实验 | 分子克隆实验——无缝克隆
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发布时间：2024-10-24 06:39
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时间：2024-11-06 03:56
无缝克隆原理
在载体末端和引物末端应具有15-25个同源碱基（同源臂）。通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶，三种酶同时发挥功能，从而达到单片段或多片段与载体连接的技术。
T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填补缺口；DNA连接酶：两条DNA 单链黏合起来。
无缝克隆特点
对比传统分子克隆与无缝克隆的实验流程
1. 载备
载体的线性化：酶切（单酶切、双酶切）或反向 PCR 扩增。
酶切制备推荐双酶切方法进行，单酶切则需要去磷酸化；酶切完成后，需失活快速内切酶或将产物进行纯化。
反向 PCR 扩增制备线性化载体需设计载体末端引物，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，使用预线性化的质粒作为模板。
2. 插入片段制备
引物设计原则：使用PCR扩增方法获得目的片段，引物5' 端需包含与其相邻片段末端同源的15~25nt（推荐18nt），以保证扩增产物的5' 端和3' 端分别与相邻片段形成重叠序列。
插入片段正反向扩增引物设计：正向引物包含载体末端正向同源序列、酶切位点和基因特异性序列；反向引物包含基因特异性序列、酶切位点和载体末端反向同源序列。
制作最终序列图谱，可使用在线设计工具或SnapGene软件。
3. 无缝克隆体系配制与反应
计算最适载体和片段用量，注意长度影响。体系反应需在50℃进行，反应时间5~60min，然后离心冷却，准备转化或储存。
4. 转化与克隆筛选
转化感受态细胞，将重组产物与细胞混合，42℃热激后置于37℃培养，菌落PCR或酶切法鉴定。
实验注意事项
推荐使用高效率感受态细胞进行转化，避免使用未纯化PCR扩增产物，以质粒为模板进行PCR扩增后，使用 DpnI 消化处理时需失活 DpnI，以避免降解重组载体。
