细胞培养技术介绍
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发布时间：2024-10-06 05:10
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时间：2024-10-08 12:49
一、细胞培养的条件与要求
在细胞培养过程中，首先必须确保所有与细胞接触的设备、器材和溶液等均保持绝对无菌，以防止细胞外微生物的污染。高压蒸汽灭菌是目前最可靠和最常用的灭菌方法，适用于玻璃制品、布类、金属制品、培养用液、染菌物品和动物尸体等的灭菌。对于不适于加热灭菌的液体，如人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，则可采用过滤法除菌。另外，必须提供足够的营养供应，避免有害物质，尤其是极微量的有害离子的掺入。器材的清洗和配液用水的质量直接影响细胞培养的成败，对水的质量要求极高。
氧气供应对于细胞代谢至关重要，必须保证适量的氧气供应。在静止或旋转培养中，培养的液体量不超过总容量的30%，通过与液面的空气交换或通气，可以保证细胞有足够的氧气供应。深层培养时，必须采用含5％CO2的空气，或根据需要将CO2、N2、O2和空气以不同比例混合，以保持适宜的气体环境。过量的氧对细胞的生长不利。
细胞代谢过程中会产生大量代谢废物，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等，这些产物对细胞的生存有害。因此，必须及时清除这些有害产物，以维持细胞的健康状态。在小量培养时，可通过观察指示剂颜色的变化，如培养基中酚红指示剂显示黄色，表示乳酸产生，需及时更换新鲜的培养基。在大量培养时，则需随时测定葡萄糖和乳酸等含量，并调节灌流速度，以保持代谢产物处于无害水平。
保持良好的外界环境对细胞生长至关重要，这包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。不同细胞对pH的要求不同，适于细胞生长的pH范围一般在6.8～7.4。乳酸等代谢产物会使培养的pH下降，需在培养液内加入缓冲系统，如Na2HPO4/Na2HPO4、NaHCO3/H2CO3（CO2）、Tricineglycine，或使用Hepes液（常用浓度为10～50mol/L），以维持培养液的pH稳定。
保持适宜的细胞密度和及时分种是细胞培养的另一个关键因素。细胞密度过高会导致细胞竞争加剧，影响细胞的生长和代谢。因此，应根据细胞的具体特性进行适时的分种。
二、细胞分离
细胞分离是细胞培养过程中的重要步骤，不同的细胞来源决定了分离方法。人白细胞主要用于IFN-α和γ的制备，常来源于献血者的静脉血、手术时体外循环剩余血、分娩时脐带血、脾脏和扁桃体等组织。人胚肌皮细胞则用于IFN-β的制备，其分离过程需仔细操作，以确保细胞的纯度和活性。
三、体外培养细胞龄的计算
细胞龄的计算对于细胞培养的管理和质量控制至关重要。二倍体细胞龄通过细胞群体倍增来计算，每增加一倍作为一世代，如1瓶细胞传2瓶（1：2分种率）再长满瓶为一世代，以此类推。在大量培养时，需定期测定葡萄糖和乳酸等代谢产物的含量，并调整灌流速度，以保持代谢产物处于无害水平。传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，确保细胞质量及安全。细胞龄在细胞寿命期限的前2/3内，以确保细胞的活性和生长状态。
四、细胞鉴别试验
新建细胞系或株、细胞库和生产结束时的细胞应进行鉴别试验，以确认细胞的来源和特性。鉴别试验可采用遗传特征、DNA指纹图谱、染色体标记、免疫学、HLA和生化法（如同功酶）等方法，任选其中一种或几种方法。常用的人二倍体细胞株来源于正常人胎肺或其他组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。对于细胞株的要求，包括建立细胞株所用的胎儿的胎龄、性别、终止妊娠原因、父母年龄、职业及健康状况等详细资料，以及原始组织种类、细胞培养的历史、生长特征和寿命的世代数等信息。
五、消化液的配制方法
消化液的配制对于细胞分离和培养至关重要。常用的消化液包括胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胰蛋白酶-柠檬酸盐配方、胰蛋白酶-EDTA溶液等。这些消化液的配制需遵循特定的步骤，包括称量、溶解、高压灭菌、过滤除菌、分装和低温保存等，确保消化液的无菌和活性。
六、细胞计数
细胞计数是细胞培养中的一项基本操作，用于评估细胞的数量和活力。通常采用计数板进行细胞计数，先将细胞悬液适当稀释，然后滴于计数板上盖玻片一端，镜下观察并计算四角大格内的细胞数。通过细胞数/ml的计算公式，可以得出细胞的浓度。此外，还需要使用台盼蓝、苯胺黑或结晶紫-柠檬酸等方法区别细胞的死活。
七、细胞传代
细胞传代分为悬浮细胞传代和贴壁细胞传代。悬浮细胞的传代相对容易，只需增加生长液的量并分种至培养瓶即可。而贴壁细胞则需经过消化后，分种至新的培养瓶中。传代操作需注意细胞的状态和培养条件，以确保细胞的生长和传代效率。
八、细胞的冻存和复苏
细胞的冻存和复苏是细胞长期保存的重要方法。冻存过程中，需逐步降温，以减少冰晶的形成和细胞损伤。复苏时要求快速融化，以避免细胞的损伤。这一过程需要在严格控制的条件下进行，以确保细胞的存活和活力。
九、细胞培养用水处理
细胞培养对水质要求极高，不仅要无微生物污染，还不能有有害离子的存在。通常采用蒸馏和离子交换相结合的方法，最后通过除菌灭菌，以获得高纯度的水。水的电阻值应大于18MΩ，确保细胞培养的无菌和营养供应。
十、选择小牛血清的微量细胞培养检查法
在细胞培养中，小牛血清是最常用的一种动物血清，它为细胞提供生长所需的激素、生长因子、脂类、蛋白和无机物等。在使用前需进行检查，以确保其适用于特定的细胞培养。血清批与批之间质量差异大，可能出现细胞毒性，因此检查血清的质量至关重要。
十一、葡萄糖测定法
葡萄糖测定法是评估细胞生长状态和调节营养补充速度的重要参数。通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）比色法，可以测量葡萄糖的消耗，从而监测细胞的生长情况。此方法简单且精确，是细胞培养中常用的技术之一。
十二、乳酸测定法
乳酸积累是细胞培养过程中的常见现象，它会降低培养基的pH，影响细胞的生长。乳酸测定法通过测量乳酸含量，可以及时了解细胞代谢状态，避免pH的不利影响。此方法包括多种试剂和步骤，确保测量的准确性和可靠性。
十三、细胞培养方式
细胞培养有多种方式，包括静止培养、旋转培养、悬浮培养、微载体培养、巨载体和微囊培养、多孔微球培养、中空纤维培养和灌流培养等。每种方式都有其特定的应用场景，例如静止培养适用于产量较高和细胞质量较好的情况，旋转培养则能更有效地利用培养面积，悬浮培养适合非贴附依赖性细胞，微载体培养适用于贴壁依赖性细胞，而灌流培养则能提高细胞培养密度和细胞产物产量。
