一、操作前准备： 1.1流动相的配制：
赛默飞世尔(原戴安)
液相色谱操作规程-U3000
1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。
1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜（0.45um）还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。 1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。 1.2对照品供试品处理：
1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），使其浓度为0.1~1mg/mL（根据检测结果再适当调节溶液的浓度）。
1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜（0.45um）还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。
1.3色谱柱的选择：根据样品的性质选择适当的色谱柱。 二、开机：
2.1打开UPS（不间断电源）电源，打开仪器接线板电源开关； 2.2打开电脑显示器电源，打开电脑主机电源（POWER），启动电脑； 2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源；
2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动,等显示“本地仪器控制器 运行空闲”,可以关闭界面。 2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标（工作站主程序）。 2.6在左下方点击仪器，则在右边会自动显示该仪器控制面板。
2.7旋开泵上的排液阀(两圈以上)；设置A通道为100%，点击“冲洗”，然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”；（默认冲洗5分钟）；然后分别“冲洗”流路中其他通道气泡；排完气泡后关闭排液阀；
2.8设置流动相的比例及流速后，点击“马达”。此时泵自动会以设置的流速进行运行。 2.9在控制面板“柱温箱”控制框中，设置准备分析样品所使用的柱温箱温度。 3.0清洗进样器：依次执行灌注注射器，清洗缓冲环，外部清洗针。
三、样品分析： 3.1建立仪器方法：
3.2建立处理方法及报告模板（此步骤可以省略，直接调用以前的）： 3.3建立序列：
3.4打开氘灯（待系统压力稳定后约15min后再开灯）：在控制面板“Detector”控制框中，选中“紫外灯”选框，及“可见灯”选框（如果波长在可见范围）。
3.5在控制面板“UV”控制框中，设置波长，采集频率（10HZ），时间常数（0.5s）；点击“监视基线”，选中通道1并确定。
3.6待基线稳定后，点击“监视基线”，点击确定，关闭查看基线。
3.7点击左下方“数据”，并选中要分析的序列，然后点击“开始”启动样品表进行分析（如果序列里有完成的样品，则会变成继续，点继续；如果该序列还在队列中则会显示删除，点击删除后在点击继续）；
3.8样品全部检测结束后，如果不再分析样品应立即关掉氘灯，延长氘灯使用的寿命 四、数据处理： 4.1处理标准曲线； 4.2打印标准曲线； 4.3打印样品报告。 五、关机：
5.1冲洗色谱柱（如果使用了缓冲盐，首先使用10%甲醇水溶液冲洗色谱柱30分钟，然后使用纯甲醇冲洗色谱柱30分钟）。
5.2关闭泵马达，断开连接，关闭工作站。
5.4关闭检测器、柱温箱、自动进样器、泵的电源。 5.5关闭计算机。关闭UPS电源或稳压电源。 六、注意事项：
6.1溶剂泵的使用注意事项：
（1） 使用时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转会磨损柱塞、缸体和密
封环，最终产生漏夜。
（2） 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、
缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体颗粒。流动相过滤，可采用滤膜（0.2um或0.45um）等滤过。
（3） 输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏夜。
（4） 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量的气泡，
泵就无法正常工作。
（5） 溶剂泵长期不用时，用甲醇以1.0ml/min冲洗各个通道。 （6） 泵的清洗液要勤换。
（7） 每次开启泵之前要排除管道中是气泡。
（8） 流动相由无机盐溶液转换有机溶剂前要用90%去离子水清洗管路。 （9） 转换不同流动相时注意两者是否容易混合或者发生反应。 （10）长期不用或运输前要到空清洗液瓶。 6.2色谱柱的使用注意事项：
（1） 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高
处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，进样阀的转动不能过缓。
（2） 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产厂家指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去
留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
（3） 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器
前连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析之前被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被破坏。
（4） 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或
者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是有相似固定相的短柱，也有用浸透限制固定相短柱。保护柱可以经常更换。
（5） 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝
对禁止将缓冲液留在柱内静置过夜或更长时间。
6.3检测器的使用注意事项：
（1） 长时间检测池中无流动相流动时，关闭检测器氘灯。 （2） 不要将物品或其他仪器档住检测器的散热孔。
（3） 检测器安装的位置应没有震动，温度变化不大，避免阳光直射。
（4） 在关灯命令发出后，再次开灯须等待5分钟以上的时间。否则灯会因为过热而损
坏。
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