实验四 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察

摘要 本实验采用硝酸银染色法对枯草芽孢杆菌与铜绿假单胞菌进行鞭毛染色，在油镜下观察其菌体形态和鞭毛的形态、数量、着生位置。并采用压滴法观察细菌的运动性。

关键词 鞭毛 、硝酸银染色法 、 压滴法 、运动性

一、实验目的

1．学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。 2．学习用压滴法观察细菌的运动性。

二、基本原理

鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。根据鞭毛的特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。鞭毛直径一般为10~30nm，只有用电镜才能直接观察到。在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。首先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）进行染色。

在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。

三、实验器材

1、菌种

枯草芽孢杆菌活菌、铜绿假单胞菌活菌 2、溶液和试剂

硝酸银鞭毛染液A液和B液、0.01﹪美蓝水溶液

3、仪器和其他用品

酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、烧杯、载玻片夹子、蒸馏水、吸水纸

四、实验操作

1、活菌运动型性观察（压滴法）

（1）菌液制备 无菌操作，用接种环分别在枯草芽孢杆菌斜面培养基和铜绿假单胞菌斜面培养基上挑取菌落边缘菌体，接种环接触提前滴在载玻片上的水滴上，制成轻度混浊的菌液，注意不要剧烈震荡。

（2）制片 用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，防止产生气泡。

（3）镜检 将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。 2、鞭毛染色（硝酸银染色法）

（1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，置洗含衣粉过的水中煮沸20min。取出用清水冲洗，沥干水后，置95%乙醇中浸泡，用时取出在火焰上烧去酒精。 （2）菌液制备 菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。无菌操作，用接种环分别在枯草芽孢杆菌斜面培养基和铜绿假单胞菌斜面培养基上挑取菌落边缘菌体，接种环接触提前滴在载玻片上的水滴上，制成轻度混浊的菌液，注意不要剧烈震荡。

（3）涂片 将玻片缓缓倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。

（4）染色 ①滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3～5min；②用蒸馏水充分洗净A液；③用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。 （5）镜检 先低倍镜观察，再高倍镜观察，最后用油镜观察。镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。

五、实验报告

1、实验结果

实验中观察到了铜绿假单胞菌的运动，没有观察到枯草芽孢杆菌的运动。 枯草芽孢杆菌菌体形态为短杆状，鞭毛多根，周生。铜假单胞菌菌体形态为直或稍弯、两端钝圆的杆菌，单生。菌体的一端只有1根鞭毛，为单端鞭毛。 实验中细菌的鞭毛多被破坏掉，只观察到枯草芽孢杆菌细菌周围一根短短的鞭毛。 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 实验照片 绘 图

2、思考题

（1）除鞭毛染色法外，还有什么方法能观察到鞭毛？

答：使用电子显微镜观察，电子显微镜分辨率高，不需染色进行观察。 （2）你对你所做的鞭毛染色结果满意吗？如果不满意，有哪些方面需要改进？如果满意，你的成功经验是什么？

答：不满意。鞭毛的染色实验可清楚观察到染色后的细菌，但未能成功观察到染色后的鞭毛。分析失败的主要原因，在于实验操作不规范，缺乏耐心和经验。 （3）如果你发现鞭毛已与菌体脱落，请解释原因。

答：①选用的菌种可能培养时间过长，为老龄菌种，鞭毛易脱落。 ②在制备菌种菌液时振荡幅度太大，使鞭毛脱落。

③鞭毛染色及冲洗染液时，操作不够规范，液体流动性大使鞭毛受损脱落。

实验注意事项

1.要选好菌种。细菌的鞭毛应多而长易于观察。

2.要注意培养时间：培养时间要严格掌握，一般培养9～12h较好，菌龄超过15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。 3.染色液一定要新鲜 A染液和B染液最好都现用现配，A液一般不能放置。 4.染色过程中的细节也应充分注意：①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。④A染液染3～5min，其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则加B染液后，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。⑤B染液染完后，用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。

小结

本次实验主要学习鞭毛染色法和压滴法。鞭毛的染色实验未观察到完整的鞭毛。分析主要原因，在于实验操作不规范，缺乏耐心和经验。通过对老师帮忙调节显微镜视野，观察到鞭毛的着生位置和形态特征，对鞭毛是菌体的运动器官有了更好的理解。细菌运动性观察实验中，成功的观察到运动的细菌，实验较成功。