食品中亚硝酸盐高快速检测试纸法的建立与应用

Modern Food工程技术ｄｏｉ：１０．１６７３６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｎ４１－１４３４／ｔｓ．２０１７．１４．０３５食品中亚硝酸盐高快速检测试纸法的建立与应用Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｅｓｔ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｒａｐｉｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｉｔｒｉｔｅ　ｉｎ　Ｆｏｏｄ◎ 刘凤银1，张媚健1，李　轩2，谢丽君3，穆洪涛1（1.广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东　广州　510303；2.中国医学科学院药物研究所，北京　100050；3.广东第二师范学院化学系，广东　广州　510303）Liu Fengyin1, Zhang Meijian1, Li　Xuan2, Xie Lijun3, Mu Hongtao1(1.College of Biology and Food Engineering, Guangdong Normal University, Guangzhou　510303, China; 2. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing　100050, China; 3. Department of Chemistry, Guangdong Second Normal University, Guangzhou　510303, China)摘　要：亚硝酸盐与间苯二胺在强酸性条件下发生重氮化偶联反应，生成橙红色偶联产物。以此原理为基础，通过筛选载体类型，优化显色条件，建立快速检测试纸法。定性中速滤纸为载体，在含有30.0 g/L间苯二胺与2%聚乙烯醇的溶液中浸泡10 min，经60 ℃真空干燥后检测试纸，检测限为1 mg/kg，检测范围为1～70 mg/kg。该方法简便、快速、准确、经济，无需仪器辅助，可用于肉制品、蔬菜制品中亚硝酸盐残留量的检测。关键词：亚硝酸盐；试纸法；快速检测；间苯二胺Ａｂｓｔｒａｃｔ：Nitrite and M-phenylenediamine were diazotized under strong acid conditions to produce orange-red coupling product. Based on this principle, through the screening of carrier type, optimize the color conditions, the establishment of rapid detection test paper method. The test medium was immersed in a solution containing 30.0 g/L M-phenylenediamine and 2% polyvinyl alcohol for 10 min and tested at 60 ℃after vacuum drying. The detection limit was 1 mg/kg, and the detection range 1～70 mg/kg. The method is simple, rapid, accurate and economical, without the need for instrumentation, and can be used for the detection of nitrite residues in meat products and vegetable products.Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Nitrite; Test paper method; Rapid detection; M-phenylenediamine中图分类号：TQ421.3；TS207.3亚硝酸盐是氮循环的中间产物，化学性质不稳定，事件层出不断，危害消费者身体健康。亚硝酸盐是一俗称“硝盐”[1]。亚硝酸盐可与肉品中的肌红蛋白反应种潜在的致癌物质，可与仲胺类生成致癌物质亚硝胺生成玫瑰色亚硝基肌红蛋白，防止肉毒梭菌的生长，化合物，诱发人体胃癌、肠癌和食道癌等疾病[3]。此常被作为护色剂、防腐剂加入肉制品中[2]。但是，市外，亚硝酸盐具有强氧化性，能使亚铁血红蛋白转化场上存在许多不良商家滥用亚硝酸盐，亚硝酸盐中毒成高铁血红蛋白，失去运氧功能，严重者会因呼吸衰XIANDAISHIPIN现代食品/105现代食品2017年7月下正文-20170804.indd 1052017/8/4 17:47:55工程技术Modern Food竭而死亡[4]。亚硝酸盐对人体的危害已引起世界卫生实验用水为屈臣氏蒸馏水。组织和各国卫生部的高度重视。世界卫生组织规定每日允许亚硝酸盐摄入量不得超过0.2 mg/kg BW[5]，我国1.2　主要试剂配制卫生部于2012年出台《食品安全国家标准 食品中污染亚硝酸钠标准贮备液（200 mg/L）：准确称取0.100 0 g物限量》，规定肉及肉制品中亚硝酸盐含量不能超过 在110～120 ℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入20 mg/kg，蔬菜中不能超过4 mg/kg[6]。500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，混匀。目前，国内外测定食品中亚硝酸盐的方法主要有亚硝酸钠标准使用液：临用前，准确吸取亚硝酸仪器分析法和快速检测法。前者主要包括高效液相色钠标准溶液0、0.5、2.5、5、10、15、20、25、30、 谱法、离子色谱法和气相色谱法等[7-12]，此类方法准确、35 mL，置于 100 mL 容量瓶中，加水至刻度线，混匀。灵敏，但是仪器设备昂贵，操作复杂，对操作人员要亚硝酸钠的浓度分别为0、1、5、10、20、30、40、求高，难以满足高通量、快速检测的需求。后者主要50、60、70 mg/L。是化学快速检测法，大多以盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸为显色剂，通过比对显色强度，测定亚硝酸盐含量。1.3　实验方法该显色反应分为两步，中间反应转化率高低直接影响1.3.1　快速检测试纸法的建立产物的生成，显色效果不明显、干扰因素多[13-15]，不（1）载体试纸筛选。选用快、中、慢速定性滤纸、能满足简便快速、灵敏度高的需求，其中试纸法存在快、中、慢速定量滤纸和层析滤纸实验。将试纸剪成显色效果不明显，灵敏度低等弊端。因此，建立简便长5 cm、宽1.5 cm的试纸条，在含有一定质量浓度显快速、灵敏度高的检测方法用于食品中亚硝酸盐残留色剂和一定浓度PVA的溶液中浸泡一定时间，取出后量的测定，有着重要意义。在一定温度下烘干。向试纸条上滴加一滴亚硝酸钠标亚硝酸盐与间苯二胺在强酸性条件下发生重氮化偶准溶液显色，静置5 min后观察颜色变化。选择颜色联反应，生成橙红色偶联产物环偶氮亚氨基苯，此反应变化明显、扩散度小的滤纸作为载体试纸。迅速、显色明显、易于肉眼观察[16-17]。本研究以此原理（2）显色条件优化。考察盐酸浓度（0、0.025、0.05、为基础，通过筛选载体类型、优化显色条件，建立一种0.075、0.1、0.125 mol/L）、显色剂浓度（0、10、20、快速检测试纸法，用于食品中亚硝酸盐残留的检测。30、40、50 g/L）、PVA的浓度（0、1%、2%、4%、１　实验部分6%、8%、10%）、浸泡时间（0、1、5、10、15、 20 min）、烘干温度（25、40、55、70 ℃）、显色时间（1、1.1　实验仪器与试剂5、10、20、30 min）对显色效果的影响。选择灵敏度高、稳定好和扩散度适宜的显色条件作为最佳显色条件。1.1.1　仪器（3）比色卡制作。配制一系列浓度梯度的亚硝酸FA1104B电子天平（上海越平科学仪器有限公钠标准溶液，在最佳显色条件下显色反应，制作亚硝司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；酸钠标准浓度比色卡。DK-8AD电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公（4）共存离子干扰实验。选取样品中可能存在的司）；UV755B紫外可见分光光度计（上海佐科仪器仪离子NH4+、Mg2+、Ni+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+、Al3+、表有限公司）。Br-、Cl-、NO3-、PO43-、SO32-、Cr3+、I-、Cu2+、Fe2+做1.1.2　试剂共存离子的干扰实验。间苯二胺、亚硝酸钠、浓盐酸、聚乙烯醇（PVA）、1.3.2　样品检测乙酸锌、亚铁氰化钾、四硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐（1）样品处理。水样：澄清水样可直接取样检测；酸萘乙二胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；食品样品[18]：按照GB 5009.33-2010《食品安全国家标106/现代食品XIANDAISHIPIN现代食品2017年7月下正文-20170804.indd 1062017/8/4 17:47:55Modern Food工程技术准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中第二法分光光反应不充分，显色效果差。吸取20 mg/L亚硝酸钠标准度法中样品的处理方法处理样品。溶液滴加至用不同浓度显色剂制备的试纸条上，观察（2）实际样品检测。采购市售菠菜和火腿肠作为显色反应，结果见图3。检测样品。分别采用本研究建立的快速检测试纸法和GB 5009.33-2010分光光度法同时测定，比对测定结果。２　结果与分析2.1　载体试纸筛选图３　显色剂浓度对显色效果的影响图滤纸作为显色反应载体，滤纸种类不同会影响显当间苯二胺浓度为30 g/L时，显色效果最为明显色剂的吸附量以及样液扩散程度。吸取10 mg/L亚硝酸均匀。因此，选定30 g/L的间苯二胺溶液作为最佳显钠标准溶液滴加至不同类型试纸条上，观察显色反应，色剂浓度。结果见图1。2.2.3　PVA浓度优化滤纸的吸水性强，扩散度过大，显色不够集中。PVA可以降低样液在滤纸上的扩散度。吸取20 mg/L亚硝酸钠标准溶液滴加至用不同浓度PVA制备的试纸条上，观察显色反应，结果见图4。图１　滤纸类型对显色效果的影响图定性中速滤纸烘干后变形程度小，显色明显、均匀，扩散程度较小。因此，选择定性中速滤纸作为试纸载体。2.2　显色条件优化图４　ＰＶＡ浓度优化图2.2.1　酸度优化PVA浓度过低时，显色反应扩散严重、颜色不均间苯二胺与亚硝酸盐重氮化显色反应需在强酸条匀；PVA浓度过高时渗透性小、显色效果差；当PVA件下，酸度会影响显色反应的效果。吸取不同浓度盐溶液为2%时，试纸烘干后不会出现褶皱现象，显色酸配制的20 mg/L亚硝酸钠标准溶液滴加至试纸条上，扩散程度适中、颜色均匀。因此，选择2%PVA为最观察显色反应，结果见图2。佳浓度。2.2.4　浸泡时间优化浸泡时间长短会影响显色剂吸附量，进而影响显色效果。吸取20 mg/L亚硝酸钠标准溶液滴加至不同浸泡时间制成的试纸条上，观察显色反应，结果见图5。图２　反应酸度对显色剂效果的影响图盐酸浓度在0.05 mol/L时，试纸条上的显色明显均匀。因此，以0.05 mol/L盐酸为最佳反应酸度。2.2.2　显色剂浓度优化显色剂浓度会影响显色效果，显色剂浓度过低，图５　浸泡时间优化图XIANDAISHIPIN现代食品/107现代食品2017年7月下正文-20170804.indd 1072017/8/4 17:47:55工程技术Modern Food当浸泡时间为10 min时，显色最为清晰，无杂色。液在空气中会容易氧化成淡红色，烘干温度越低，烘因此，选择浸泡时间为10 min为最佳时间。干时间越长，会加剧氧化反应，从而对本底颜色、显2.2.5　烘干温度优化色效果产生影响。用不同温度烘干试纸条，观察显色烘干温度会影响试纸条的烘干时间，间苯二胺溶反应，结果见表1。表１　烘干温度优化表温度/℃25405570烘干效果干燥不完全基本干燥、有褶皱完全干燥、无褶皱完全干燥、无褶皱显色效果有底色干扰有底色干扰无底色干扰无底色干扰显色差显色差显色明显显色明显当温度在55～70 ℃时，试纸条不会出现褶皱和显色时间过短，反应不完全，显色效果差；显色底色干扰的现象，对实验显色无影响。因此，本研究时间过长，过量显色剂容易被空气氧化造成杂色干扰。选择60 ℃作为最佳烘干温度。吸取20 mg/L亚硝酸钠标准溶液滴加至试纸条上，不同2.2.6　显色时间优化时间显色，结果见表2。表２　显色时间优化表显色时间/min15102030显色效果显色不明显显色明显显色明显显色明显显色不明显无杂色干扰无杂色干扰无杂色干扰无杂色干扰有杂色干扰5 min后反应完全，颜色清晰明显；显色30 minCr3+、I-、Cu2+、Fe2+均不干扰实验测定。后边缘开始氧化出现杂色干扰。综合考虑实验操作时间和显色效果，选择显色时间为5 min。2.5　实际样品检测2.3　比色卡制作随机采购市售的火腿肠和菠菜，分别采用本实验建立的试纸法和GB 5009.33-2010中分光光度法同时亚硝酸钠标准浓度比色卡见图6。测定亚硝酸盐含量，对比二者检测结果，见表3。在最佳显色条件下，以不同浓度的亚硝酸钠标准表３　实际样品　试纸法、国标方法测定结果对比表（ｎ＝３）溶液显色反应，制作比色卡，见图6。 样品测定结果/（mg/kg）限量值试纸法国标法/（mg/kg）火腿肠10.0～15.014.3±0.320菠菜1.0～4.03.7±0.24由表3可知，两者结果一致性良好，说明本研究图６　亚硝酸钠标准浓度比色卡图建立的方法检测结果准确。该试纸法的检测限为1 mg/L，亚硝酸钠浓度在1～70 mg/L时，区分度良好。３　结论2.4　共存离子干扰实验本研究基于亚硝酸盐与间苯二胺在强酸性条件下发生重氮化偶联反应，生成橙红色偶联产物环偶氮亚蔬菜、肉制品中含有的多种金属离子及非金属离氨基苯的原理，建立一种亚硝酸盐快速检测试纸法。子，若对显色反应有干扰，易导致检测假阳性或假阴性。将定性中速滤纸在含有30.0 g/L间苯二胺2% PVA的分析结果，500倍NH4+、Mg2+、Ni+、Zn2+、Ca2+、K+、溶液中浸泡10 min，经60 ℃干燥后制备试纸。该方Na+、Al3+、Br-、Cl-、NO3-、PO43-及100倍SO32-、法检测限为1 mg/L，在1.0～70.0 mg/L分度明显。与108/现代食品XIANDAISHIPIN现代食品2017年7月下正文-20170804.indd 1082017/8/4 17:47:56Modern Food工程技术现有检测方法相比，该试纸法具有准确、灵敏、快速 chromatography: plausible mechanism of refractoriness[J].（5 min），检测范围广，无需仪器辅助等优点，可用Malaria Journal，2008，7（1）：71.于蔬菜、肉制品中亚硝酸盐定性、半定量检测，适合[9]蔡荟梅，侯如燕，高　柱，等.离子色谱法测定茶中小型企业与基层单位对食品中亚硝酸盐残留量作现叶中的硝酸盐和亚硝酸盐[J].茶叶科学，2012（2）：场检测和批量检测。95-99. 参考文献：[10]程　辉.气相色谱法测定食品中亚硝酸盐[J].河南[1]张颖琦，沈俊毅，徐映如，等.亚硝酸盐对人体的预防医学杂志，2010（4）：262-263.危害及检测方法的进展[J].职业与健康，2015（6）：[11]顾翔宇，郭　军.硝酸盐、亚硝酸盐检测方法的研851-855.究进展[J].中国食物与营养，2016（3）：24-28.[2]朱效兵，石晶红.亚硝酸盐与人体健康[J].河套大学[12]赵　静，王　娜，冯叙桥，等.蔬菜中硝酸盐和亚学报，2007（4）：66-69.硝酸盐检测方法的研究进展[J].食品科学，2014（8）：[3]马俪珍，张健斌，孟培培.食品中亚硝胺类化合物的危42-49.害及控制研究进展[J].保鲜与加工，2012（2）：1-4，45.[13]郑晓宏，林映芳，巫伟鑫，等.微孔板式亚硝酸盐[4]杨海莹，郭风军，范维江，等.饮食中亚硝酸盐的试剂盒的研制[J].江西化工，2011（1）：52-55.来源及其对人体的影响[J].食品研究与开发，2016（3）：[14]吴　敏，张月天，曾凡骏，等.牛乳中亚硝酸盐快209-213.速检测试纸的研制[J].食品科技，2008（4）：207-210.[5]郑鹏然.粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO）关[15]屈智慧，邹东雷，张思相，等.亚硝酸根试纸的开于食品添加剂每日允许摄入量（ADI）的建议[J].国外发与研制[J].化学工程师，2005（7）：1-4.医学参考资料（卫生学分册），1977（1）：57-59.[16]李永芳，侯晓燕.盐酸间苯二胺紫外分光光度法测[6]中华人们共和国卫生局.GB2762-2012 食品安全定亚硝酸盐的探讨与应用[J].中国卫生检验杂志，2001国家标准食品中污染物限量[S].北京：国家标准出版 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