浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施

广东畜牧兽医科技２０１０年（第　鲞　箜塑　一　经验交流　・４９・　浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施　陈峥　，赖月辉，陈振荣　（广东永顺生物制药有限公司，广东广州中图分类号：￥８５４．４＋３　文献标识码：Ａ　５１１３５６）　文章编号：１００５—８５６７（２０１０）０４～００４９—０３　预防细胞培养的微生物污染是指在细胞培养　过程中，细菌、霉菌或病毒等微生物侵入细胞培养　物中，对细胞的生存造成危害的现象。在生物制品　的生产和研究等相关的细胞培养过程中，由于细　胞培养的特殊性和培养条件要求高，若受到微生　物的污染，这将对实验或生物制品生产带来了严　重的危害。　为防止细胞培养过程中受到其他微生物污　染，首先应该从污染途径检查，对可能造成污染的　每个环节和步骤制定严格的消毒措施：其次判断　污染的类型，对不同的污染类型采用提纯细胞群、　添加抗生素等措施加以处理和预防。同时制定严　格的操作规范以保证污染可以早预防、早发现、早　处理。　１　污染类型　１．１　细菌污染细胞培养中细菌污染较为常见。　主要是由于操作不当或是器材消毒不严，或是各　种营养成分隐性污染细菌没有被检测出来所造成　的。即使在细胞培养液中加入了抗菌素，使得细菌　繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，不易　被肉眼观察。但随着抗生素的失效，营养液中的细　菌大量增殖而造成污染…。　培养的细胞出现细菌污染之后，一般会出现　细胞变圆，胞内颗粒增多增粗。污染的细菌由于新　陈代谢使培养液ｐＨ明显下降，含有酸碱度指示剂　的营养液颜色则有明显的变化（如ＭＥＭ、１９９或　１６４０等营养液颜色变黄）；营养液发臭，明显浑　浊：在显微镜下可以看到有细菌样颗粒体的形态。　在细胞营养液没有出现浑浊，颜色变黄的情况下，　用营养液接种ＧＰ、ＧＡ、ＴＧ等培养基，如有细菌菌落　收稿日期：２０１　Ｏ－０３—２９　：通讯作者　生长可证明该细胞受到了细菌的污染。　１．２支原体污染支原体污染不能用肉眼或光　学显微镜检查细胞观察出来，带有一定的隐蔽性，　易被人们忽视。当细胞被支原体污染后，细胞营养　液可能毫无变化，短期内细胞没有明显的病理变　化，也可以因为传代或换液而缓解。只有当污染严　重时才影响细胞增殖，使细胞脱落［２］。支原体可以　与宿主细胞形成一个共生关系，使污染不断扩大。　一旦发生支原体污染，支原体可以通过移液、倾倒　液体时产生具有潜在感染力的飞沫和吸附的尘　埃，沉积在物体表面。这种污染性尘埃能存活数天　甚至数周，使操作环境受到污染，若不及时处理还　会产生交叉污染或再次污染。支原体污染常用的　检查方法为培养检测法，即取ｌ　ＩＩｌＬ细胞培养液加　入支原体液体培养基中，培养５天后，观察培养基　的颜色变化。如果变黄则怀疑该细胞受到支原体　污染。如果不变色，则盲传一代。若颜色变黄，可接　支原体固体培养基，于５％Ｃ０。培养箱中培养３－－－，５　天，观察有　‘煎蛋’’状支原体菌落。一旦发生污染　即淘汰该细胞和培养液。此外，支原体污染还可用　荧光染色法［　和相差显微镜观察法［ｓ　等检测方法。　１．３霉菌污染霉菌污染和细菌污染比较相似，　都可以由无菌操作环境差或者器材等消毒不彻底　造成。霉菌污染经常发生在潮湿的季节或者潮湿　的操作环境。可以通过肉眼观察细胞生长和培养　基培养的方法来检测霉菌污染。霉菌短期内不会　引起营养液的浑浊，但是在细胞瓶壁可以见到明　显的成片或是成块状的霉菌菌落。在显微镜下可　以看到霉菌的菌丝，营养液常可见颜色变黄。在无　任何污染的细胞上，抽取细胞培养液放入普通的　・５０－　经验交流　浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施～陈峥，等　性作用，因此特别要注意不同的细胞培养的特点　培养基上培养，如果见到培养基上有霉菌生长，也　可以判断该细胞受到霉菌污染。霉菌污染可以使　细胞变形、脱落。霉菌孢子对环境的耐受力很强，　和对抗生素耐受程度的不同。在对具体的细胞选　用抗生素，首先对用药的种类和剂量进行筛选以　选到既可抑制污染微生物又不影响细胞生长的抗　生素。　普通的消毒液很难清除，所以对操作环境带来严　重的危害。　１．４病毒污染外来病毒污染最为隐蔽，一经污　２＿２污染的处理　处理污染关键是找出污染的　源头和途径。判断细胞污染的源头与途径的时，可　染难以用常规方法检测到。病毒颗粒细小，侵入到　细胞胞内，普通光学显微镜难以观察到。受病毒污　染的细胞，细胞培养液清亮，毫无变化。一些具有　致病性的病毒会造成细胞变圆、肿胀、脱落等细胞　病变现象。可根据这种现象来判断细胞是否感染　外来病毒。　外来病毒污染还能借助免疫学方法判断。如　用ＥＬＩＳＡ方法检测牛睾丸细胞培养中的ＢＶＤＶ（牛　流行性腹泻）和ＢＤＶ（羊边界病毒）污染，此外还有　用ＰＣＲ、ＡＧＰ（琼脂扩散试验）和胶体金试纸条方法　检测一些特定病毒污染。　１．５杂质细胞污染常见于原代细胞培养。原代　细胞是通过组织块消化而来的，在消化过程中由　于剪割的组织块不够纯，消化时间把握不好，容易　把杂质细胞消化混入原代细胞培养中。杂质细胞　污染可以通过镜检观察细胞形态判定。如果混入　了杂质细胞，可以通过再次消化的方法，提纯细胞　群，从而达到净化细胞的目的。　２预防与处理　２．１　污染的预防　由于细胞在体外没有抵抗微生　物的能力，细胞一旦被污染，多数较难于清除。如　果不是重要的细胞，一般都建议废弃或者淘汰处　理。细胞培养关键在于预防污染而不是清除污染，　预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好方　法。在细胞受到污染早期或者较轻微污染的时候，　如果能够及时作出处理，可将部分细胞挽救回来。　在实验和生产过程中污染预防除了在操作环　境和原材料上的消毒和无菌处理等手段外，对预　防和排除少量的细菌、支原体和霉菌污染可以通　过在营养液上添加抗生素来实现。常用的抗生素　有：双抗（青、链霉素），庆大霉素、卡那霉素、多粘　菌素、四环素、制霉菌素等。使用抗生素来预防污　染，通常是多种抗生素联合比单个抗生素的效果　好，有的抗生素只有抑制作用没有杀菌效应；如果　用量太大，细胞耐受不了，对细胞或者细胞系有毒　以借助污染概率来判断。如营养液等原材料受到　污染时，表现整批细胞受污染；如果是操作失误而　造成的污染，表现只有一小部分细胞受污染。　３基础保障　３．１　空气消毒空气是微生物传播的主要途径。　细胞培养操作的地方如果与外界隔离不严密或消　毒不充分，外界不洁空气进入培养体系而造成污　染。培养环境不能设在通风场所。无菌操作应在超　净化台内进行。工作时要带上消毒好的口罩，以免　因交谈、咳嗽等使外界污染物进入操作面，造成污　染。同时尽量避免人员走动，避免引起大量的空气　流动致使空气微生物混入而造成污染，操作时把　手彻底洗净并用消毒液消毒。如需要培养大量细　胞，环境洁净度应达到万级。定期对超净台和培养　场地进行空气中细菌含量检查。无菌工作台和过　滤网应定期清洗，清洗后用７５％酒精擦拭干净，紫　外线照射４０　ｍｉｎ以上。各种培养板照射３　ｈ以　上，最大限度地洁净环境中的空气。　３．２器材消毒　各种直接跟细胞接触的培养器　皿、器械，如果消毒不彻底和洗刷不干净，将直接　影响细胞生长和导致营养液的污染。在培养细胞　前，应该对要使用的器械分类，彻底消毒。如玻璃　器械和玻璃培养瓶的消毒，采用高压蒸汽灭菌３Ｏ　ｍｉｎ以上或干烤消毒１４０℃２　ｈ以上，彻底消灭　吸附在器械上的各类微生物。　３．３血清　血清是在细胞培养中提高各种生长　因子供细胞生长的重要营养成分。直接作用于细　胞，是营养液的重要成分。在制备营养液的过程中　须单独添加。但血清在生产制作过程中容易受到　支原体或其他病原微生物的污染。使用前应对血　清进行细菌和支原体、病毒等潜在病原体的检查，　以防止受污染的血清混入细胞培养液中。　３．４营养液　营养液是直接提供细胞新陈代谢　的各种物质。但营养液中也富含其他污染微生物　浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施一陈峥，等　经验交流　・５１・　繁殖所需的营养成分，因此在细胞培养中营养液　作。每天至少消毒一次工作台面和环境。制定有效　严格要求处于无菌状态。在营养液制备过程中，采　的防虫防蚊措施。　用蔡氏过滤器或者０．１　ｕ　ｍ孔径的滤膜过滤，经无　操作接触各种器械和进行细胞培养时，如果无　菌检查合格后才能使用。　菌观念不强，操作程序不规范，技术不熟练，使用污　３．５消化液和双抗等其他液体　消化液和双抗　染的器皿或瓶塞封瓶不紧等，都可能造成细胞液污　等其他液体也直接作用于细胞，在消化细胞组织　染。所以在操作过程中每一个操作步骤都应有火焰　和制备营养液时使用。在用于细胞培养之前采用　的保护下，防止空气中细菌等微生物污染。　与营养液制备相同的方法将其过滤除菌，分装成　小瓶，无菌检测合格之后才能置一２０℃配用。　参考文献：　３。６建立制度．规范操作严格的规章制度可以　［ｉ］曾卫东，董青．动物细胞培养中微生物污染的检测［Ｊ］．浙江　大大减少污染的概率。在工作过程中禁止非工作　畜牧兽医，２００３，（２）：１２．　人员进入实验室和工作场地。进入工作场地应该　［２］何大澄，张鸿卿，邱相寰，等．细胞培养中的支原体污染问题　［Ｊ］．细胞生物学杂志，１９８４，６（４）：ｉ５３—１５６．　更换衣服和鞋，工作时应穿上消毒过的工作服，使　［３］刘江，姜述德．细胞体外培养过程中霉菌污染的预防［Ｊ］．国　用各类器械也要严格根据器械的使用规范来操　外医学预防、诊断、治疗、用生物制品分册：１９９５，１８（２）：６１—６４　农业部：五方面举措做好夏季动物疫病防治工作　农业部兽医局副局长李长友７月２７日做客新华网，就我国上半年重大动物疫病防控成效的与　网友在线交流。李长友在访谈中表示，夏季是重大动物疫情高发季节，农业部采取五方面措施做好　夏季动物疫病防治工作。　李长友说，夏季是重大动物疫情高发季节，这里主要有三个因素：一是夏季因为气温高、湿度　大，适宜各种细菌、微生物的繁殖，病原微生物的数量比其他季节大大增加。二是由于天气炎热，牲　畜容易产生反应，容易感染疾病；三是像蚊子、苍蝇等其他昆虫在夏季大量繁殖，也增加了传播病　原微生物的疾病，很容易造成虫媒传播疫病的发生。针对这个特点我们多次组织专家研判疫情形　势，周密部署疫情防控工作，夏天主要加强了几方面的工作：　一是加强夏季消毒灭源，我们制定了消毒灭源的工作方案，动员防治机构、养殖企业、农户多　方参与，有效防止病原微生物滋生。　二是强化基础免疫，在春季集中免疫的基础上，加强日常补免和免疫效果的监测。对于一些常　见病各地也结合本地实际情况，做好免疫工作，以减少损失。　三是及时开展疫情监测报告。加大动物疫情监测力度，特别是养殖大县，增加病原学监测数　量，扩大范围，加大频次，及时发现和消除疫情隐患。继续坚持口蹄疫疫情日报告制度。一旦发现疑　似疫情，按规定及时上报。　四是依法严格检疫监管。进一步强化产地检疫和屠宰检疫，抓好流通环节检疫监管。对于病　死畜禽及其产品要严格实　‘四不准一处理”，严防流入市场，切实保障动物产品质量安全。　五是切实提高应急处置能力。强化应急防控机制，加强应急培训和演练，扎实做好各项应急准　备。一旦出现突发疫情，要迅速果断处置，在最短的时间内把疫情控制在最小范围内，确保不发生　扩散蔓延。按照农业部的部署，各地也在积极采取措施，做好夏季动物疫病防治工作。　目前，全国重大动物疫情还是继续保持着平稳的态势。（资料来源：新华网）