花芽形　内切酶、ＤＮＡ聚合酶及其他ＰＣＲ试剂均为大连　成过程中起重要的作用…。为了更深入地了解　宝生物公司产品。低熔点琼脂糖购自ｐｒｏｍｅｇａ公　ＡＦＬ１基因的生理功能，本研究在已经得到ＡＦＬ１　司（美国）。提取质粒和回收所使用的其他试剂　ｃＤＮＡ的基础上，将ＡＦＬ１基因克隆到大肠杆菌原　均为北京化工厂产品。　核表达系统中，并进行了诱导表达。　１．２方法　１材料和方法　１．２．１感受态细胞的制备　取一８０￣Ｃ冻存菌　ＤＨ５仅和ＢＬ２１，平板划线，３７℃过夜培养。挑取　１．１菌株、载体及试剂　单菌落接人试管中，３７℃摇床培养过夜。按１％　。收稿日期：２００８一ｏ２—２６　项目来源：山西省科技攻关项目（０２１０３４）；山西省农业科学院高新技术项目（ＸＧＸ一０１）　作者简介：张传义（１９８２一），男，山东枣庄人，在读硕士，研究方向：生物技术。通讯作者为曹秋芬。　・１４・　维普资讯 http://www.cqvip.com 张传义等：苹果ＡＦＬ１基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达　的接种量接入三角瓶中，３７℃摇床培养至ＯＤ　＝１．２．３　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析　挑取划线的阳性克　０．６，冰浴培养３０　ｍｉｎ，８　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，　隆，接种ＬＢ液体培养基（含卡那霉素３０　ｍｇ／　ｎ１），３７℃摇床培养过夜．按１％的接种量接种于　弃上清。菌体沉淀中按照５　ｍｌ／１００　ｍｌ培养液的　ｒ比例加入７５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣ１　溶液，充分混匀后冰　ＬＢ液体培养基上，３７℃培养至ＯＤ　约为０．５　浴１０　ｍｉｎ，８　０００　ｒ／ｍｉｎ离心菌体５　ｍｉｎ，弃上清。　Ｌ，１５％甘油）并混匀、分装，一８Ｏ℃冻存备用。　时，加入ＷｒＧ　１　ｍｍｏｌ／Ｌ诱导２，４，６，８　ｈ，４ｏＣ下，　液。菌体沉淀中加入１００　ｌ　１０　ｍｍｏｌ／Ｌ＇Ｉｒｉｓ—　２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ，并分别收集菌体和上清　沉淀中加入适当体积的ＣａＣ１　保存液（７５　ｍｍｏｌ／　１分别将菌体悬液和上清液中加入　１．２．２　表达载体的构建　用碱裂解法　提取　ＨＣ１悬起菌体，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ＋ＡＦＬ１（克隆载体）和ｐＥＴ２８ｂ　等体积的２×上样缓冲液（Ｔｒｉｓ—ＨＣ１　１０　ｍｍｏｌ／　（表达载体）质粒，ＢａｍＨ１分别酶切这两个载体　Ｌ，ｐＨ　８．０；２％ＳＤＳ；Ｏ．１％溴酚蓝；１０％甘油。用　后，低熔点琼脂糖回收【２　Ｊ　ＡＦＬ１片段和线性化　时加１０％巯基乙醇）混匀。沸水浴１０　ｍｉｎ，冷却　ｐＥＴ２８ｂ载体，将回收片段与载体用Ｔ４　ＤＮＡ连接　后取２Ｏ　ｌ进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析。电泳后凝胶　酶ｌ２℃连接过夜。将连接产物转化至ＤＨ５ａ感　固定约１．５　ｈ（固定液：５０％甲醇＋５０％冰醋酸），　受态细胞，涂布平皿（含卡那霉素３０　ｍｇ／ｍ１），　考马斯亮蓝Ｒ２５０染色（染色液：０．１２５　ｇ考马斯　甲醇，６％冰乙酸）至背景清晰为止，并用ＳＹＮ凝　３７℃过夜培养获得转化菌落。挑取单菌落于５Ｏ　亮蓝Ｒ２５０＋２５０　ｍｌ固定液），脱色（脱色液：２５％　无菌水中沸水浴裂解菌体，取１ｔｘｌ菌体裂解液　作为模板，用ＡＦＬ１特异性引物（上游引物：５　一　ＣＡＧＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＴＴＣＡＴｒＧＴＧＡＣ一３，．下游　弓Ｉ物：５　一ＧＡＣＧＣＡＡＧＣＴｒＴＧＧＴＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴ—　胶成像系统拍照。以ｐＥＴ２８ｂ空载体转化菌作为　阴性对照。　ＡＣＣＡ一３　）进行ＰＣＲ鉴定。反应条件为：９４℃预　变性１０　ｍｉｎ，９４ｏＣ变性４５　ｓ，５６ｏＣ退火４５　ｓ，７２ｏＣ　２结果与分析　将克隆载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ＋ＡＦＬ１用　（图１），用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将回收片段与ｐＥＴ２８ｂ　ｐＥＴＡＦＬ１。将连接产物转化至ＤＨ５ａ感受态细　性克隆（ＰＣＲ产物大小为４４７　ｂｐ）（图２）。　延伸１　ｍｉｎ，循环３Ｏ次，７２℃延伸５　ｍｉｎ。１％琼　ＢａｍＨ　Ｉ酶切，电泳回收ＡＦＬ１约１　４５０　ｂｐ的片段　脂糖凝胶电泳ＰＣＲ产物，观察特异性条带。挑取　粒，选取Ｈｉｎｄ１１１酶切确认正向克隆的重组质粒，　ＰＣＲ鉴定出的阳性克隆菌落，划线培养，提取质　表达载体ｌ２℃连接过夜，构建表达载体　转化至ＢＩ２１感受态细胞，保存备用。电泳结果　胞，利用ＡＦＬ１特异引物对ＰＣＲ筛选得到两个阳　用ＵＶＰ凝胶图像分析系统观察并拍照。　Ｍ　１　１４５０　ｂｐ　３７．４６号为阳性　图１　ｐＢＳ　ＫＳ＋ＡＦＬ１　ＢａｍＨ　图２　ＡＦＬ１表达载体的ＰＣＲ鉴定　Ｉ酶切结果　由于ＡＦＬｌｃＤＮＡ片段内部有两个Ｈｉｎｄ１１１位　重组质粒ｐＥＴＡＦＬ１转入大肠杆菌ＢＩ２１后，　点，根据片段内部和载体上Ｈｉｎｄ　１１１位点的位置　关系，可以确认用Ｈｉｎｄ１１１酶切重组质粒后，只切　出一条带的为正向插入片段（图３）。将正向插　入子的重组质粒转化至ＢＬ２１感受态细胞。　用ＩＰＴＧ诱导其表达（图４）。从图４中可以看　出，在离心后的上清液中没有目的蛋白质的表　达，表达产物主要存在于菌体沉淀中。而且在诱　导２，４，６，８　ｈ后的菌体沉淀均能够观察到一条　・ｌ５・　维普资讯 http://www.cqvip.com 山西农业科学２００８年第３６卷第７期　异蛋　脱嘶　影响不大。　量３讨论　Ｊ　比　重组质粒ｐＥＴＡＦＬ１转入大肠杆菌ＢＩ２１后，　在ＩＰＴＣ诱导下，表达出舡．Ｌｌ蛋白，但随着诱导　时间的增加，蛋白的表达量没有明显增加，这可　能是由于真核基因转入原核表达系统后，由于氨　１４５０　基酸密码子使用上存在差别。一般来说，原核表　ｂｐ　达系统表达真核基因的表达产物无论是表达量　还是活性都不高，原因可能是前导肽、启动子、信　号肽、成熟肽序列对蛋白形成和形成具有活性的　构像有重要影响【３　Ｊ。但本试验构建的原核表达　３７号为正向插入子　系统在ＩＰＴＧ的诱导作用下成功表达，有望进一　圈３重组质粒插入方向的酶切鉴定　步用于蛋白纯化、进行结构分析及制备特异性抗　体、分析该基因产物在苹果花发育中的作用。　参考文献：　［１］曹秋芬，和田雅人，盂玉平，等．苹果ＬＥＡＦＹ同源基因的　ＣＤＮＡ克隆和表达分析［Ｊ］．园艺学报，２００３，３０（３）：２６７　—２７１．　［２］Ｊ・萨姆布鲁克，Ｅ・Ｆ・弗里奇著．金冬雁，黎盂枫译．分　子克隆实验指南［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．　［３］ＩＫＥＭＵＲＡ　Ｈ，ＴＡＫＡＧＩ　Ｈ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｒｏ—ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｆｉｌｉｓｉｎ　Ｅ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ／ａ　ｃｏｌｉ　［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９８７，２６２（１６）：７８５９—７８６４．　泳道ｌ为对照菌体；泳道２为对照上清液；　［４］ＩＫＥＭＵＲＡＨ，ＩＮＯＵＹＥＭ．Ｉｎ　ｖｌｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆｐｒｏ—ｓｕｂｔｉｌｉ・　泳道３，５，７，９分别为ＩＰＴＧ诱导后２，４，６，８　ｈ的上清液；　ｓｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｉｌ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９８８，　泳道４，６，８，１０分别为ＩＰＴＧ诱导后２，４，６，８　ｈ菌体　２６３（２６）：１２９５９—１２９６３．　圈４　Ａ尼１原核表达产物的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析　冬青　选育单位山西省农业科学院品种资源研究所　．　品种来源Ｇ６７１×小白皮。母本Ｃ，６７１是从国外材料中选育的自交系。　特征特性早熟，播种后３６　ｄ即可采收２５０　ｇ左右的嫩瓜。株型半蔓生，植株生长势强，雌花多，　瓜码密，连续结瓜能力强。果实长筒形，粗细均匀，果皮绿色、色泽鲜嫩、光滑，丰产性较好。　产量表现２００５—２００６年参加山西省早春露地西葫芦试验，２００５年平均单产６６　４３９．５　ｋｇ／ｈｍ　，　比对照早青一代增产９．２％；２００６年平均单产４８　３６０．０　ｋｇ／ｈｍ　，比对照早青一代增产１　１．８％。两年　平均单产５７　３９９．０　ｋｇ／ｈｍ　，比对照早青一代增产１０．３％。两年试验点共ｌＯ个，增产点９个，增产点比　例达９ｏ％。　栽培要点①株行距５０　ｃｍ×８０　ｃｍ。②施足底肥，采用地膜覆盖栽培，结瓜后要追肥浇水，及时　采摘嫩瓜，抢早上市。③保护地内因昆虫少，要进行人工辅助授粉。　适宜区域山西省各地早春露地均可种植。　・ｌ６・