HBcAg核酸疫苗与白细胞介素表达质粒联合接种小鼠的免疫应答观察

黄祖瑚

吴欣

成军

邢益平

董菁

李军

卢山

【摘要】目的

观察H（）和白细胞介素（）表达BcA-12IL-12-18IL-18g核酸疫苗与鼠白细胞介素

小鼠随机分为载体质粒组、HBcAg核酸疫苗组

（核酸疫苗组）、（C、（C+HBcAIL-12组+IL-12组）HBcAIL-18组IL-18组）g核酸疫苗+g核酸疫苗+和H／（C+I／。载体质粒、BcAL-12IL-18组L-12IL-18组）HBcAIL-12及g核酸疫苗+Ig核酸疫苗、

表达质粒经肌内注射法免疫各组小鼠。采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清HIL-18BcAg特异性抗体、（，）以及小鼠脾淋巴细胞培养上清液干扰素（IG亚类IG1IG2aIFN）-γ含量。采用乳酸脱氢酶ggg（L释放法检测免疫小鼠特异杀伤性T淋巴细胞（C活性。结果除对照质粒组外，核酸疫苗DH）TL），／免疫的各组小鼠均能检出血清抗-HBcC+IL-12组、C+IL-18组和C+IL-12IL-18组的抗-HBc终点滴度与C组相比均明显增高（P<）。各组小鼠抗0.05-HBcIG亚类均以IG2a占优。核酸疫苗免gg疫组除C小鼠脾细胞培养上清液I（P<+IL-12+IL-18组外，FN-γ水平均显著高于对照质粒组）。C／0.01+IL-18组和C+IL-12IL-18组小鼠脾细胞HBcATL活性强于其他各组。结论g特异性C

（或）具有增强HIL-12和IL-18表达质粒与HBcABcAg核酸疫苗联合免疫，g核酸疫苗所激发的免疫应答特别是细胞免疫应答的作用。

【关键词】疫苗，乙型；白细胞介素1；白细胞介素1；小鼠DNA；肝炎核心抗原，28

ObservationsoniLLuneresonsesinLiceinducedbo-iLLunizationsofDNAvaccineofHBcAndpycga

lasLidsencodininterleukin12andinterleukin18HUANGZu-hu，WUXin，CHENJun，etal.pg

质粒联合免疫小鼠所诱导的特异性免疫应答。方法

DeartmentonectiousDiseases，TheFirstAiliatedHositaloaninedicalUniversitpfIfffpfNjgMy，Nanin10029，Chinajg2【A】ObstractbectiveToobservethesecificimmuneresonsesinmiceinducedbco-immunizationppyjethodsThemiceofDNAvaccineofHBcAndplasmidsencodininterleukin12andinterleukin18.Mgag

：，，weredividedintofollowinrousvectoraloneDNAvaccineofHBcAloneDNAvaccineofHBcAggpgag，，DNAvaccineofHBcAluslasmidofinterleukin18andDNAvaccineofluslasmidofinterleukin12ppgppHBcAluslasmidsofinterleukin12andinterleukin18.ThemicewereimmunizedwithaboveDNAcon-gpp

（，），structsbintramuscularinections.Thelevelsofanti-HBcanditsisotesIG1IG2ainseraandtheyjypgglevelofIFN-γinsuernatantofsleno-lmhocteculturesweremeasuredbLISAmethods.CTLacti-ppypyyEvitiesofsleno-lmhocteweredetectedwithLDHreleaseassa.ResultsMiceinallrousexcetforpypyygpp

，vectoraloneweresera-ositiveforanti-HBc.ComarinithgroufDNAvaccineofHBcAloneppgwpoga，rousofDNAvaccineofHBcAlusplasmidofinterleukin12DNAvaccineofHBcAlusplasmidofgpgpgp

，interleukin18andDNAvaccineofHBcAluslasmidofinterleukin12andinterleukin18showedmuchgpp（P<）hiherend-ointtitersofanti-HBc0.05.ReardinIGisotesofanti-HBcIG2awasdominantingpgggypgeachgrous.ThelevelsofIFN-γinsuernatantofsleno-lmhocteculturesinallimmunizationgrouspppypypexcetforDNAvaccineofHBcAluslasmidofinterleukin12andinterleukin18weresinificantli-pgppgyhg

（P<）herthangroufvectoralone0.01.CTLactivitiesofsleno-lmhocteingrousofDNAvaccinepopypyp

基金项目：卫生部科学研究基金资助项目（）96-1-347

作者单位：（黄祖瑚、吴欣、邢益平、李军）；解放军第三O二医院210029南京医科大学第一附属医院感染病科

传染病研究所基因治疗研究中心（成军、董菁）；美国马萨诸塞大学医学中心基因免疫研究室（卢山）

，，，中华传染病杂志2004年10月第22卷第5期ChinJInfectDisOctober2004Vol22No5・311・

，ofHBcAluslasmidofinterleukin18DNAvaccineofHBcAluslasmidofinterleukin12andinter-gppgppleukin18werestronerthanotherrous.ConclusionsCo-immunizationsofDNAvaccineofHBcAandggpg

／lasmidsencodininterleukin12andorinterleukin18canenhancethesecificimmuneresonsesinducedpgppbNAvaccineofHBcAeseciallthecellularimmuneresonse.yDgpyp

【K】V，；；；MeordsaccinesDNA；HeatitisBcoreantiensInterleukin-12Interleukin-18icepgyw

特异性细胞免疫功能低下是慢性乙型肝炎的

［］1主要致病机制之一。动物实验结果表明，HBsAg

三、免疫方法

各组小鼠每只每次接种相应质粒和（或）核酸疫苗各1，总体积为1，接种方法为每只00μ00μlg

和HBcAg核酸疫苗均能刺激宿主产生一定强度的

特异性免疫应答［2-4］。有报道以细胞因子为佐剂可以提高核酸疫苗的免疫应答效能

［5］。我们选用同属Th1型细胞因子的IL-12和（或）IL-18表达质粒与HBcAg核酸疫苗联合免疫小鼠，

发现IL-12和IL-18表达质粒对HBcAg核酸疫苗所诱导的特异性免疫应答能产生增强效应，尤以对特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性的增强作用为著。现将结果报告如下。

材料与方法

一、质粒和核酸疫苗

1.核酸疫苗载体质粒pJW4303，系美国马萨诸塞大学HLRobinson教授惠赠。2.HBcAg核酸疫苗pJW4303／HBc，系本室自行构建并保存。

3.IL-12和IL-18表达质粒pcDNA3.1／IL-12

和pcDNA3.1／IL-18均系北京解放军第302医院成军教授惠赠。

IL-12和IL-18表达质粒、载体质粒pJW4303和HBcAg核酸疫苗均用QIAGENMega试剂盒提取及纯化。

二、小鼠来源、分组及血清标本采集

6~8周龄雌性Balb／c（H-2d）小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，随机分为以下5组：

1.p

JW4303组（P组），11只小鼠。2.pJW4303／HBc组（C组），6只小鼠。3.pJW4303／HBc+pcDNA3.1／IL-12组（C+L-12组），6只小鼠。

4.pJW4303／HBc+pcDNA3.1／IL-18组（C+L-18组），6只小鼠。5.pJW4303／HBc+pcDNA3.1／IL-12pcD-NA3.1／IL-18组（C+IL-12／IL-18组），6只小鼠。

采用毛细吸管眼内眦静脉采血法采集小鼠血清，-70࠷冻存。

小鼠两后肢四头肌处各注射50μl。免疫程序为0、、4周，于0、2、4、6周采集小鼠血清。末次免疫后

第4周，

按常规方法进行小鼠脾淋巴细胞制备。四、抗-HBcIgG及IgG亚类（IgG1，IgG2a）检测

均采用间接酶联免疫吸附试验，详见文献［4］。五、小鼠脾淋巴细胞培养上清液干扰素IFN）-γ测定

小鼠脾淋巴细胞制备及培养方法见文献［6］。检测IFN-γ的酶联免疫吸附试验试剂盒购自深圳晶美生物制品公司。操作按说明书进行。

六、免疫小鼠脾淋巴细胞特异性CTL检测参见文献［4

］，不同在于采用乳酸脱氢酶LDH）

释放法取代51铬释放法。靶细胞为经HBcAg特异性多肽温育刺激过的P

815细胞。靶细胞数为2500／孔，效应细胞：靶细胞分别为40:1、0:1、10:1和5:1。LDH细胞毒检测试剂盒购自romeg

a公司。CTL值按以下公式计算：CTL杀伤率（%）E实验组靶细胞最大释放-效应细胞自发性释放-靶细胞自发性释放-靶细胞自发性释放*100%

七、统计学处理

采用SPSS10.0统计软件处理，采用方差分析中的最小显著法（LSD法）

检验。结

果

一、各组小鼠初次免疫后6周血清抗-HBc终

点滴度的组间比较

见表1

。二、各组小鼠血清抗-HBcIgG亚类比值IgG2a／Ig

G1）见表2。

三、各组小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ水平见表3。

2（（2PII（・312・，，，中华传染病杂志2004年10月第22卷第5期ChinJInfectDisOctober2004Vol22No5［，］78胞免疫原性。有报道免疫佐剂能够增强核酸

表1各组小鼠血清抗（-HBc终点滴度的比较x+ s）

组别

C组C+IL-12组C+IL-18组／C+IL-12IL-18组

鼠数6566

抗-HBc终点滴度3.846+1.307

*

5.325+0.427*5.039+1.001*5.198+0.390

疫苗所引起的免疫应答，我们也曾发现免疫佐剂QS-21明显增强了HBcAg核酸疫苗接种小鼠的特

［］9。本次研究旨在异性体液免疫和细胞免疫反应

观察细胞因子IL-12和IL-18表达质粒对HBcAg核酸疫苗引起的免疫应答是否具有增强作用。由抗原IL-12和IL-18均属Th1型细胞因子，

［］10递呈细胞分泌产生。国内学者报道IL-18基因注：表中的数值为抗体终点滴度的对数（值；与C组比log10）

*较，P<0.05

表2各组小鼠血清抗-HBcIg

G亚类比值（x +s）组别

鼠数抗-HBcIgG2a／Ig

G1C组610.07+4.03C+IL-12组515.80+4.00C+IL-18组68.17+3.89C+IL-12+IL-18组

6

9.92+3.13

表3各组小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ水平（pg

／ml，x +s）组别

IFN-γ测定值P组107.41+14.04

C组341.47+44.79

**

C+IL-12组386.24+30.89**C+IL-18组353.84+38.23**

C+IL-12+IL-18组

90.67+6.01

*

注：与P组比较，*P>0.05；**P<0.01

四、免疫小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性

见图1。

图1小鼠脾细胞HBcAg特异性C

TL杀伤活性讨论

核酸疫苗因其具有刺激机体产生特异性免疫应答尤其是特异性细胞免疫应答的特性，近年来倍受关注。我们以往的研究表明，HBcAg核酸疫苗

在小鼠和猕猴实验中呈现出良好的体液免疫和细

与不同形式的乙肝病毒囊膜蛋白核酸疫苗联合免

疫能够增强后者所诱导的免疫应答

［11，12］。我们用L-12和（或）IL-18表达质粒与HBcAg核酸疫苗

联合免疫，发现IL-12和IL-18表达质粒具有增强BcAg核酸疫苗所激发的免疫应答特别是细胞免疫应答的作用。

HBcAg是一种公认的强免疫原性物质，较易刺激机体产生抗-HBc。本研究结果则表明，IL-12和IL-18表达质粒能增强这一特异性的抗体反应。提示作为Th1型细胞因子，IL-12和IL-18的表达质粒与HBcAg核酸疫苗联合免疫，并没有造成对辅助抗体产生的Th2细胞的抑制而导致特异性抗体水平的降低。

特异性抗体IgG亚类特别是IgG2a和IgG1的比值（IgG2a／IgG1）在一定程度上能反映机体h细胞的反应类型。本研究发现4个疫苗接种组小鼠抗-HBcIgG2a／IgG1的比值均远大于1，属于h1型免疫应答。其中C+IL-12组的IgG2a／IgG1比值平均高达15.80，显示IL-12在促进Th1型免疫应答方面的强大作用。不联用IL-12和IL-18的C组小鼠IgG2a／Ig

G1比值也达10以上，这与我们以往的研究结果是一致的

［4］。有资料表明，HBcAg致敏的T细胞可辅助针

对HBV囊膜多个表位的抗体形成。我们也发现

BcAg核酸疫苗与HBV囊膜中蛋白（MHBs）核酸疫苗联合免疫时能加强MHBs核酸疫苗所诱导的

特异性体液和细胞免疫反应［6］。但是，我们研究

BcAg核酸疫苗的主要着眼点是刺激和增强机体

针对HBV感染靶细胞上HBcAg的特异性细胞免疫功能。

本研究结果显示，当效:靶比例为40:1时，C+IL-12／IL-18组小鼠脾细胞的CTL杀伤活性达

7.5%，远高于C组、C+IL-12组和C+IL-18组P<0.01）。这一结果说明IL-12和IL-18在增强宿主特异性细胞免疫功能方面有协同作用。

IHTTHH6（均，，，中华传染病杂志2004年10月第22卷第5期ChinJInfectDisOctober2004Vol22No5［3］

将编码I、Hanlon等1L-12IL-12+IL-18的表达

质粒分别与猫白血病病毒（T核酸疫苗联合接eLV）

・313・

机制。

参

考

文

献

种小猫，继以TeLV进行攻击。结果TeLV核酸疫苗组和TeLV核酸疫苗+IL-12表达质粒组均未能产生显著的保护性作用，而TeLV核酸疫苗与IL-12+IL-18表达质粒联合免疫组的全部6只小猫均未出现一过性或持续性病毒血症，其中5只在骨髓中也未检出潜在性病毒感染，因此认为IL-12和I使接受免疫L-18协同促进了特异性细胞免疫，1ChisariFV，FerrariC.HeatitisBvirusimmunoathoenesis.ppg

，，：AnnRevImmunol19951329-60.，2DavisHLBrazdotMillanCL，ManciniM，etal.DNA-basedim-（HBsAinnormalandmunizationaainstheatitisBsurfaceg）gp，，：HBsA-transenicmice.Vaccine199715849-852.gg

，3KuhoberA，PudollekHPReifenberetal.DNAimmuniza-gK，

tioninducesantibodndctotoxicTcellresonsestoheatitisByaypp的小猫成功抵御了TeLV感染。本次结果中C组未能产生我们以往观察到的较强的CTL杀伤活性，可能与实验方法学有关。本研究采用的是DH释放法，而我们以往的研究是采用5

1铬释放法，后者的敏感性和特异性均优于前者。

关于IL-12和IL-18在增强宿主特异性细胞免疫功能方面协同作用的机制，从理论上推测是由于IL-12促进了自然杀伤细胞（NK）

和T细胞对L-18的应答，使IL-18诱生IFN-γ的能力增强，产生足量的IFN-γ，后者又促进CD8

+发育成熟为

TL，

从而产生较强的杀伤活性［14］。在这一推论中IFN-γ是起关键作用的细胞因子。

但是，本研究中各组小鼠脾细胞培养上清液FN-γ的测定结果，

并不支持上述推论。与P组相比，C组、C+IL-12组和C+IL-18组的IFN-γ水平均明显增高，且差异有显著性（P<0.01），但这3组之间并无明显差异。此外，C+IL-12／IL-18组的IFN-γ水平与P组相当，似乎IL-12与IL-18联用反而抑制了IFN-γ的产生。初步认为有两种可能：一种是IL-12与IL-18联用确实抑制了IFN-γ的产生，那么C+IL-12／IL-18组小鼠CTL活性的增高应另有解释。另一种是基于体外试验的观察加之实验小鼠的数量较少，未能反映其真实免疫状态。尽管IL-12与IL-18联用抑制IFN-γ生成的机制尚不清楚，但我们仍倾向于第一种可能。因为L-12与IL-18自身都具有IFN-γ非依赖性的促进K细胞的增殖和提高NK细胞杀伤靶细胞的细胞毒活性的功能，这样就可以解释C+IL-12／IL-8组小鼠CTL活性增高的现象。当然，还有必要通过重复实验进一步证实上述结果，并深入探讨L-12与IL-18联用时抑制IFN-γ产生的具体

coreantigeninH-2bmice.JImmunol，1996，156：3687-3695.4

黄祖瑚，卢山，刘宁，等.HBcAgDNA疫苗诱导小鼠（H-2b）特异性细胞和体液免疫应答.中华传染病杂志，1999，17：104-107.

5ChowYH，ChiangBL，LeeYL，etal.Develop

mentofTh1andTh2populationsandthenatureofimmuneresponsestohepatitisBvirusDNAvaccinecanbemodulatedbycodeliveryo

fvariouscytokinegenes.JImmunol，1998，160：1320-1329.6

吴兴柳，丁如宁，吴欣，等.乙肝病毒核酸疫苗诱导H-2

b小鼠特异性免疫反应的初步研究.中国免疫学杂志，2002，18：325-329.

7黄祖瑚，卢山，

刘宁，等.乙型肝炎病毒核心抗原基因疫苗对小鼠的体液和细胞免疫原性观察.中华医学杂志，1999，79：456-459.

8黄祖瑚，

庄辉，郭人花，等.乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗对猕猴的体液和细胞免疫原性观察.中华传染病杂志，2001

，19：140-143.9

黄祖瑚，刘宁，李军，等.免疫佐剂增强乙型肝炎核心抗原核酸疫苗免疫应答的小鼠初步实验.中华传染病杂志，2001，19：8-10.

0金伯泉，主编.细胞和分子免疫学.

第2版.北京：科学出版社，2001.151-158.1董菁，

成军，王勤环，等.乙型肝炎病毒囊膜中与白细胞介素18联合基因免疫.中华传染病杂志，2002，20：148-151.2陈建忠，朱海红，刘克洲，等.IL-18重组体联合HBVS基因核

酸疫苗免疫小鼠的实验.中华传染病杂志，2002，20：156-159.3HanlonL，Argy

leD，BainD，etal.FelineleukemiavirusDNAvaccineefficacyisenhancedby

co-administrationwithinterleukin-12（IL-12）andIL-18expressionvectors.JVirol，2001，75：8424-8433.

4YsohimotoT，TakedaK，TanakaT，etal.IL-12up-reg

ulatesIL-18receptorexp

ressiononTcells，Th1cellsandBcells：sy-nergismwithIL-18forIFN-γproduction.JImmunol，1998，161：3400-3407.

（收稿日期：2003-06-30

）（本文编辑李欣）

LIC11111IIN1I