花青素的纯化方法

发布网友 发布时间：2022-04-22 19:12

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热心网友 时间：2023-10-25 20:24

原花青素(简称PC)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物。植物化学家通常将从植物中 分离得到的一切无色的，在无机酸存在和加热处理下能产生红色的花青素(cyanidin)的一类多酚化 合物统称为原花青素。从20世纪60年代初至今，原花青素抗氧化、清除自由基等一系列化学反应已 被初步揭示，这类天然产物在医药、食品、日用化 学品等领域的应用日益广阔。全世界对原花青素的研究越来越深入，其中对原花青素提取、分离、纯 化方法的研究是一大重点，现将原花青素提取、分 离、纯化方法综述如下。

1 原花青素的提取方法

植物材料中原花青素的提取率与材料的状况和 提取条件密切相关。植物材料的贮存、干燥、粉碎 度，提取溶剂、温度等都可能导致原花青素化学结 构的变化和提取率的改变，从而改变原花青素的理化性质和生物活性.

当测定原材料中的原花青素含量时，贮存时间 越长，可能会导致测定结果降低。同时样品中的水 分含量也会导致测定结果降低。而且干燥条件的不 同也会导致提取率的变化，最好是采用冷冻干燥， 避免高温。

样品提取前一般要经过粉碎，通常较细的粉末 有利于提取，但过细时提取率反而会降低。

提取剂的选择也是影响提取率的关键因素。因 为原花青素在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢 键和疏水键形式形成稳定的分子复合物，原花青素 分子间也是如此。因此原花青素的提取剂，不仅要 求对其有很好的溶解性，而且还必须有氢键断裂作 用。因此有机溶剂和水的复合体系(有机溶剂占总 体积的50％～70％)最适合提取。有机溶剂的提 取能力顺序为丙醇<乙醇<甲醇<丙酮<四氢呋喃，其中应用较多的是丙酮一水体系和甲醇一水体 系。

当植物样品中铁等金属离子含量较大时，原花 青素在中性条件下与金属离子发生络合沉淀，沉积 在纤维中不利于提取。此时也必须采用酸化溶剂， 一方面断裂原花青素与蛋白质、多糖及本身离子间 的氢键和疏水键，另一方面断裂原花青素一金属离 子络合键，提高提取率。

1．1 传统有机溶剂提取

Ayroles等在1991年发明酮类化合物水溶液作 提取剂提取银杏叶中的原花青素的方法。采用酮类化合物的水溶液作提取剂，提取液过滤后，用碱调 节滤液pH值至9左右，使原花青素沉淀，再用酸 调节滤液至pH值为2左右，在(NH4) SO 存在条件下用c ～c 酮类萃取滤液中的原花青素，除去酮类 化合物，干燥。

Romanczyk等发明从可可中提取原花青素时， 对脱脂可可豆用质量分数70％MeOH／去离子水提 取后，再用质量分数70％丙酮／去离子水溶剂提取 2次，真空浓缩，除去有机溶剂后，再溶于水中， 用CHC1，提取，其水相用乙酸乙酯提取后，真空浓 缩除去乙酸乙酯，水相冷冻干燥，得到原花青素。

1．2 绿色溶剂—— 水提取技术

由于丙酮等有机溶剂可能带来环境污染和产品 的有毒有机物残留，人们在大力发展对环境友好的绿色提取技术。1998年Duncan和Gilmour发明一 种从植物材料(树皮、树叶、葡萄籽、皮、大豆、绿茶)中提取原花青素的方法。将材料粉碎(≤15 mm)，常压、60℃～100℃或高压100℃～125℃条 件下采用脱氧热水提取(1 min～20 h)，过滤采用超滤 或反渗透或两者连用，浓缩滤液，真空喷雾或冷冻 干燥，此法主要是提取分子量≤5 000 D的水溶性原花青素，得率为0．5％～10．0％之间，通常为6．5％ 一9．6％ (随取样部位的差异而定)，分离得到原花 青素B 、B，、B 和c 。获得的产物对AAPH引发 的亚油酸的氧化有明显抑制作用，1肛g／mL能达 到70％～79％的抑制率。毒理学检测表明：对于按人体重剂量给药组和100倍人体重量的剂量给药组 24 h内无毒害和副作用产生，慢性毒理学(5个月) 实验也无明显毒、副作用。

1999年Karim等人发明了在加压条件下，采用 脱氧去离子水提取植物材料中的原花青素。将提取 液超滤后，采用疏水性微孔聚合物树脂作填料的柱 色谱方法，选用极性洗脱液(乙醇+水)洗脱，将 洗脱液采用反渗透方法除去乙醇，干燥得到原花青素。

1．3 超临界流体萃取技术

孙传经等发明一种采用超临界二氧化碳加丙酮 和水组成的极性改性剂，从银杏叶中萃取含有原花青素提取物的方法。在萃取温度60℃～90℃，萃取 压力20 MPa～35 MPa下加入丙酮与水的体积比为 (50％～80％)：(50％～20％)的极性改性剂，萃 取时向2 h-4 h，进行静态、动态萃取。萃取液经传统的树脂浓缩和喷雾干燥器干燥，得到精制银杏叶 提取物。产品含银杏黄酮甙>35 g／100 g，萜内酯> 8 g／100 g，原花青素<7 g／100 g，酚酸<5 mg／kg。该法的优点是流程短，能萃取最强的天然抗氧化剂原花青素。2000年孙传经等又发明一种超临界CO 从黑加仑籽中提取黑加仑籽油和原花青素低聚物的方法。该法分两步进行：第一步，是利用超临界 CO 提取黑加仑籽油，控制萃取压力在25 MPa一 29 MPa，温度为60℃ ；第二步是超临界CO2加人 丙酮与水的体积比为70：30的改性剂，CO 与改性 剂流量体积比为4：1，压力为22 MPa～25 MPa，温度为60℃，提取原花青素低聚物。黑加仑籽油得 率为16％，原花青素低聚物得率为4％。该法优 点是同时获得两种产品，流程简单可靠，CO 和改 性剂循环利用，产品中无溶剂残留，对环境无污 染。

1．4 微波提取技术

刘征涛等发明了一种采用频率为2450 MHz或 915 MHz、功率为500 W～15 000 W 的微波对葡萄籽 在选用水、碳链长为C ～C，的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶剂中进行处理，从葡 萄籽提取原花青素类物质的新方法。该方法较常规 化学法工艺简便、高效、快速，成本低，废液排放 量少。

1．5 双水相萃取方法

自1956年瑞典伦德大学的Albertsson发现双水 相体系到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多 年历史，但由于其条件温和，容易放大，目前已成 功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离纯化。近几年来，有关双水相萃取技术提取中草药 有效成分的文献开始报道，尽管数量不多，但是已 有的实例充分表明其有良好的应用前景。用双水相萃取体系富集分离银杏叶浸提液的研究，表现良好 的分配系数和分离效果。研究认为双水相体系具有 分相快，使用温度低，易于操作等待点，且所使用的PEG及盐类对人体及环境无毒害，萃取率高，为 银杏黄酮化合物富集分离的一种有效方法。尽管双 水相萃取对中草药提取研究的应用处于起步阶段，这一技术的应用有望为从天然产物中提取有效成分 提供一个新的思路。

2 原花青素的纯化、分离

2．1 液相萃取法

原花青素的纯化多采用乙酸乙酯、甲苯、二氯 甲烷、醚等多级有机溶剂通过液相萃取的方法进行，这类方法因为有机溶剂用量大，对环境可能带 来污染，同时也容易造成产品中有毒有机物残留。

2-2 柱层析法

目前常采用的纯化方法多用柱层析法进行。王 建清等对大麦中的原花青素丙酮提取液，采用 PVPP树脂作柱层析的填料，以CH CN作流动相进 行纯化。

Ricardo da silva等将葡萄用甲醇提取，提取液 回收甲醇后，通过聚酰胺柱进行初步分离，先用中 性水洗去酚酸，再用体积比30：70的乙腈／水洗脱 儿茶素，再用体积比75：25丙酮水洗脱原花青素， 进行纯化。

刘睿等采用大孔树脂对高粱中的原花青素用乙醇 的水溶液进行纯化，得到产物纯度大于95 g／100 g的 低聚体原花青素。

2．3 固相萃取法

从复杂体系中选择性地萃取所需成分，固相萃 取(SPE)是其中最为有效的方法之一。1999年 Lazarus等人对杏仁皮、葡萄汁和红葡萄酒中的原花 青素采用SPE方法进行纯化，条件：supelcosil Envi一18 20mL SPE柱，流动相：丙酮：水：乙酸= 70：29．5：0．5 (体积比)。Kennedy和Waterhouse 对红葡萄酒中的原花青素采用c一18柱(Alhech)， 流动相：水和甲醇。洗脱除去有机酸、糖类和其他 不溶于有机相中的化合物而将提取得到的原花青素 进行纯化。

2，4 凝胶色谱法

凝胶色谱也常用于原花青素的纯化。 SephadexLH一20是一种对黄酮类化合物具有高度亲 和性的羟丙基化葡聚糖凝胶，Sephadex LH一20凝 胶色谱目前多用于原花青素的纯化和分离。但 Sephadex LH一20凝胶的物理特性决定其并不能对原花青素进行高效率分离。所以进一步的纯化和分离 要采用凝胶过滤色谱或HPLC进行。

此外，Sepherdex 75HR作为平均粒度为13 m 的葡聚糖聚合物，也用于原花青素的纯化、分离， 其能承受超过1．8 MPa的反压，尽管这种材料的商业 柱通常用于蛋白质的分离，发现其分离原花青素的 能力优于Sephadex LH一20。McMurrough和Madigan 将大麦提取液浓缩后，直接采用高效凝胶过滤色谱 (Sepherdex 75HR)，用甲醇洗脱，根据uV检测， 收集洗脱物，用DMACA鉴定每个组分。Escribano— Bail 6 n et al采用Sephadex LH一20和半制备RP—HPLC对葡萄籽中的原花青素进行纯化。

Rigaud等对可可和葡萄籽的提取物，采用凝胶 渗透色谱(GPC)TSK G 2500 Hxl和TSK G3000 Hxl， 采用四氢呋喃(流速1 mL／min)洗脱进行纯化。

2．5 微生物发酵法

Ariga等发明一种由活性酵母，可将用水和有 机溶剂提取得到的提取物中的淀粉发酵除去而达到 纯化原花青素的目的；同时还发现纯化的原花青素 中金属离子也能较好的被除去，如果提取剂是水和 水／乙醇，能直接浓缩后发酵，若提取剂是丙酮， 则要除去丙酮后才能进行发酵。常用的酵母有：葡 萄酒酵母、酵母属和接枝酵母属的菌株。

2．6 高速逆流色谱法

高速逆流色谱技术由美国国家医学院Ito Yiochiro 博士20世纪60年代首创，最初是一种制备型色谱技术，是一种不用固体载体或支撑体的液液分配色 谱，主要根据化合物在不相溶的两相间的分配能力 进行分离，具有分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大，溶剂消耗 少，而且操作条件简单(室温、Teflon惰性柱材) 的特点。目前已被广泛用于天然药物材料的制备和分析。

目前高速逆流色谱仪已成功开发出分析型和制 备型两大系列。即高速逆流色谱仪既可用于天然药 物成分的制备分离，又可定量。进样量从几毫克到克，进样体积从几毫升到几十毫升，不但适于非极 性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，既 适合于天然产物功效成分的粗分，也可进一步精制、纯化。

2-7 分子烙印技术

分子烙印技术(molecular imprinting technology， MIT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术，由于MIT模仿了生物界的锁匙作用原理，使制备的 材料具有极高的选择性，因而很快在许多相关领域 如手性分离和底物选择性分离、固相萃取、化学或生物传感器、不对称催化和模拟酶等方面得到了应 用。在普通分离方面，较之传统方法，MIT法具有 高效、快速、专一的优点。MIT法在手性分离方面的作用更是无与伦比。据统计，现有药物60％具 有一个或一个以上的手性中心，而对映体间的药效 及对人体影响有很大不同，因此1992年美国食品和药物管理局规定，今后含不对称中心的药物必须 将光学异构体分离开。相对于传统方法的一筹莫展，MIT法就显得非常珍贵了。P>

周力等人在2002年制备了以槲皮素为模板的 分子烙印聚合物(MIP)，从沙棘粗提物中分离提取槲皮素和异鼠李素两种黄酮，得到良好的分离效果。 谢建春等用非共价法，在极性溶剂中、以丙烯酰胺 作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了分子烙印聚合物(MIP)。液相色谱实验表明，MIP 对懈皮素具有特异的亲合性，将此MIP直接分离银杏叶提取物水解液，得到主要含模板槲皮素及与槲 皮素结构相似化合物山奈酚两种黄酮的组分。研究 证实了MIP技术用于直接分离、提取中草药中具有特定药效化合物的可行性。

参考资料：http://www.tcmtcm.com/OPC/200810150937508386.htm

热心网友 时间：2023-10-25 20:25

　　微波提取技术
　　一种采用频率为2450 MHz或 915 MHz、功率为500 W～15 000 W 的微波对葡萄籽 在选用水、碳链长为C ～C，的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶剂中进行处理，从葡 萄籽提取原花青素类物质的新方法。该方法较常规 化学法工艺简便、高效、快速，成本低，废液排放 量少。
　　花青素是一种水溶性色素，可以随着细胞液的酸碱改变颜色。细胞液呈酸性则偏红，细胞液呈碱性则偏蓝。花青素(anthocyanidin)是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色。花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授粉和种子传播 (Stintzing and Carle, 2004)。常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层。部分果实以颜色深浅决定果实市场价格。