流式细胞仪使用方案

流式细胞仪使用方案

一、 单细胞悬液的制备 贴壁细胞↓

0.25%胰蛋白酶消化2至3min ↓

移至玻璃离心管 ↓

加入D-hank‘s液，轻轻吹打 ↓

用800-1000r/min离心机离心3至5min ↓

『去上清，加入PBS均匀吹打，短时低速离心。』重复三次 ↓

加PBS充分吹打，保证细胞数每毫升1万个作用 ↓

加95%乙醇（1：10），固定30min ↓

4度冰箱过夜或-20度长时保存

二、 染色技术

1选取荧光素

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2样品染色步骤 PBS洗细胞1-2次 ↓

加荧光单抗，暗处孵育15-30min ↓

如果必需，加荧光二抗，暗处孵育15-30min ↓

PBS洗细胞一次 ↓

过300目尼龙网 ↓

上机检测 3对照的设置 阴性对照

同型对照（见附录）

三、 流式细胞数据处理与分析

数据的显示通常可分为一维单参数直方图（histogramplot）、二维点图（dotplot）、二维等高图（contour）和假三维图（pseudo3D）等。下面简述最常用的单参数直方图和二维点图。

1. 单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形，可用来进行定性分析和定量分析。横坐标表示荧光信号或散射光信号强度的相对值，其单位用“道数”（channel）表示，横坐标可以是线性的，也可以是对数的。纵坐标通常代表细胞出现的频率或相对细胞数。下面以研究细胞周期为例说明如何分析单参数直方图所表达的信息。

单参数直方图

经DNA特异性染料（如P1）染色的细胞群体，通过流式细胞仪测量区受激光照射后发出特异性荧光，在一定条件下，荧光强度与细胞内的DNA含量成正比，DNA含量高的细胞发射的荧光强，反之则弱。

DNA含量与细胞数目的关系，即2N（2倍体）代表GO/G1期细胞，4N（4倍体）代表G2/M

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期细胞，两者中间代表S期细胞。这是典型的以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图。通过上述信息可得到所测细胞群 中增殖细胞的数量。

2. 二维点图单参数直方图只能表明一个参数与细胞数量间的关系，不能显示两个独立参数与细胞数量的关系。当需要研究两个或更多测量参数之间的关系时，可采用二维点图。

二维点图有两种形式，横坐标表示前向散射光（FSC），反映细胞的大小；纵坐标表示侧向散射光，反映细胞内颗粒的大小和多少。坐标图上每一点同时表示具有相应坐标值的细抱存在。

例如，人血白细胞悬液样品上机后，在坐标图上根据细胞大小和细胞内颗粒形态出现三类不同颜色的细胞群，通过设门框把这三类细胞区分开，即红色显示淋巴细胞群（P1），绿色显示单核细胞群（P2），蓝色显示中性粒细胞群（P3）。如果欲检测其中一种细胞两个独立参数与细胞数量之间的关系，则选定其中一个门框。

假设选定淋巴细胞（P1），即可对其两种不同荧光素标记的细胞数量进行分析，出现第二种形式的二维点图。横坐标为PerCP-Cy5荧光标记的CD3细胞数目（荧光道数），纵坐标为FITC荧光标记的CD4细胞数目（荧光道数）。

因此，左上象限（Q1）代表CD4―细胞百分比，右上象限（Q2）代表CD4+/CD3-细胞百分比，左下象限（Q3）代表CD4―/CD3―细胞百分比，右下象限（Q4）代表CD3―细胞百分比。由此得知，在CD3+淋巴细胞中CD4―淋巴细胞所占的百分比。

双指标二维点囤的细胞群框定 荧光双染色二维点图

附：

一、流式抗体选购常识

由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。

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流式抗体的选择：

1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。

2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。

3 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC,PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

常见荧光素波长分布示意图

二、同型对照的选择：

流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。同型对照

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选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。

流式抗体使用注意事项：

1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术 （采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术 则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。

2、直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。

3、尽量选择经实验验证的流式抗体，以保证实验结果。默克密理博公司Milli-Mark系列流式抗体已经通过了实验验证，并且提供了相关数据图供用户参考。

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