修订实验三菠菜中的色素提取分离及鉴定

一、实验目的

1、通过绿色植物色素的提取，了解天然物质的分离提纯方法； 2、熟悉薄板层析的用途及用法；

3、通过柱色谱分离操作，加深了解有机物色谱分离鉴定的原理； 4、从菠菜中提取出叶绿素、胡萝卜素、叶黄素等色素并加以分离。 二、实验原理 1、叶绿素简介

绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。它们在把光能转变为化学能的光和作用中起着重要作用。本实验从菠菜中提取上述各色素，并通过柱层析进行分离。

叶绿素存在两种结构相似的形式——叶绿素a（C55H72O5N4Mg）以及叶绿素b（C55H70O6N4Mg），其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-，β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-异构体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。

叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

CH2CHH3CRCH2CH3叶绿素a（R = CH3）

NMgNNNH3CCH3OCO2CH3CH3CH3叶绿素b（R = CHO）

CH2CH2OOCH3CH3CH3

H3CCH3CH3CH3CH3H3CRRCH3CH3H3CCH3

β-胡萝卜素（R = H） 叶黄素（R = OH）

H3CCH3CH3CH3CH2OHCH3维生素A

菠菜中各色素的理化性质

β-胡萝卜素，叶黄素，叶绿素a和叶绿素b四种色素在叶绿体中的含量比约为2:1:3:1。 (1)叶绿素a

有四个甲基与卟吩核连接(R = -CH3)。蜡状蓝黑色微小晶体。熔点117～120 oC。溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、二硫化碳和苯，不溶于石油醚。其乙醇溶液是蓝绿色，并有深红色荧光。

(2)叶绿素b

有三个甲基和一个醛基与卟吩核连接(R = -CHO)。蜡状蓝黑色微小晶体。熔点120～130

oC。溶于乙醇和乙醚，难溶于石油醚。乙醚溶液有亮绿色。其它有机溶剂的溶液通常是绿色

至黄绿色，并有红色荧光。可用作肥皂、脂肪、油蜡、食品、化妆品和医药用的无毒着色剂。由绿叶用乙醇萃取而制得，也可用化学方法合成。

(3)胡萝卜素

胡萝卜素有多种异构体，是四萜类化合物。α-胡萝卜素为红色结晶。熔点187 oC。旋光度+385°(c=0.08,苯)。溶于乙醚、苯、氯仿。β-胡萝卜素为红棕色结晶,熔点181 oC，溶于乙醚、丙酮、苯、石油醚。γ-胡萝卜素为紫色棱形结晶，熔点177.5 oC，溶于苯、氯仿。α-，β-和γ-胡萝卜素常共存于许多植物中，β-胡萝卜素含量最高。β-胡萝卜素在植物中几乎总是和叶绿素共存，含量最多的是胡萝卜、棕榈油以及多种绿叶植物。用做食物色素、保健食品，以及作防晒化妆品成分，还可用作制造维生素A的原料。

(4)叶黄素

又称胡萝卜醇(carotenol)。一类羟基类胡萝卜素的衍生物。以乙醚加甲醇精制，得黄色穗状物。具金属光泽的结晶。熔点183 oC。不溶于水，溶于油性溶剂。光稳定性较好。主要与叶绿素、胡萝卜素共存于绿色植物的叶和花中。在天然黄色素中，它的价格较贵，可用于食品着色。也有添加于禽饲料中，使禽蛋蛋黄增进黄色。

2、色谱原理

色谱法利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它

亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。

薄层色谱属于固-液吸附层析的类型。通常是把吸附剂放在玻璃板上成为一个薄层，作为固定相，以有机溶剂作为流动相。实验时，把要分离的混合物滴在薄层板的一端，用适当的溶剂展开。当溶剂流经吸附剂时，由于各物质被吸附的强弱不同，就以不同的速率随着溶剂移动。展开一定时间后，让溶剂停止流动，混合物中各组分就停留在薄层板上显示出一个个色斑的色谱图。若各组分无色，可喷洒一定的显色剂使之显色。

混合物中各物质在薄板上随溶剂移动的相对距离称为比移值（Rf值）。

Rf如图1中： Rf化合物1溶质最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离

3.0cm8.4cm0.25Rf化合物20.7012cm12cm

图1 薄层色谱效果图（a）原板,（b）已展开层析板

在一定条件下，各物质具有一定的Rf值。不同物质在相同条件下，具有不同的Rf值。因此，可利用Rf值对物质进行定性鉴定。但物质的Rf值常因吸附剂的种类和活性、薄层的厚度、展开剂及温度等的不同而异。所以在鉴定样品时，常用已知成分作对照试验，在同一个薄层板上进行层析，然后通过Rf值的比较，对物质作定性鉴定。根据斑点的面积大小和颜色的深浅的标准物的对照下还可进行定量。

化合物的吸附性与其极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时吸附性也较强。展开剂（溶剂）的极性越大，则对化合物的洗脱力越大，则Rf越大（如果样品在溶剂中有一定的溶解度）。

柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将待分离物质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同物质组分逐一分离。

本实验利用有机溶剂将菠菜中的色素浸提出来，利用柱层析和薄层层析法将色素分离开

来，根据各色素的颜色、分子极性与Rf值的关系、吸收光谱、荧光对分离出的色素进行鉴定归属，讨论结构对Rf值、吸收光谱的影响。

三、主要试剂及仪器

新鲜脱水菠菜、石油醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、硅胶（柱层析用）、层析柱、层析板、层析缸、剪刀、研钵、烧杯、天平、点样毛细管、锥形瓶、玻璃棒、洗耳球、布氏漏斗、滤纸、梨形分液漏斗、点样瓶、紫外灯。 四、实验步骤 1、色素的提取：

称取5克新鲜的脱水菠菜，用剪刀剪碎，放在锥形瓶中，加入30 mL 2﹕1（v/v）的石油醚和乙醇混合溶剂，浸没菠菜叶片，用玻棒搅动数分钟，以利于菠菜叶的细胞破裂，色素浸出。布氏漏斗抽滤，将菠菜汁转入分液漏斗，分别用等体积的饱和食盐水和蒸馏水洗涤两次，以除去萃取液中的乙醇（洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化）。弃去水-乙醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥。 2、薄层层析

将上述的萃取液用毛细管点在硅胶G 的预制板上，小心放入预先加好选定展开剂石油醚-乙酸乙酯（3：2）的层析缸中，待展开剂上升至规定高度时，取出层析板在空气中晾干，用铅笔做出标记，测量各色斑及溶剂前沿到原点的距离，并计算比移值Rf。 3、柱层析：

在层析柱下端塞入少许脱脂棉，称取8g硅胶加入30 mL的石油醚进行搅拌后小心加入层析柱中，小心打开柱下旋塞，保持石油醚高度不变，留下的硅胶在柱子中堆积。必要时用洗耳球在层析柱的周围敲击，使吸附剂填装地更平整致密。柱中溶剂面，由下端旋塞控制，不使溢满，更不能让溶剂液面低于硅胶表面。装完后，打开下端旋塞，放出溶剂，直到硅胶表面剩下1-2 mm高为止（任何情况下，硅胶表面不得露出液面）。在硅胶上面小心的加入少量石英砂。将干燥后的萃取液倾壁法导入100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩至剩余约1 mL时，将浓缩液小心地从柱顶部加入。加完后打开活塞，让液面下降到柱中砂层，关闭活塞，加几滴石油醚冲洗内壁，打开活塞，使液面下降如前。在柱顶小心加入约1.5-2 cm高度的石油醚-乙酸乙酯（5：1）洗脱剂，层析即开始进行。当第一个有色成分即将滴出时，另取一洁净的锥形瓶收集，得黄色溶液，即胡萝卜素。（溶剂10 mL）。将洗脱剂换成3：1的石油醚-乙酸乙酯混合液(溶剂：20 mL)，继续洗脱可得到第二色带的黄绿色溶液，即叶绿素a。然后再用3：2的石油醚-乙酸乙酯(溶剂：10 mL)进行洗脱，继续洗脱后可得到叶黄素。

五、实验数据记录

溶剂前沿至原点中心的距离/cm:

菠菜叶片色素色谱分析数据

编号 颜色 溶质的最高浓度中心至 原点中心的距离 1 2 3 4 5 六、注意事项

1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。

2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于硅胶的表面。

3、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。

七、思考与讨论

1. 薄层的展开为什么要在密闭容器中？

2. 点样时如样品斑点过大有什么坏处？若将样品斑点浸入展开剂中会有什么后果？ 3. 比较叶绿素、胡萝卜素、叶黄素三种色素的极性，说明为什么胡萝卜素在氧化铝中移动最快？

4. 常用的薄层色谱的显色剂有哪些？

Rf值