3株酿酒酵母发酵过程中游离氨基酸含量变化分析
作者：裴芳艺 薛迪 马岩石 刘宇超 刘得水 李慧 刘韩
来源：《农学学报》2021年第06期
摘要：为了进一步研究酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）游离氨基酸丰富的生物学功能，以适应对新型S. cerevisiae食品资源的开发应用。本研究以3株S. cerevisiae为出发菌株，利用全自动氨基酸分析仪对S. cerevisiae发酵过程中游离氨基酸的组成及含量进行了测定与分析。结果表明：3株S. cerevisiae发酵液中均含有17种游离氨基酸，但游离氨基酸组成和含量存在明显差异。发酵末期，S. cerevisiae P1发酵液中的游离氨基酸总量最高，而S. cerevisiae 32788发酵液中必需氨基酸含量最高。S. cerevisiae 1946发酵体系中，游离氨基酸的含量先增加后减少，在发酵末期，游离氨基酸总量和必需氨基酸含量均低于另外2种S. cerevisiae。本研究结果为S. cerevisiae的营养价值评价以及为S. cerevisiae功能食品的研究提供一定的科学依据。
关键词：酿酒酵母；发酵培养；游离氨基酸；必需氨基酸；含量
中图分类号：S182文献标志码：A论文编号：cjas20191200319
Free Amino Acids in 3 Saccharomyces cerevisiae During Fermentation Culture： Content Analysis
Pei Fangyi， Xue Di， Ma Yanshi， Liu Yuchao， Liu Deshui， Li Hui， Liu Han
（Qiqihar Medical University， Qiqihar 161000， Heilongjiang， China）
Abstract： To further study the biological function of free amino acids of Saccharomyces cerevisiae and adapt to the development and application of new S. cerevisiae food resources， the composition and contents of free amino acids produced by three S. cerevisiae were analyzed with a fully automated amino acid analyzer. The results showed that， 17 kinds of free amino acids were found in the three S. cerevisiae fermentation broths， but there were significant differences in the composition and content of free amino acids. At the end of the fermentation， the total amount of free amino acids in the S. cerevisiae P1 fermentation broth was the highest. The S. cerevisiae 32788 fermentation broth had the highest essential amino acid content. The content of free amino acid increased first and then decreased with the fermentation time in the S. cerevisiae 1946. At the end of fermentation， the total amount of free amino acids and essential amino acids were lower than the other two S. cerevisiae. This study
provides a basis for nutritional value evaluation of S. cerevisia and further study on S. cerevisia functional foods.
Keywords： Saccharomyces cerevisiae； Fermentation Culture； Free Amino Acids； Essential Amino Acid； Content
0引言
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种单细胞生物，安全无致病性，培养条件简单[1]，能够在基本培养基上生长，且生长繁殖迅速，代谢旺盛，碳源消耗速率快，能够耐受较低的pH环境[2]，可以在严格的厌氧条件和较低的pH环境下生长[3]，同时，它对底物和产物耐受性较强，对环境压力抗性较高，不易受到细菌等杂菌的污染[4]。作为传统和现代生物技术领域非常重要的工业微生物，S. cerevisiae在医药、精细化工、生物能源、工业酶制剂、饲料添加剂以及发酵食品等生物质产品的生产中得到广泛应用[5-6]。
氨基酸是人类医药、保健品和多种动物饲料添加剂的重要原料，在新陈代谢、生长以及风味形成上具有重要作用[7]。此外，在动植物中氨基酸还可作为信号分子，参与细胞的繁殖、凋亡及信号传导等[8-10]。酵母发酵过程中主要可同化的含氮物为游离氨基酸（free amino acid， FAA），它在酵母菌的生长、碳源消耗和防止发酵停滞等方面起着重要作用[11]，它不仅是合成风味化合物的重要前体物，也作为酵母菌的重要氮源物质，发挥着重要的生物学功能[12]。FAA在临床医疗和药用上也超过蛋白质氨基酸[13]，具有重要的生物功效和药用价值。有部分氨基酸在动物体内不能合成或合成速度远不能达
到机体的需要，必需由食物蛋白供给，这些氨基酸称为必需氨基酸，但微生物和植物能在体内合成所有的氨基酸[14-15]。因此，探究S. cerevisiae发酵过程中的游离氨基酸种类和含量变化，对利用S. cerevisiae作为食品添加剂和饲料补充剂具有重要的意义。
目前主要采用光谱法、液相色谱法和全自动氨基酸分析仪进行氨基酸含量检测[16]，相对于液相色谱检测法来说，采用全自动氨基酸分析仪检测氨基酸含量不仅具有较高的灵敏度，而且具有较低的检出限和较好的重现性[17]。因此，本研究对3株不同的S. cerevisiae发酵液进行酸处理，利用全自动氨基酸分析仪测定菌株发酵过程中游离氨基酸种类和含量的变化，为S. cerevisiae食品的制备与开发奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1菌株S.cerevisiae P1：自行分离鉴定；S. cerevisiae 32788（CICC 32788）、S.cerevisiae 1946（CICC 1946）：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.1.2试剂氨基酸分析试剂BUFFER A-1、BUFFER B-1、钠钾缓冲液、再生液D、还原剂、茚三酮、样品稀释液、混合酸分析标样：分析纯，赛卡姆（北京）科学仪器有限公司。
1.1.3培养基YPD液体培养基（HB5193-1）、YPD固体培养基（HB5193）均购自青岛海博生物技术有限公司。
单碳源发酵培养基：酵母提取物5 g，葡萄糖80 g，KH2PO4 2.5 g，（NH4）2SO4 2.5 g，CaCl2 0.25 g，MgSO4· 7H2O 0.25 g，pH 5.0，用于S. cerevisiae发酵培养。
1.1.4主要仪器设备S-433D型全自动氨基酸分析仪，德国SYKAM（赛卡姆）公司；V-5000型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；FE28型pH计：梅特勒-托利多集团。
1.2方法
1.2.1菌株活化将菌株S. cerevisiae P1、32788和1946分别三区划线于YPD固体培养基上，30℃、倒置培养48 h后，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，制备种子液。
1.2.2发酵培养以5% （v/v）的接种量将种子液接种于单碳源发酵培养基中，30℃、200 r/min振荡培养60 h，每隔6 h取样，测定发酵液的pH及OD600值。
1.2.3氨基酸的测定氨基酸测定方法依据GB/T 5009.124—2016。
2结果
2.1 S. cerevisiae生长变化
3株S. cerevisiae发酵过程OD600值变化如图1所示，随着发酵的进行，
OD600值先急速增加后保持平稳，其中S. cerevisiae 32788生长速度较为缓慢。在发酵0～18 h期间，S. cerevisiae P1的生长速度显著高于S. cerevisiae 1946和S. cerevisiae 32788 （P0.05），但均显著高于S. cerevisiae 32788（P< 0.05）。
2.2 S. cerevisiae发酵过程中pH变化
3种S. cerevisiae发酵过程pH变化如图2所示，随着发酵时间的延长，pH呈现先急速下降后保持稳定的趋势。在发酵18 h时，3株S. cerevisiae的酸碱度分别为pH 3.23±0.03 （S. cerevisiae P1）、pH 3.25±0.01（S. cerevisiae 1946）和pH
3.16±0.02 （S. cerevisiae 32788），彼此之间无显著差异（P>0.05）。虽然3株S. cerevisiae的生长状态存在差异，但有机酸的产生速度和含量相似。由此可见，S. cerevisiae 32788在低生长状态下依然能够产生大量的有机酸，促使发酵体系正常进行。
2.3 S. cerevisiae發酵过程中游离氨基酸变化
图3为3株S. cerevisiae发酵60 h时氨基酸分析色谱图，每个样品均检测到17种氨基酸的高度峰，可以看出氨基酸峰分离效果良好。3株S. cerevisiae发酵过程游离氨基酸含量变化如图4所示，随着发酵时间的延长，S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788游离氨基酸含量呈现先升高后保持稳定的趋势，在发酵24 h时，游离氨基酸含量
分别为4.52±0.12mg/L和4.37±0.24mg/L，之后趋于稳定。S. cerevisiae 1946中游离氨基酸含量则呈现先升高后降低的趋势，在发酵18 h时，达到最高值，为5.79±0.17 mg/L，在发酵末期为4.13±0.16 mg/L，显著低于另外两株S. cerevisiae （P
2.4 S. cerevisiae发酵末期游离氨基酸含量
发酵60 h时，3株S. cerevisiae中17种游离氨基酸含量如表1所示，在S. cerevisiae 1946中，除丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的含量稍高于其余2种S. cerevisiae外，其余14种游离氨基酸的含量均低于其余2种S. cerevisiae。对比S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788，发现在S. cerevisiae P1中，除了酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和脯氨酸外，其余12种游离氨基酸的含量均低于S. cerevisiae 32788。3株S. cerevisiae发酵液中含有8种人体所需的必需氨基酸，其含量从高到低依次为S. cerevisiae 32788 （1.73186 mg/L）、S. cerevisiae P1 （1.70335 mg/L）、S. cerevisiae 1946（1.52058 mg/L）。虽然S. cerevisiae P1中，17种游离氨基酸的总量最高，但8种必须氨基酸的含量要少于S. cerevisiae 32788。
目前主要采用光谱法、液相色谱法和全自动氨基酸分析仪进行氨基酸含量检测[16]，相对于液相色谱检测法来说，采用全自动氨基酸分析仪检测氨基酸含量不仅具有较高的灵敏度，而且具有较低的检出限和较好的重现性[17]。因此，本研究对3株不同的S. cerevisiae发酵液进行酸处理，利用全自动氨基酸分析仪测定菌株发酵过程中游离氨基酸种类和含量的变化，为S. cerevisiae食品的制备与开发奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1菌株S.cerevisiae P1：自行分离鉴定；S. cerevisiae 32788（CICC 32788）、S.cerevisiae 1946（CICC 1946）：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.1.2试剂氨基酸分析试剂BUFFER A-1、BUFFER B-1、钠钾缓冲液、再生液D、还原剂、茚三酮、样品稀释液、混合酸分析标样：分析纯，赛卡姆（北京）科学仪器有限公司。
1.1.3培养基YPD液体培养基（HB5193-1）、YPD固体培养基（HB5193）均购自青岛海博生物技术有限公司。
单碳源发酵培养基：酵母提取物5 g，葡萄糖80 g，KH2PO4 2.5 g，（NH4）2SO4 2.5 g，CaCl2 0.25 g，MgSO4· 7H2O 0.25 g，pH 5.0，用于S. cerevisiae发酵培养。
1.1.4主要仪器设备S-433D型全自动氨基酸分析仪，德国SYKAM（赛卡姆）公司；V-5000型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；FE28型pH计：梅特勒-托利多集团。
1.2方法
1.2.1菌株活化将菌株S. cerevisiae P1、32788和1946分别三区划线于YPD固
体培养基上，30℃、倒置培养48 h后，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，制备种子液。
1.2.2发酵培养以5% （v/v）的接种量将种子液接种于单碳源发酵培养基中，30℃、200 r/min振荡培养60 h，每隔6 h取样，测定发酵液的pH及OD600值。
1.2.3氨基酸的测定氨基酸测定方法依据GB/T 5009.124—2016。
2结果
2.1 S. cerevisiae生长变化
3株S. cerevisiae发酵过程OD600值变化如图1所示，随着发酵的进行，OD600值先急速增加后保持平稳，其中S. cerevisiae 32788生长速度较为缓慢。在发酵0～18 h期间，S. cerevisiae P1的生长速度显著高于S. cerevisiae 1946和S. cerevisiae 32788 （P0.05），但均显著高于S. cerevisiae 32788（P< 0.05）。
2.2 S. cerevisiae发酵过程中pH变化
3种S. cerevisiae发酵过程pH变化如图2所示，随着发酵时间的延长，pH呈现先急速下降后保持稳定的趋势。在发酵18 h时，3株S. cerevisiae的酸碱度分别为pH 3.23±0.03 （S. cerevisiae P1）、pH 3.25±0.01（S. cerevisiae 1946）和pH 3.16±0.02 （S. cerevisiae 32788），彼此之间无显著差异（P>0.05）。虽然3株S. cerevisiae的生长状态存在差异，但有机酸的产生速度和含量相似。由此可见，S. cerevisiae 32788在低生长状态下依然能够产生大量的有机酸，促使发酵体系正常进行。
2.3 S. cerevisiae发酵过程中游离氨基酸变化
图3为3株S. cerevisiae发酵60 h时氨基酸分析色谱图，每个样品均检测到17种氨基酸的高度峰，可以看出氨基酸峰分离效果良好。3株S. cerevisiae发酵过程游离氨基酸含量变化如图4所示，随着发酵时间的延长，S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788游离氨基酸含量呈现先升高后保持稳定的趋势，在发酵24 h时，游离氨基酸含量分别为4.52±0.12mg/L和4.37±0.24mg/L，之后趋于稳定。S. cerevisiae 1946中游离氨基酸含量则呈现先升高后降低的趋势，在发酵18 h时，达到最高值，为5.79±0.17 mg/L，在发酵末期为4.13±0.16 mg/L，显著低于另外两株S. cerevisiae （P
2.4 S. cerevisiae发酵末期游离氨基酸含量
发酵60 h时，3株S. cerevisiae中17种游离氨基酸含量如表1所示，在S. cerevisiae 1946中，除丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的含量稍高于其余2种S. cerevisiae外，其余14种游离氨基酸的含量均低于其余2种S. cerevisiae。对比S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788，发现在S. cerevisiae P1中，除了酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和脯氨酸外，其余12种游离氨基酸的含量均低于S. cerevisiae 32788。3株S. cerevisiae发酵液中含有8种人体所需的必需氨基酸，其含量从高到低依次为S. cerevisiae 32788 （1.73186 mg/L）、S. cerevisiae P1 （1.70335 mg/L）、S. cerevisiae 1946（1.52058 mg/L）。虽然S. cerevisiae P1中，17种游离氨基酸的总量最高，但8种必须氨基酸的含量要少于S. cerevisiae 32788。
目前主要采用光谱法、液相色谱法和全自动氨基酸分析仪进行氨基酸含量检测[16]，相对于液相色谱检测法来说，采用全自动氨基酸分析仪检测氨基酸含量不仅具有较高的灵敏度，而且具有较低的检出限和较好的重现性[17]。因此，本研究对3株不同的S. cerevisiae发酵液进行酸处理，利用全自动氨基酸分析仪测定菌株发酵过程中游离氨基酸种类和含量的变化，为S. cerevisiae食品的制备与开发奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1菌株S.cerevisiae P1：自行分离鉴定；S. cerevisiae 32788（CICC
32788）、S.cerevisiae 1946（CICC 1946）：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.1.2试剂氨基酸分析试剂BUFFER A-1、BUFFER B-1、钠钾缓冲液、再生液D、还原剂、茚三酮、样品稀释液、混合酸分析标样：分析纯，赛卡姆（北京）科学仪器有限公司。
1.1.3培养基YPD液体培养基（HB5193-1）、YPD固体培养基（HB5193）均购自青岛海博生物技术有限公司。
单碳源发酵培养基：酵母提取物5 g，葡萄糖80 g，KH2PO4 2.5 g，（NH4）2SO4 2.5 g，CaCl2 0.25 g，MgSO4· 7H2O 0.25 g，pH 5.0，用于S. cerevisiae发酵培养。
1.1.4主要仪器设备S-433D型全自动氨基酸分析仪，德国SYKAM（赛卡姆）公司；V-5000型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；FE28型pH计：梅特勒-托利多集团。
1.2方法
1.2.1菌株活化将菌株S. cerevisiae P1、32788和1946分别三区划线于YPD固体培养基上，30℃、倒置培养48 h后，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，制备种子液。
1.2.2发酵培养以5% （v/v）的接种量将种子液接种于单碳源发酵培养基中，30℃、200 r/min振荡培养60 h，每隔6 h取样，测定发酵液的pH及OD600值。
1.2.3氨基酸的测定氨基酸测定方法依据GB/T 5009.124—2016。
2结果
2.1 S. cerevisiae生长变化
3株S. cerevisiae发酵过程OD600值变化如图1所示，随着发酵的进行，OD600值先急速增加后保持平稳，其中S. cerevisiae 32788生长速度较为缓慢。在发酵0～18 h期间，S. cerevisiae P1的生长速度显著高于S. cerevisiae 1946和S. cerevisiae 32788 （P0.05），但均显著高于S. cerevisiae 32788（P< 0.05）。
2.2 S. cerevisiae发酵过程中pH变化
3种S. cerevisiae发酵过程pH变化如图2所示，随着发酵时间的延长，pH呈现先急速下降后保持稳定的趋势。在发酵18 h时，3株S. cerevisiae的酸碱度分别为pH 3.23±0.03 （S. cerevisiae P1）、pH 3.25±0.01（S. cerevisiae 1946）和pH 3.16±0.02 （S. cerevisiae 32788），彼此之间无显著差异（P>0.05）。虽然3株S. cerevisiae的生长状态存在差异，但有机酸的产生速度和含量相似。由此可见，S. cerevisiae 32788在低生长状态下依然能够产生大量的有机酸，促使发酵体系正常进行。
2.3 S. cerevisiae发酵过程中游离氨基酸变化
图3为3株S. cerevisiae发酵60 h时氨基酸分析色谱图，每个样品均检测到17种氨基酸的高度峰，可以看出氨基酸峰分离效果良好。3株S. cerevisiae发酵过程游离氨基酸含量变化如图4所示，随着发酵时间的延长，S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788游离氨基酸含量呈现先升高后保持稳定的趋势，在发酵24 h时，游离氨基酸含量分别为4.52±0.12mg/L和4.37±0.24mg/L，之后趋于稳定。S. cerevisiae 1946中游离氨基酸含量则呈现先升高后降低的趋势，在发酵18 h时，达到最高值，为5.79±0.17 mg/L，在发酵末期为4.13±0.16 mg/L，顯著低于另外两株S. cerevisiae （P
2.4 S. cerevisiae发酵末期游离氨基酸含量
发酵60 h时，3株S. cerevisiae中17种游离氨基酸含量如表1所示，在S. cerevisiae 1946中，除丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的含量稍高于其余2种S. cerevisiae外，其余14种游离氨基酸的含量均低于其余2种S. cerevisiae。对比S. cerevisiae P1和S. cerevisiae 32788，发现在S. cerevisiae P1中，除了酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和脯氨酸外，其余12种游离氨基酸的含量均低于S. cerevisiae 32788。3株S. cerevisiae发酵液中含有8种人体所需的必需氨基酸，其含量从高到低依次为S. cerevisiae 32788 （1.73186 mg/L）、S. cerevisiae P1 （1.70335 mg/L）、S. cerevisiae 1946（1.52058 mg/L）。虽然S. cerevisiae P1中，17种游离氨基酸的总量最高，但8种必须氨基酸的含量要少于S. cerevisiae 32788。
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