牛胚胎移植受体的选择方法探讨

维普资讯 http://www.cqvip.com 第２２卷第４期　综述　４９　牛胚胎移植受体的选择方法探讨　梁坤，王洪宝，韩永胜，李同豹　（黑龙江省动物胚胎工程重点实验室，齐齐哈尔牛的胚胎移植就是把供体牛的胚胎移植到适宜　的受体牛子宫内，母牛的发情、排卵、受精、黄体的形　１６１０４１）　境的必要保证，否则，胚胎将无法在子宫内存活。此　外，阴道炎、习惯性流产等产科疾病也应引起足够的　重视。　成、胚胎的发育、运行、附植、妊娠以及分娩是一个复　杂的生理系统，所以，把供体牛的胚胎移植到具有相　１．３营养及体况（膘情）　营养对母牛一生的繁殖　同生理环境的受体牛子宫内尤为重要。其中，移植　所用的胚胎绝大多数是发育到第７天的桑椹胚或囊　胚，因此被移植到子宫内的胚胎并不立即附植，而要　游离存在ｌ３～２３天，与子宫发生紧密联系要在受精　后６０（４５－－７５）天　。另外，胚胎死亡也大多发生在　最初妊娠的Ｉ８天　］。故保证胚胎在子宫内附植前　的存活也至关重要。由此可见，受体牛的选择在胚　胎移植中占有重要的地位。又因其影响因素较多，　技术性较强，故成为我国奶牛胚胎移植妊娠率很不　稳定的一个重要因素。本文将从四个方面介绍受体　牛的选择方法，希望对同行有所帮助。　ｌ受体牛的初步选择　在对受体牛进行严格选择前，应对受体牛有一　个初步的选择，以减少人力、物力的浪费，甚至影响　总的妊娠率；同时也能及早发现问题、解决问题，使　其成为以后选择受体牛的基础。　１，１发情周期正常正常母牛的发情周期一般为　２１（１８～２４）天，除了妊娠时和产后一段时期内，发情　周期总是周而复始，一直到衰老停止性机能活动为　止。若发情周期不正常，表面上看母牛并没有什么　异样，但深层原因极有可能是由于母牛患有繁殖疾　病或是饲养管理较差造成的。有一点不容忽视，即　供、受体牛的发情同期化及胚胎能否在子宫内存活　都将很难掌握。　１．２无产科疾病胚胎移植时受体牛子宫内被细　菌感染是受胎率低的重要原因，而且子宫在黄体期　的抗感染能力要比发情期差　。。因此，选择无子宫　疾病的受体牛是为胚胎生存创造一个无菌的生理环　收稿日期：２００ｌ—ｌ１—２０　第一作者简介：梁坤（１９７３～），男．学士，助理研究员。　从事奶牛繁殖及动物胚胎工程方面的研究。　文章编号：１００７—９７２６（２００２）０４—００４９—０３（８２３．３６）　性能具有缓慢的、长期的作用。有研究表明，营养对　母牛繁殖力影响的作用机制是　：反映体内营养贮　备、代谢和生理状态的综合信息，经神经传导到系统　（性中枢），引起中枢神经纤维末梢分泌神经递质或　激素，调节丘脑下部的分泌活动，从而影响牛的生殖　活动。而体况（膘情）是母牛体内的营养状况和饲养　管理的一种反映，因此，选择具有良好体况（３～４　分）　的受体牛是母牛发情、排卵、胚胎的附植及妊　娠的基础。　１．４其他方面对受体牛的年龄一般无特别要求，　只要符合上述条件，均可作为受体牛的初步选择对　象。但为了保证较高的移植妊娠率和体现胚胎移植　的应用价值，应尽量选择青年母牛和低产母牛做受　体；另外选择性情温顺的，无传染疾病及影响牛体况　的其他疾病；产犊性能好的以及产后在６０天以上，　无流产史的也很必要。但子宫颈堵塞或配种时根本　通不过子宫颈的一般也不作为选择对象。　２对受体牛发情的选择　经初步选择的受体牛要根据发情状况做进一步　的选择。无论是自然发情还是药物催情，发情表现　正常（站立接受它牛爬跨）的同时也要进行直肠检查　排卵情况，因为外观发情表现正常，并不意味着卵泡　能够排卵。但应注意：第一，对４８小时以内未排卵　的卵泡继续进行直检，无法准确判断卵泡的排出与　卵泡退化在形态上有何不同；第二，卵泡不排卵也不　能无休止的检查，这样既费时费力，又对卵巢刺激较　大。故我们在实践中认为，发现母牛发情后４８小时　以内卵泡排卵的称为正常排卵，否则即确定此卵泡　是排卵迟缓或者将会退化。据对按此方法选择的　１３７头次受体牛的统计，均在发情后４８小时以内排　卵，移植妊娠率为５９．９％（８２／１３７），妊娠率是很高　的。Ｒｏｂｅｒｔｓ认为牛胚胎死亡大多发生在妊娠最初　的ｌ８天　，胚胎发育时期和受体牛子宫环境不同步　维普资讯 http://www.cqvip.com 中国草食动物　２００２钲　将导致：第一，子宫环境只允许同步胚胎发育，而对　非同步胚胎有毒害作用；第二，不同步胚胎不能发出　它们存在的足够信息。因此，保持胚胎在相对一致　的子宫环境内是移植成功的关键。当然，也有许多　报道，牛的晚期囊胚、早期囊胚和桑椹胚对同期化的　要求不太严格，提前或往后一天胚胎是可以接受的。　但大量的实践证明，对于早期囊胚，在发情期的第７　天移植妊娠率明显高于第６天和第８天的移植妊娠　率。另外，对发情时的受体牛进行进一步选择也有　益于产科疾病的检查。　３对受体牛黄体（第７天）的选择　３．１黄体的功能黄体主要分泌孕激素，它一方面　抑制卵泡的成熟发育，另一方面使子宫内膜为胚胎　的附植发生必要的变化，也是整个妊娠阶段孕激素　的主要来源。牛是单胎动物，一个发情周期只有一　个黄体。因此，胚胎移植时受体牛第７天黄体的发　育状况直接影响移植妊娠率。　３．２黄体的判断黄体的判断方法较多且因人而　异。桑润滋等　把黄体分为三个等级：一级，黄体丰　满，触摸黄体明显突出卵巢表面；二级，黄体发育较　好，突出黄体明显；三级，黄体小，突出不明显。三个　等级黄体胚胎移植妊娠率分别为７０％，５７．１％和　２５％。何协超等［３　通过直肠检查发情后第７天（发　情日为０天）的黄体认为，大小在１５　ｍｍ以上，有明　显突出卵巢表面，而且有冠状，弹性适中的为一级黄　体；大小在ｌ０～１５　ｍｍ有突出，弹性适中的为二级　黄体；小于１０　ｍｍ或虽大于１０　ｍｍ，但是突出不明　显，弹性太软或太硬的为三级黄体；其它为四级黄　体。对于１、２级和３、４级黄体移植妊娠率分别为　４７．６％和２３．５％。高建明等　对牛卵巢的黄体分　为五种形态并进行组织学研究，结果表明，圆锥状、　火山口状、蘑菇状比扁平片状、表面无黄体型的毛细　血管丰富且管腔较大。并指出，１、２、３型黄体为功　能性黄体，４、５型为非功能性黄体。毛细血管丰富　及管腔较大可能有利于黄体分泌的孕酮和体内营养　的运输，从而有利于母畜的妊娠。另外，也有实验表　明，黄体以及卵巢的弹性也影响受胎率，黄体有弹性　与没有弹性的妊娠率分别为５４．８％和ｌ４．３％。佐　腾等　报道卵巢有弹性和没有弹性的受胎率分别为　６Ｉ．３％和４４．１％，同时认为黄体有弹性、卵巢柔软　的情况下有良好的受胎率；但卵巢上有黄体的同时　存在滤泡的情况时受胎率低。笔者在牛冷冻胚胎移　植实践中认为，第７天的黄体根部在１０　ｍｍ以上，　突出部分不是太硬或太软且卵巢柔软、没有大泡存　在时均有较好的妊娠率。　４测定乳或血中孕酮选择受体牛　以上选择受体牛中涉及到的母牛的发情、黄体　的发育以及生殖疾病均是采用直肠检查来确定的。　然而，直肠检查比较繁杂，需要逐渐积累经验。而　且，毕竟隔了一层直肠壁，其准确度总要受到限制，　很难避免误诊。特别是目前从事牛胚胎移植工作的　除了研究部门外，多数是农场或基层从事冻精改良　人员，移植可以基本操作，但直肠检查发情时的卵泡　及第７天黄体发育状况缺乏经验，需要其它手段的　配合。　通过测定乳或血中孕酮（放免或酶免）水平来监　测奶牛的繁殖状态在国外已有二十多年的历史，美　国、英国、加拿大等畜牧业发达国家已相当普遍。我　国目前报道不多，多为实验性质，特别是用于受体牛　的选择，未见相关报道。性周期第７天左右的奶牛　正处于黄体生长期，而且牛的发情周期中血浆或乳　中孕酮含量在第７天开始迅速上升，到第ｌ０天达到　峰值“　。因此，此时采用放射免疫分析方法来测定　乳或血中孕酮水平，为预选受体牛，提高移植妊娠效　果可提供科学依据。鉴于母牛在生理状态下，其正　常性周期发情时乳中孕酮水平≤５ｎ￣ｍｌ，建议对受　体牛进行两次测定：①发情时进行第一次检测；②发　情后第６天或第７天进行第二次检测。以５　ｎｇ／ｍｌ　为标准，超过５　ｎ　Ⅱｌｌ为高，低于５　ｎ　Ⅱｌｌ为低，如果　两次检测结果是“低一高”时可以证明母畜的发情状　况与黄体功能较为理想，否则受体牛就可能患有繁　殖疾病。此时若能把直肠检查与测定乳或血中孕酮　水平结合起来选择受体牛，其移植妊娠率定会有所　提高。　５结论及展望　影响胚胎移植效果的因素很多。如胚胎的质　量，移植技术水平，受体牛的饲养管理等因素。尽管　有研究表明质量高的胚胎比质量低的胚胎妊娠率　高，但也有好的胚胎不能引起妊娠，而一些质量差的　胚胎不仅能导致妊娠并且在一些受体牛可获得较高　的妊娠率。这可以说明以下４个问题：第一，胚胎质　量以外的因素影响着妊娠率，尤其是受体母牛的选　择非常重要；第二，胚胎质量的形态学评定可能存在　缺陷，制约着妊娠率的稳定及提高；第三，移植操作　水平的差异能够造成移植妊娠率的不同，这影响着　妊娠率的客观统计；第四，不同的受体牛对认为质量　差的胚胎承受能力可能存在差异，但这很难掌握。　因此，随着胚胎质量评定，移植　（下转第２４页）　维普资讯 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２４　３讨论　中国草食动物　２００２年　３．３本项研究应用ｃｈ—Ｔ，Ｉｏｄｏｇｅｎ和ＮＢＳ三种氧　化剂进行了比较实验。结果证明，氧化剂的选择是　重要的，Ｉｏｄｏｇｅｎ与０ＩＰ的比值为ｌ：ｌ，而ＮＢＳ则为　３．１生物活性蛋白的同位素示踪，通常选用　Ｉ　或”　Ｉ。当前多选用　Ｉ，因为　Ｉ半衰期长，测量效　率高，但其能量比却低，故操作时的防护较简单；它　还可无载体，使标记物放射比提高。一般讲　Ｉ标　记的化合物较稳，可以连续使用数周，利用率高。本　次所标记的公驼ＯＩＰ蛋白却是例外，应用ＮＢＳ法碘　标的ＯＩＰ蛋白在体外稳定只有７２小时，便会发生　“脱碘”反应，这就需要掌握卵泡发育的规律，准确计　３：ｌ，过多的使用氧化剂可能会氧化损伤０ＩＰ蛋白　生物活性。反应的时间、温度和酸碱度也须注意，但　最终选用ＮＢＳ法，以减少氧化剂的用量，取得中等　标记率，保护ＯＩＰ活性为原则的标记实验已在进行　之中。　致谢：本项研究在北京原子能院４０１所有关人　算卵泡成熟的时间，适时地完成公驼ＯＩＰ蛋白的碘　标过程，并将碘标的ＯＩＰ蛋白在标记后４０～５０小时　内输入发情母驼体内。　３．２关于“脱碘”问题的初步探讨：Ｎａ１　Ｉ在生物蛋　白质标记中，主要在酪氨酸残基侧链集团上的氢原　子发生了置换反应，其反应后的酪氨酸分子式表明，　员指导下，于北京和西安完成；参加实验的技术人员　还有张丁联。王斌工程师和李富军、汪静两位博士，　谨致谢意。　参考文献　［１］潘光武，樊立民。陈志田。等．应用高效液相色谱法分　离纯化双峰驼诱导排卵因子的研究［Ｊ］．草与畜杂志。　１９９７，（４）：９～１３．　碘标的位置是酪氨酸苯环上的羟基邻位产生了亲碘　的取代反应。如下式。　Ｉ・　［２］潘光武，陈志田，李冬．等．双峰驼诱导排卵活性蛋白　氨基酸组成的分析［Ｊ］．中国农业科学．１９９７，３０（４）：　８３～８７．　…　０Ｈ　Ｉ　ｃ　ｃ　ｏ００Ｈ　［３］潘光武．陈志田．刘湘涛。等．双峰驼诱导排卵因子氨　基酸组成的分析［Ｊ］．中国兽医科技，１９９８．２９（７）：１０　～上述取代反应是在实验条件下人为造成的，因　此，取代反应能否相对稳定，与很多因素有关：公驼　精清的ＯＩＰ是一种生物活性蛋白，其内含有公驼诱　１２．　［４］潘光武．刘湘涛．陈志田．等．双峰驼诱导排卵因子结　构的研究［Ｊ］．中国草食动物。２００１．２１（５）：１０～１２．　［５］潘光武，陈志田，肖昭彭，等．双峰驼精清及其活性组　分凝集素寡糖的初步研究［Ｊ］．中国兽医学报．１９９８．　１８（４）：３５５～３５７．　导排卵因子（ＯＦＦ），该因子生物活性很强，厌氧怕　热，在室温下进行氧化反应，与其后不稳定的产物不　无关系，此外氧化剂的性质和反应条件也必须予以　考虑。“脱碘”问题给发情母驼的ＯＩＰ示踪带来时　空上的紧迫感，但周密的策划，尽力在各环节降温降　压，本项实验仍可进行。　（上接第５０页）　技术以及供、受体牛生理环境差异的进一步研究，一　［６］　王浩丹．应用Ｉｏｄｏｇ￣法　碘化标记多肽激素的研究　（日文）［Ｊ］．东京女子医科大学学报．１９９８．（３）：１００～　１０５．　出版社．１９８６．１８７．　郭志勤．等．家畜胚胎工程［Ｍ］．中国科技出版社．　１９９８．６６．　定会对受体牛选择的准确性有很大的帮助。另外，　根据目前牛场及养牛户的饲养水平来看，若对受体　牛进行细致的选择，必将造成适宜受体牛的减少，这　何协超，等．影响牛胚胎移植妊娠率的因素分析［Ｊ］．　动物科学与动物医学，２００１，（４）：１１～１４．　张永根．营养与体况对奶牛繁殖性能的影响及作用　机理［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医．１９９４．（２）：３５－－３９．　不利于牛胚胎移植产业化的发展；若不进行严格、规　范的选择，移植妊娠率又难以提高。由此可见，牛胚　桑润滋，等．黑白花奶牛胚胎移植中国黄牛的配套技　术研究［Ｊ］．国外畜牧学一草食家畜（增刊），１９９１，２～　ｆ　胎移植技术以外的因素同样制约着受体牛选择的发　展。笔者相信，奶牛饲养管理技术水平和疾病防治　５．　手段的不断提高，同样会对受体牛选择及选择范围　的扩大具有极大的推动作用。　参考文献　ｃ１］ｊＥ京农业大学主编．家畜繁殖学ｃＭ］．（第二版）农业　高建明，等．牛卵巢黄体类型与卵泡生长发育关系的　组织学研究［Ａ］．第十届全国动物繁殖学术讨论会论　文集［Ｃ］．２０００．　日本家畜人工授精协会．家畜人工授精讲习会．家畜　受精卵移植篇［Ｍ］．１９９７．２１４－－２３１．