<Snapgene>同源重组法构建质粒图谱
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发布时间：2024-10-24 06:39
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时间：2024-11-06 02:41
参照诺维赞ClonExpress® II One Step Cloning Kit 【C112】同源重组一步克隆法extension://idghocbbahafpfhjnfhpbfbmpegphmmp/assets/pdf/web/viewer.html?file=https%3A%2F%2Fv4.cecdn.yun300.cn%2F100001_2005205005%252FC112%25EF%25BC%2588%25E5%258D%2595%25E9%25A1%25B5%25EF%25BC%25V22.1.pdf
（一）查找目标基因CDS序列
说明：分子克隆需要将目标基因的CDS(coding sequence，编码区)区连接到质粒载体上，因此首先要确定基因的CDS区
方法：以p53为例
（1）打开NCBI( National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)，左边输入框选择Gene，输入待查找基因，例 p53，search
（2）打开该界面，注意要选择对应的种属，如果是人源，选择Homo sapiens，如果是鼠源，选择Mus_musculus，其他种属类似，一定要对应，然后点击基因名称。我选择Mus_musculus，点击画圈中的基因
（3）进入基因详细信息界面，点击右侧的RefSeq数据库
（4）进入NM序列号开头的基因信息界面，通常由于基因有不同的转录本，会有多个NM序列号，一般选择最长的转录本，有时会在箭头所指处进行标注，it is longest isoform，如果没有标注的话拉到该界面上方，基因的Graphics，比较选择最长的转录本
（5）选择好后，点击对应的序列号，进入
（6）一直下拉找到CDS字样，点击进入
（7）点击CDS后，基因的CDS区会标记出来（如图），右下角出现一个灰色框，点击FASTA，进入基因的FASTA格式，此界面保持不变，后续使用snapgene时直接粘贴序列就行
（8）到此为止就找到了基因的CDS序列。用于后续在Snapgene中模拟构建克隆质粒
（二）查找质粒信息
质粒信息查找源：
（1）addgene Addgene: Homepage
（2）NCBI National Center for Biotechnology Information (nih.gov)
（3）实验室保存有质粒文件【文件后缀名为.dna】，可以向师兄师姐询问，一般他们那里都会保存
（4）重要的试剂公司TIANGEN，生工等
（三）Snapgene构建同源重组质粒图谱
（1）导入质粒和目的基因的信息
此步之前应该把目的基因和质粒的信息都保存好了
打开Snapgene，利用新DNA或RNA文件，找到质粒文件打开
或者直接打开后缀名为.dna的质粒文件
打开质粒信息后，再打开新新建，将刚刚找好的目的基因的CDS序列粘贴到空白框，这时snapgene打开两个界面，即质粒和目的基因
（2）确定酶切位点
克隆需要将质粒载体用性内切酶切开，再将片段连到载体上
酶切位点可以选择单酶切（一个酶切开一个口）或者双酶切（两个酶切开两个口），单酶切方便，双酶切需要保证两个酶的发挥活性的buffer和温度大概一致，具体到购置酶的官网查询不同酶切位点的工作条件，或者snapgene也可以查询
但不管是单酶切还是双酶切，酶切位点均不能在目的基因的片段上存在，具体排除方法
snapgene打开目的基因文件，目录栏选择Enzyme酶，下拉项选择无切点内切酶
点击输出，保存文档 .txt，该文档保存的就是片段不会被切掉的，即我们可以选择的酶切位点
打开质粒图谱，在多克隆位点区域选择理想的酶切位点，打开刚刚保存的基因的无切点内切酶 .txt文件，Ctrl+F在文档中查找是否有该酶切位点，有的话就可以用，多试几个，直到找到为止
点击选择好的酶切位点，单酶切选择一个就好，双酶切选择一个，按住ctrl再选择另外一个，功能栏选择action行动，in-fusion 克隆，insert fragment插入片段
点击片段，右上角选择片段来源，已经打开的目的基因文件会出现在下拉项里，因为我们刚刚没有另存p53的文件，这个地方显示的是无标题的.dna，如果之前将p53的CDS信息在snapgene中保存的话这里就会显示p53.dna，没差，我们知道是p53就好，点击进入
在片段这个界面按住ctrl+A，注意图上显示蓝色背景条才行。然后点击产物
出现如图界面，点击右上角选择重叠pcr产物，出现提示框，pcr引物的目标Tm一般50-60℃都可以，默认，重叠我一般选择20bp，下面重叠生成或来自载体上下游的酶切位点可选可不选，设置完后点击选择引物
进入该界面，右下角创建产物。这时候要命名文件方便后续查找，原则是质粒名称+目的基因名称，命名好后点击clone克隆
到这里依据同源重组原则将p53构建到质粒载体上的图谱已经做好啦，可以用于后续测序比对序列
继续，可以导出用于扩增p53基因的引物
刚刚构建好的质粒，点击序列，可以看到标记“片段，正向” 的这个就是用于扩增p53基因的正向引物，双击箭头进入
进入上游引物界面，修改名称信息，同理下游引物也是
命名完成后，点击下栏中引物
ctrl同时选中p53-F和p53-R，点击上栏中copy，这就是带有同源臂的扩增 p53的引物，粘贴到自己的文件中保存用于后续订购引物。
插播：
刚刚构建好的质粒图谱界面，工具栏，选择模拟琼脂糖凝胶电泳，选择质粒，目的基因，以及构建好的重组质粒，点击可以
出现如图左上角的琼脂糖凝胶电泳模拟图，可以命名好保存下来，用于后续开展实验过程中与实际实验进行比对验证。
那么就讲完啦，同源重组方法构建重组质粒的方法还是比较简单的，较于传统的酶切后利用末端连接修复的方法在于酶切位点处20bp左右同源臂的加入，因此利用snapgene构建重组质粒图谱较于传统的多加了些步骤，希望这篇整理有帮助到你，还有疑惑的地方可以评论区仪器讨论~❤
