煤基碳量子点荧光猝灭法测定注射液和牛奶样品中卡那霉素

牛奶样品中卡那霉素毛永强，张詰双娇，孙一鑫，李 娜（辽宁工程技术大学理学院，阜新123000）摘要：制备了煤基碳量子A（CQDs）,此纳米材料具有较高的荧光强度，在激发波长（儿*）为

370 nm时，其发射波长（儿Q为495 nm。卡那霉素（KANA）对CQDs的荧光具有猝灭效应，并测

得其荧光强度的猝灭程序与KANA的浓度在5.0-140.0 pmol • 之间呈线性关系，KANA的 检出限（3s〃）为1.0卩mol • L^。根据进一步试验提出了 KANA注射液及牛奶中KANA含量的 荧光猝灭测定法。CQDs与KANA反应的最佳条件为：①反应介质为pH 7.5三（凳甲基）氨基甲

烷（Tris-HCI）缓冲溶液；②CQDs溶液的加入量为0.5 mL；③反应时间为10 min。两种样品溶液

的制备方法如下：①取KANA注射液5支，混匀后分取0.1 mL,加水定容至100.0 mL,经滤膜过

滤，取滤液作为测定溶液；②取牛奶10.0 g,加无水乙醇定容至50.0 mL,静置30 min后离心，取其

上清液为测定溶液。测定时取测定液适量，加入Tris-HCI缓冲溶液和CQDs溶液各0.5 mL,加水 至5.0 ml,按上述条件测定其荧光强度（F）,同时测定空白溶液的荧光强度（F。）。经回收试验，测

得其回收率在97.0%〜104%之间，测定值的相对标准偏差（” =6）在1.2%〜2.6 %之间。经用高效 液相色谱法作比对，两种方法所测得的结果相符。测得KANA注射液样品的KANA测定值为99.6 g • L 1，与其标示值（100 g • L-1）相符。关键词：碳量子点；卡那霉素；荧光猝灭；注射液；牛奶中图分类号：0657.31 文献标志码：A 文章编号：1001-4020（2019）12-1401-05碳量子点（CQDs）是尺寸在10 nm以下的单分 散类球形荧光纳米材料.具有荧光强度高、耐光漂

简便、快速、灵敏的KANA测定方法具有重要

意义。本工作以煤粉为原料，制备了荧光强度高、水溶 性和稳定性好的煤基CQDs。基于KANA对煤基

白、细胞毒性低及生物相容性好等优点，可应用于生 物成像、细胞标记、光催化和生化分析等领域卡那霉素（KANA）是临床上常用的一种氨基

CQDs荧光猝灭的效应，建立了一种快速测定

糖昔类抗生素，具有抗菌谱广、用药方便及价格便宜 等优点。但当人体中KANA血药含量过高时，不

KANA的分析方法，为实际样品中KANA的检测

和含量标定提供一种方便的技术途径。仅会引起过敏反应，而且会对耳、肾等部位产生毒副 作用阂。目前,KANA的测定方法主要有微生物

1试验部分法、分光光度法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法

1.1仪器与试剂和酶联免疫法等3幻。这些方法存在仪器价格昂贵、 检测耗时和样品预处理繁琐等缺点，因此，建立一种F-4500型荧光分光光度计；U-3310紫外-可见

分光光度计（UV-Vis）； Agilent 1260型高效液相色 谱（HPLC）；pHS-3C型pH计；90-3型恒温双向磁

收稿日期：2019-05-10基金项目：辽宁省自然科学基金（201602358）；校第六批生产技

力搅拌器。术问题创新研究基金（20160087T）；辽宁省大学生创新创业训练 计划资助项目（201810147242,201710147094）KANA 标准溶液：1.0 mmol • ,称取 KA-NA标准品0.058 26 g,加少量水溶解后，转入

作者简介：毛永强•副教授，博士•研究方向为纳米材料的可控 制备及应用，maoyq@ tju. edu.cn

100 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀备用。65%〜68% （质量分数，下同）硝酸；KANA（纯• 1401 •A理（U检验-佗字分册毛永强•等：煤基碳量子点荧光猝灭法测定注射液和牛奶样品中卡那霉素度为99%）；硫酸KANA注射液（100 g • L所用试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸

懈水。1.2仪器工作条件UV-Vis的吸收波长为277 nm；荧光激发和发

射狭缝宽度为5 nm,激发和发射波长分别位于

370,495 nm 处。1.3试验方法1.3.1 样晶的制备KANA注射液样品制备：取硫酸KANA注射

液5支，混匀后量取0.1 mL,用水稀释并定容至

100.0 mL,经0.22 “m微孔滤膜过滤，所得滤液

待用。牛奶样品的制备：称取10.0 g牛奶样品，分别

加入不同量的KANA溶液，混匀后用无水乙醇定 容至 50.0 mL,静置 30 min,于 12 000 r • min — '转 速下离心30 min,取上清液待用。1.3.2 煤基CQDs的制备试验参考文献［10］制备煤基CQDs。将山西大

同无烟煤样研磨、过0.074 mm（200目）筛后，称取

0.2 g样品于三口烧瓶中，然后加入5 mol • L 1硝

酸溶液150 mL,于160 °C加热回流14 h。冷却至室 温，在10 000 r • min-'转速下离心20 min,去除溶 液中大颗粒杂质，取上清液置于透析袋（500 D）中透

析48 h至中性，得到煤基CQDs溶液。1.3.3 测定方法在5 mL比色管中.依次加入pH 7.5的三（起 甲基）氨基甲烷（Tris）-HCl缓冲溶液0. 5 mL、

CQDs溶液0.5 mL及KANA溶液，然后用蒸谓水

稀释至刻度，充分摇匀。室温下放置10 min后，在 仪器工作条件下测定其荧光强度（F）及试剂空白的

荧光强度（F。）。2结果与讨论2.1检测波长的选择试验考察了 CQDs的UV-Vis光谱和荧光光谱

情况，结果见图1»由图1可知:CQDs在紫外及可见光区域均有

吸收，在277 nm处有紫外吸收峰，这可能与煤结构 中的大x键在紫外区发生的Tt-Tt*跃迁和杂原子生

色基团在可见光区发生的n-n'跃迁有关〔切。

CQDs在370 nm激发波长下具有最强荧光发射，荧

光发射波长位于495 nm处。・1402・4

)()0.9

0

277 nm0000.60.31000300

400500 6000A/nm图1 CQDs的UV-Vis吸收光谱及荧光发射光谱Fig. 1 UV-Vis absorption and fluorescence

emission spectra of CQDs

2.2荧光分析条件的选择2.2.1 反应介质酸度试验考察了 CQDs和CQDs-KANA溶液在不

同pH的Tris-HCl缓冲溶液条件下的荧光强度，结 果见图2。450300 -

2 //250

? T ； ； 1 i6.0 6.5

7.0 7.5 8.0

8.5pH1 - CQDs ； 2 - CQDs+ KANACKANA = 100 /imol • L_ 1

图2不同pH条件下CQDs和CQDs-KANA溶液的荧光响应Fig. 2 Fluorescence responses of CQDs and CQDs-KANA solution at the different pH由图2可知：当pH为6.0〜& 5时，CQDs和

CQDs-KANA溶液的荧光强度均随pH的升高而

增强；当pH为7.5时,CQDs荧光猝灭程度最大，因

此试验选择pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液作为反应

介质。2.2.2 CQDs溶液用量试验考察CQDs及CQDs-KANA溶液在不同

CQDs溶液用量条件下的荧光强度，结果见图3。由图3可知：二者的荧光强度随CQDs溶液用

量的增加而增强；当CQDs溶液用量为0.5 mL时,

CQDs荧光猝灭程度最大。考虑到灵敏度和信噪

比，试验选择的CQDs溶液用量为0.5 mL。2.2.3 反应时间试验考察了 CQDs及CQDs-KANA溶液在不 同反应时间后的荧光强度，结果见图4。A理卍趙验-卍字分册全選丄等：煤基碳量子点荧光猝灭法测定注射液和牛奶样品中卡那霉素强度逐渐降低；当反应时间为10 min时,CQDs荧 光猝灭程度最大，且在30 min内基本保持不变。因

此试验选择反应10 min后进行荧光测定。2.3干扰试验试验考察药品及牛奶中常见辅料、离子及小分 子化合物的干扰情况。当相对误差在±5%以内时，

500倍的淀粉、葡萄糖、蔗糖和乳糖等不干扰测定；

l — CQDs；2 — CQDs+KANA

CKANA = 100 卩mol • L J图3不同CQDs溶液用量条件下CQDs和CQDs

100倍的Mg，+、Zn2+、Ca2+、丙氨酸、苯丙氨酸、酪

氨酸和谷氨酸，30倍的Cu2+和Fe”均不干扰测定， 表明该方法对药品及牛奶中KANA测定具有良好

KANA溶液的荧光响应Fig. 3 Fluorescence responses of CQDs and CQDs-KANA

的选择性。2.4标准曲线及检出限按照试验方法对KANA标准溶液系列进行测 定，以KANA浓度为横坐标.以体系荧光猝灭强度

solution with different volumes of CQDs solution(Fo/F)为纵坐标绘制标准曲线。KANA浓度在

5.0-140.0 Mmol • 1一7内与体系荧光猝灭强度呈线

性关系，线性回归方程为Fo/F = 3.040 X 10-3c +

1.078,相关系数为0.999 0。进行11次空白试验，

以3倍标准偏差除以标准曲线斜率计算方法的检出 限(3s/b)为 1.0 pimol • 1-7。2.5样品分析1 一 CQDs ； 2 - CQDs+ KANA

CKANA = 100 卩mol • L 1

图4不同反应时间后CQDs和CQDs-KANA溶液的荧光响应为考察该方法的实际应用能力.按照试验方法 分别采用荧光猝灭法和文献报道的高效液相色谱法

Fig. 4 Fluorescence responses of CQDs 和 CQDs-KANA

solution after different reaction times(HPLC)Ei对KANA注射液和牛奶样品中KANA

含量进行测定，并在3个浓度水平下进行加标回收

试验，平行测定6次，计算回收率、测定值的相对标

由图4可知，随着反应时间的延长,CQDs溶液

准偏差(RSD)、荧光猝灭法的测定值和HPLC的相 对误差(RE),结果见表1。的荧光强度基本不变.而CQDs-KANA体系的荧光表1 KANA注射液和牛奶样品中KANA的测定结果(n=6)

Tab. 1 Determination results of KANA in injections and milk samples(n = 6)荧光猝灭法HPLCRSD/测定值c/回收率/样品本底值c/加标量c/(ptmol • L-1)(pmol • L 1)测定值G回收率/RSD/RE/%(pmol • L_>) %36.056.780.397.0%(/zmol ■ L_1) %%2.1注射液17.120.040.01.61.22.135.896.51010.6-2.199.310457.976.929.740.61.61.51.860.0牛奶99.799.01024.4一30.040.029.841.250.899.31031021.80.31.51.32.61.21.950.049.899.62.0由表1可知：荧光猝灭法测定KANA注射液和 牛奶样品中KANA的加标回收率均在97.0%〜

定结果与HPLC方法的RE在一 2.1%〜4.4%之

间，进一步计算得到注射液中KANA为99.6 g •104%之间，RSD为1.2%〜2.6%；荧光猝灭法的测 与标示值(100 g • L7)基本一致，表明所建立・1403・理化检验但字分册的荧光猝灭法可用于KANA注射液和牛奶样品中

毛永强，邑鯉碳量空荧光铤独测定注射液和牛奶样品中卡那霉素Analytical Methods, 2014.6(5) :1569-1574.⑹KANA含量的测定。

本工作采用硝酸回流法制备煤基碳量子点，基

SUN Y・ I」D G, HE S, et al. Determination and dy­namics of kanamycin A residue in soil by HPLC with SPE and precolumn derivatization [ J ]. International

于KANA对煤基碳量子点的荧光猝灭效应.建立 一种高效、灵敏测定KANA的方法，线性范围为Journal of Environmental Analytical Chemistry» 2013,

5・0~140.0 pmol • L-1 ,检出限为 1.0 卩mol • L-1 0

该方法操作简单、线性范围宽、检出限低，可用于

93(4):472-481.[7] ZHANG Y, HE H M, ZHANG J, et al. HPLC-ELSD

determination of kanamycin B in the presence of kana-

KANA注射液和牛奶样品中KANA含量的快速

测定。参考文献：mycin A in fermentation broth [J]. Biomedical Chro­matography, 2015»29(3):396-401.M 万宇平，彭庆军，于海浪，等.卡那霉素单克隆抗体制备

以及化学发光免疫检测试剂盒的研制[J].中国酿造，

[1] 李婷，唐吉龙，方芳，等.碳量子点的合成、性质及其应

用[J].功能材料，2015,46(9):9012-9018.2018,37(4):111-114.[9]徐飞，栗静雅，周洁，等.可视化凝胶酶联免疫吸附分析

法检测牛奶中庆大霉素和卡那霉素[:J].分析化学，

[2] 贾向阳，尤慧艳，付秀丽.鱼精蛋白-核酸适配体-金纳米

技术快速检测牛奶中的卡那霉素口].色谱，2017,35

2015,43(6):881-885.口0]张卜，哈丽丹・买买提•张云飞，等.煤基碳点的制备

及其在检测痕量Cu2+中的应用[J].分析化学.2017,

(3):269-273.[3] 赵爱国，顾超宁，徐美娟，等.微生物法和荧光偏振免疫

法测定丁胺卡那霉素血药浓度的相关性口 ].药学实践 杂志,1995(4):231-234.45(10):1489-1496.口 1]张凤妹，王建.HPLC-电喷雾检测器测定硫酸阿米卡

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霉素的含量[J]•理化检验-化学分册，2016,52 (5)：

星中卡那霉素和硫酸盐的含量[J].中国抗生素杂志，

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spectrophotometric detection of kanamycin in milk[J].1964,86(23):5371-5372.Fluorimetric Determination of Kanamycin in Injections and

Milk Samples by Quenching of Fluorescence of Carbon

Quantum Dots by KanamycinMAO Yongqiang, ZHANG Zheshuangjiao, SUN Yixin ・ LI Na(College of Science , Liaoning Technical University » Fujcin 123000, China )Abstract: Carbon quantum dots (CQDs), a kind of nanomaterial possessing high fluorescence intensity, were prepared from coal powdow. At the excitation wavelength (Acx) of 370 nm, CQDs showed its emission wavelength (Aem)of 495 nm. Kanamycin (KANA) showed quenching effect on the fluorescence of CQDs, and the magnitude of

the decrease of fluorescence intensity of CQDs was found to keep a linear relationship with concentration of KANA

in the range of 5.0 to 140.0 ptmol • L 1 » with detection limit (3s/k ) of KANA 1.0 卩mol • L 1. Further testings were made for applying this fluorescence quenching reaction to determination of KANA in its injections and in milk

samples. The optimum reaction conditions were given as follows：① the reaction medium chosen was pH 7.5 tri (hydroxymethyl) aminomethane (Tris-HCl) buffer solution；② amount of CQDs added was 0. 5 mL; and ③ reaction time was 10 min. Preparation of sample solutions was done as follows:① for KANA injection sample, 5

injections were taken and mixed thoroughly* an aliquot of 0.1 mL was taken and diluted to 100.0 mL with water. After filtering through filtering membrane* the filtrate was used for determination；② for milk samples, 10.0 g of the sample were taken and diksted to 50.0 mL with absolute alcohol. After staying for 30 min・ the mixed solution

was centrifuged» and the surpernatant was used for determination. An appropriate amount of the sample solution

・1404・理化麵验-但字分册

毛永强.等：煤基碳量子点荧光猝灭法測定注射液和牛奶样品中卡那霉素was taken, and 0.5 mL each of the Tris-HCl buffer solution and ths CQDs were added to the sample solution, and the volume was made up to 5.0 mL with water. Fluorescence intensity (F) of the solution was measured under the

condition given above* and fluorescence intensity (Fo ) of blank solution was measured simultaneously. Values of

recovery found by recovery test were found in the range of 97.0% to 104% , and RSDs (n = 6) found were ranged between 1.2% and 2.6%. Samples were analyzed by the present method and checked by HPLC determination»

results obtained by the 2 methods were found in good conformity. Result of KANA found in injection sample

(99.6 g • L 1 ) was in consistency with its labelled value ( 100 g • L_1 ).Keywords: carbon quantum dots； kanamycin； fluorescence quenching； injection； milk2020年《理化检验-化学分册》征订启事《理化检验-化学分册》（ISSN 1001-4020, CO-

期刊。曾多次获得上海市优秀期刊、华东地区优秀 期刊和“百种中国杰出学术期刊”等称号。本刊为月刊，大16开本，每月18日出版；邮发 代号4-182，全国各地邮局订阅；国外代号M653O, 中国国际图书贸易总公司总发行；每册定价

DEN 编码 LJHFE2,CN 31-1337/TB）杂志创刊于 1963年，系由上海材料研究所与机械工程学会理化

检验分会联合主办的技术类期刊。主要报道化学分 析与仪器分析专业领域中的新方法、新技术、新设备

以及国内外的研究方向。“面向生产、注重实用、反 映动向、兼顾普及”是刊物的编辑方针，旨在最大幅

20.00元，全年12期，共240.00元。本刊已于2006年12月开通网上远程投审稿系 统，欢迎大家登录www. mat-test, com进行网上

度地满足不同层次读者的需要。涉及的领域为机 械、冶金、石油化工、环境科学和生命科学等。主要

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