四川农业大学
硕士学位论文
PRRSV感染Marc-145细胞的病毒形态发生学、细胞超微结构变化及细胞凋亡的研究
刘 伍 梅
指导教师 汪 铭 书 教授
程 安 春 教授
学科专业 预 防 兽 医 学 研究方向 兽医微生物及分子生物学
2005年6月
论文独创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名： 年 月 日
关于论文使用授权的声明
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研究生签名： 年 月 日
导师签名: 年 月 日
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目 录
中文摘要……………………………………………………………………………1 英文摘要……………………………………………………………………………2 前 言…………………………………………………………………………………4 1 材 料…………………………………………………………………………….11 2 方 法……………………………………………………………………………14 3 实验结果………………………………………………………………………17 3.1 TCID50………………………………………………………………17 3.2病毒形态发生……………………………………………………………17 3.3细胞超微结构变化……………………………………………………19 3.4细胞凋亡…………………………………………………………………21 4 讨 论……………………………………………………………………………27 4.1 病毒形态发生……………………………………………………………27 4.2 细胞超微结构变化……………………………………………………28 4.3 细胞凋亡………………………………………………………………28 5 结 论……………………………………………………………………………35 参考文献…………………………………………………………………………36 致 谢……………………………………………………………………………43 攻读学位期间发表的学术论文目录…………………………………………44
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中 文 摘 要
利用猪繁殖与呼吸综合征病毒四川分离株（PRRSV-SC1）感染体外培养的Marc-145细胞为模型, 开展了以下两方面的研究：①利用透射电镜和超薄切片技术研究了PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间病毒的形态发生学和细胞超微结构的变化；②利用光学显微镜观察、透射电镜观察、DNA Ladder、ELISA、TUNEL五种方法研究了PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间所引起的细胞凋亡及其动态变化规律。
1、病毒的形态发生学 透射电镜观察结果显示，病毒粒子呈球形，有囊膜，大小约45－65nm，内含直径大小约25－30nm的核衣壳。病毒感染细胞后吸附于细胞膜表面，然后以细胞内吞方式进入细胞，内在化后释放核酸，在胞浆内复制，有的以出芽方式进入胞浆空泡获得囊膜，在空泡内聚集，然后空泡向细胞膜靠近，空泡膜与细胞膜融合，最后以细胞外分泌方式释放到细胞外；有的散在于细胞质中，游离向细胞膜，以出芽方式释放到细胞外并获得囊膜。
2、细胞超微结构变化 病毒感染细胞后细胞超微结构变化主要表现为：感染前期，细胞无明显超微结构变化。随着时间进程的发展，细胞超微结构发生一些变化：滑面内质网空泡化，粗面内质网轻微扩张；线粒体肿胀、嵴断裂、溶解，最后空泡化；核膜轻微扩张，细胞核染色质浓缩、呈新月状或环状附着于核膜内侧；有的核膜逐渐消失，核裂解，细胞膜内陷并将细胞内容物包裹，然后出芽，形成凋亡小体；然后整个细胞内的细胞器空泡化，其中包含有一种电子密度与核仁相似大小不一的颗粒，溶酶体和脂褐素，最后细胞裂解，破碎。
3、PRRSV感染Marc-145细胞后引起的细胞凋亡 （1）HE染色后，光镜下观察细胞凋亡情况，结果显示凋亡细胞变圆、变小，细胞核固缩，染色质被染成深蓝色或蓝黑色，胞浆呈淡红色。（2）透射电镜观察，凋亡细胞胞浆浓缩，细胞核染色质凝聚，或呈新月状或环状附着于核膜内侧，或占据整个细胞核，有的核膜消失，核裂解，细胞膜内陷，将细胞内容物包裹，然后出芽，形成凋亡小体。（3）DNA Ladder、ELISA和TUNEL检测结果显示，PRRSV感染细胞后，随时间不同，其引起细胞凋亡的程度不同，与正常组细胞相比，在感染后的前24h，感染组凋亡细胞与对照组相比差异不显著（P>0.05），在感染后48h、72h、96h、120h感染组凋亡细胞与对照组相比差异极显著（P<0.01）。在感染后72h细胞凋亡达到高峰，随后细胞凋亡水平又有所下降。在感染后144h，DNA Ladder无法检测到凋亡，ELISA法检测到低于正常组细胞的凋亡水平，TUNEL法检测到极少量的凋亡细胞。三种生化指标检测方法所检测到细胞凋亡及其动态变化规律基本一致。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 病毒形态发生学 超微结构 细胞凋亡
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Studies on morphogenesis of PRRSV and ultrastructure changes and apoptosis of Marc-145 cells induced by PRRSV in vitro
Liu wumei（Preventive Veterinary Medicine） Directed by Prof. Wang Mingshu，Prof. Cheng Anchun
ABSTRACT
Morphogenesis of PRRSV, ultrastructural changes and apoptosis were studied in Marc-145 cell culture which was infected by porcine reproductive and respiratory syndrome virus Sichuan isolates strain (PRRSV-SC1). The study included two aspects: (1) morphogenesis of PRRSV and ultrastructural changes of PRRSV-infected Marc-145 cells were studied by electron microscopy and ultrathin section techniques; (2) morphologic changes and dynamic changing rule of apoptosis of PRRSV-infected Marc-145 cells were studied by optical microscopy, DNA Ladder, ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）and TUNEL(terminal deoxy nucleotidyltrans ferase-mediated digoxigenin-UTP nick end labeling).
1. The rusults of electron microscopy and ultrathin section techniques indicated that PRRSV is an enveloped, global virion, 45 to 65 nm in diameter, with a nucleocapsid approximately 25 to 30 nm in diameter. PRRSV enter into the cell by endocytosis, nucleic acid of virus release out of vesicle after internalization and copy in cytoplasm. Some nucleocapsids bud into the lumen of the smooth endoplasmic reticulum (SER) and obtain their tegument from the membrance of SER, then accumulate in SER, which move to the cytoplasmic membrane where they fuse to release virions by exocytosis. Other nucleocapsids release to extracellular by budding and obtain their tegument from the cytoplasmic membrance.
2. Ultrastructural changes of PRRSV-infected Marc-145 cells. In the infected prophase, cells had no obvious ultrastructural changes. Along with infected time extended, the smooth endoplasmic reticulum (SER) dilated and became vaculization, the rough endoplasmic reticulum (RER) slightly dilated, and some ribosome particles dropped from it. Plastosomes in the cytoplasm were hyperplastic and their cristae collapsed and lysed. Some cells presented characteristic morphological changes of apoptosis: the cytoplasm concentrated, the chromatin condensed into lunate or orbicular mass, karyotheca of some cell disappeared and nucleus lysed, then the membrance became sunken and the cell was divide up apoptotic bodies with membrance enwraped. In the infected anaphase, organelles of whole cell became vacuolization, some high electron density paticles, lysosome and lipochrome presented in the cytoplasm. Finally, the cell lysed and fell to
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pieces.
3. Apoptosis of PRRSV-infected Marc-145 cells. (1)Characteristic morphological changes of apoptosis were observed by optical and electron microscopy in PRRSV-infected Marc-145 cells, such as extensive condensation of chromatin into lunate or orbicular masses and concentration of cytoplasm associated with lots of cytoplasmic vacuolization, and aopototic bodies come into being. (2) The results of DNA Ladder, ELISA and TUNEL indicated that the level of apoptosis of PRRSV-infected Marc-145 cells was variational with the infected time extend. The level of apoptosis of infected group cells was unconspicuous compared with control group (P>0.05) at 24h p.i. The level of apoptosis of infected group cells was very conspicuous(P<0.01) compared with control group at 48h , 72h, 96h, 120h p.i. The peak value of apoptosis appeared at 72h p.i., the level of apoptosis began to drop at 96h and 120h p.i. At 144h p.i., DNA Ladder couldn’t detect apoptosis, the level of apoptosis detected by ELISA was lower than control group, and TUNEL aslo detected a little apoptosis. The dynamic changing rules of apoptosis detected by three biochemic mothods were almost identical.
Key Words: porcine reproductive and respiratory syndrome virus, morphogenesis, urltrastructure, apoptosis
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前 言
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)所引起的猪的一种高度传染性疾病，主要引起妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔等繁殖障碍以及各年龄猪发生呼吸道症状、仔猪高死亡率等引造成直接损失，同时还会导致免疫抑制而继发多种其它疾病。目前，该病在全世界几乎所有养猪地区都已流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，引起了国内外学者的广泛关注。
1987年在美国明尼苏达州首次报道本病，最初由于不能确定其病因，曾称其为“猪神秘病〔MSD)”,“猪生育和呼吸综合症(SIRS ) \“猪流行性流产和呼吸综合症(PEARS)\“猪生殖和呼吸综合症(PRRS)\“猪蓝耳病”等名称。1991年荷兰学者Wensvoort [1]博士及其同事首次用猪肺泡巨噬细胞从遭受严重繁殖障碍的猪群中分离出一种有囊膜的单股RNA病毒，同时用该病毒成功的复制出MSD症状，并从人工感染的猪群中分离出该病毒，这些结果符合确定病原的“柯赫氏要点”，从而明确了MSD的病原，澄清了围绕PRRS病原学的混乱局面。他们以荷兰中央兽医研究所所在地（Lelystad）将其命名为“莱利斯塔德（Lelystad）病毒”（Lelystad Virus,LV）。LV株成为欧洲型PRRSV的原型株。此后，Dea等[2]和Collins[3]等报道了他们分离的病毒，即PRRSV美洲原型毒株ATCC VR-2332株，通过对这种病毒的形态、结构和抗原性等的研究，证明其为一种新发现的病毒. 迄今为止，国际上将PRRSV分为以LV为代表的欧洲型和以ATCC VR-2332为代表的美洲型两个基因型，他们在基因组和抗原性上有一定差异。随后该病迅速在加拿大、德国、西班牙、英国等欧美国家广泛流行。近年来，墨西哥、哥伦比亚、智利等美洲国家和菲律宾、韩国、日本等亚太国家纷纷报道了该病。在我国，1991年初，我国台湾地区出现此病,1996年哈尔滨兽医研究所郭宝清等[4]从疑似 PRRS的流产胎儿体内分离到了该病毒，并命名为CH-la株,首次证实了PRRS在我国的存在。
1992年在美国的米尼苏达州圣堡罗举行的关于本病的专题讨论会上，正式命名为“猪生殖与呼吸综合症(PRRS)\"，并得到国际兽疫组织(OIE)的承认。同年，欧共体将该病统一命名为“猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)\"。
猪是唯一感染PRRSV并出现临床症状的动物，病毒主要侵害繁殖母猪及仔猪，造成严重的母猪繁殖障碍、仔猪呼吸系统疾病和极高的死亡率，也可造成种公猪的精液品质下降，而育肥猪发病多数比较温和。猪一旦感染PRRSV，常常会出现长期的病毒血症和持续性感染，持续不断地向外排毒，引起本病反复暴发，难以根除。PRRSV感染后由于继发感染的影响，症状常常变得较为严重而复杂。
由于本病的复杂性，尤其是感染PRRSV后，感染猪对其他致病因子的易感性增加，出现免疫抑制和亚临床感染等特点，对PRRS的防制工作带来了很多不利因素。
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近年来,国内外在该病病原学上,特别是在病毒的增殖、病毒基因结构、病毒蛋白的功能及其病理发生、病毒的致病机制上作了大量工作, 现将部分最新进展概述如下。
1 PRRSV的病原学特征
猪繁殖与呼吸综合征的病原是PRRSV，该病毒属于尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员, 与PRRSV同属于动脉炎病毒属的病毒包括乳酸脱氢酶病毒(LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猴出血热病毒(SHFV)。它们都是单股正链有囊膜的RNA病毒，基因组大小13－15kb，它们在基因组成、基因表达方式上高度相关[5]。PRRSV病毒粒子直径约为45－80nm，内含一个电子致密性的二十面体对称，直径约为25－30nm的核衣壳，内含单股线状正链基因组RNA，长约15kb，是四种动脉炎病毒成员中最大的。病毒粒子表面有纤突，用乙醚和氯仿等脂溶剂处理可灭活病毒，证明PRRSV有囊膜[6-8],病毒在CsCl中的浮密度为1.13-1.19g/m1，在蔗糖密度梯度中浮密度为1.18－1.23g/ml。
在从临床样品中分离病毒时，常温25℃以下病毒在血清中可维持其活力，但在组织中失活较快[9]； PRRSV在低温下较稳定，在4℃以上则逐渐失去感染性，4℃1个月，20℃6天，37℃10－20h，56℃15-20min病毒滴度可降低10倍，在－70℃条件下病毒的感染性可保存4个月以上不变。该病毒在pH5-7之间保持稳定，当pH小于5或大于7的条件下，病毒的感染滴度降低90%以上。PRRSV同其它动脉炎病毒一样，对多种动物的红细胞无凝集特性，不凝集猪、牛、绵羊、山羊、兔、鸡、鸭、豚鼠、小白鼠和人O型红细胞。有的病毒经吐温-80和乙醚处理后凝集小鼠红细胞的活性大为增强，但肝素能抑制其血凝活性，PRRSV不凝集经肝素酶处理的小鼠红细胞，并证明PRRSV抗血清的血凝抑制效价与中和抗体效价具有关系，血凝素密度为1.17g/ml，推测核衣壳蛋白（N蛋白）可能与其血凝活性有关[10-12]。
2 PRRSV细胞培养及生物学特性
研究表明，无论在体内或体外，PRRSV均可在单核细胞－巨噬细胞系统（包括肺泡巨噬细胞、外周血单核细胞、肺血管内巨噬细胞等）中增殖。PRRSV在PAM细胞上可得到有效地增殖，毒价可达105－106TCID50/ml，而外周血单核细胞增殖的PRRSV毒价则较低，只有104TCID50/ml[13-15]。另外还发现猪脾巨噬细胞，脑小胶质细胞，传代细胞如MA-104、Marc-145、CL2621、CRL11171等也能支持PRRSV的增殖[16，
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。而大量的人源或其他细胞系不能用于PRRSV的增殖[18]。相对而言，欧洲型的PRRSV
更适于在PAM中增殖，Marc-145、CL2621细胞系有利于美洲型PRRSV的复制，其中以Marc-145细胞增殖PRRSV效果最好，最高毒价可达108.5 TCID50/0.1ml。无论是原代细胞还是传代细胞，PRRSV均在细胞浆内复制，它们的CPE相似，即细胞圆缩、集聚、然后固缩、最后脱落。也有用聚乙二醇（PEG，MW1500）处理Vero细胞，使
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病毒与细胞融合，病毒脱壳将RNA释放至Vero内，最终获得感染性PRRSV的报道[19],但Vero细胞上并无PRRSV的受体，PEG处理机理实际上同RNA转染Vero细胞相同，使病毒RNA进入细胞，所以PRRSV在非嗜性的Vero细胞内获得了复制、转录和表达，产生了感染性的PRRSV。
3 PRRSV的分子生物学研究进展
3.1 PRRSV的基因组结构与功能
PRRSV的基因组不分节段、单股正链RNA，长约15kb，G+C含量约53％，与同属的
[20, 21]其它病毒相似（51－54％）；含有8个开放阅读框架（Open Reading Frame,ORF），
相邻的ORF发生部分重叠，3'末端有一个Poly(A)序列，长约14－23个核苷酸（nucleotide,nt）；ORF1由ORF1a和ORF1b组成，位于5'端，是最大的一个ORF，长约12kb，约占整个基因组的80％，其核苷酸高度保守，编码病毒依赖RNA的RNA聚合酶,与病毒的复制和转录有关[15, 20, 22]。其上游是长约189个核苷酸的5'端非编码区(Non-coding Reign. NCR)，高度保守。在两种血清型的毒株中，5'端非编码区同源性高达99%。在紧接RFla启始密码子的前导序列中有两个茎环结构，可能与RNA合成的终止有关。ORF1a编码启始区的核心序列为5'-UUAACCAUG-3'，高度保守,这段序列对前导序列与基因组主体之间的连接很重要。ORFla和ORFlb重叠区有16个核苷酸，在重叠区序列中有一个决定准确移框的核苷酸结构(5’UUUAAAC3’)和紧接着在下游可能形成RNA拟节（Pseudo-knot）的序列，这两种结构均是聚合酶翻译过程中核糖体移码所必须的。ORF1b的翻译要求在ORF1a翻译终止之前使核糖体发生移框，移框的进行正是在这两种结构的促进下完成的。
ORF2-ORF7是病毒基因组的结构基因，主要编码病毒的功能性蛋白。在ORF7终止密码子之后是3'端非编码区(NCR)，含有poly（A）结构，在poly (A)尾的上游有一个高度保守的8核苷酸序列。3'NCR在两种血清型毒株中的同源性为76％。Meng等[21]认为这段序列的功能可能是聚合酶的结合区，用以启动负链RNA的合成。
3.2 PRRSV基因组的转录及表达
正链RNA病毒基因组复制过程基本相似。病毒蛋白与细胞受体作用，经吸附、进入、脱壳后在细胞浆中开始复制，以基因组RNA作为信使RNA（mRNA），借助宿主细胞的核糖体，在必要的酶和生物大分子参与下，首先翻译产生RNA聚合酶，RNA聚合酶以病毒基因组RNA为模板，合成高度耐RNA酶的双链RNA，此双链RNA称为复制中间体（Replicative Intermediate ，RI）它含有病毒基因组正链RNA和与其互补的负链RNA,它们的3’端均能形成发夹结构，可能是RNA聚合酶识别和结合的位置。负链RNA从复制中间体中解离出来后作为模板，复制出与病毒基因组一样的子代病毒基因组，与翻译产生的结构蛋白一起组装成为成熟的病毒粒子，释放到细胞外，周而复始的进行复制。目前PRRSV复制的确切机制仍不十分清楚。PRRSV基因组RNA起着贮存
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遗传信息和遗传信息表达的双重功能，最大的开放阅读框（ORF1）转录本就是复制产生的病毒基因组RNA，也就是说ORF1编码的蛋白直接由病毒基因组mRNA所表达，因此PRRSV基因组的复制是与转录相结合的过程。在复制时产生的复制中间体内的负链基因组RNA除可作为产生基因组mRNA的模板外，转录出6个长度依次递减的sgmRNA（Sub-genomic mRNA，sgmRNA），可见，PRRSV可转录产生7个转录本，分别为mRNA1（15kb）、mRNA2（3.3kb）、mRNA3（2.7kb）、mRNA4（2.2kb）、mRNA5（1.7kb）、mRNA6（1.1kb）和mRNA7（0.7kb）[23-25]。因ORF1编码的复制酶由病毒基因组RNA表达，在基因组3’端编码病毒的结构蛋白的ORF2-ORF7则是通过形成六个亚基因组（mRNAs）进行表达的。这些mRNAs均具有来自病毒基因组5'端非编码区的引导序列(> 200nt )，引导序列与mRNAs序列间的连接区也高度保守，其核心序列为 5'-UCAACC-3'，连接区到下游启始密码子AUG之间的距离为8-83bp不等。各亚基因组RNA的3’末端相同，从而形成一个共3'末端的嵌套式结构[23]。在基因组结构上，5’NCR与位于基因组3’端的ORF2-ORF7相隔甚远，而6个sgmRNA均含来自5’端前导序列，从结构上看是不连续的，因此，PRRSV是采用不连续转录机制进行sgmRNA转录，虽然转录产生的6个sgmRNA结构上是多顺反子（polycistron）,但在功能上却是一个单顺反子（monocistron）,即每个sgmRNA只有靠近5'端的第一个ORF才能够翻译出蛋白[24, 26]。
3.3 PRRSV基因组所编码的蛋白
PRRSV所有ORF的编码蛋白都已确定，与其它病毒一样，所编码的蛋白分为结构蛋白和非结构蛋白。其中ORF1编码的多聚蛋白经剪切成为有RNA聚合酶活性的非结构蛋白，参与病毒的复制和转录。Molenkamp[27]等研究发现，ORF1编码的复制酶是唯一参与病毒基因组复制和sgmRNA转录过程的病毒蛋白，病毒的其它蛋白则不参与病毒基因组复制和sgmRNA转录。ORF2－ORF7编码病毒的结构蛋白，其中ORF2-ORF6编码的蛋白具有膜蛋白的特征，均含有糖基化位点、N-端和C-端疏水序列，可能作为信号序列和膜锚定区，ORF7编码分子量较小且高度碱性的核衣壳蛋白（N蛋白）。
Meulenberg等[28]建议将ORF2-ORF5编码的囊膜蛋白分别命名为GP2, GP3, GP4和GP5, ORF6所编码的膜蛋白为M蛋白，ORF7所编码的核衣壳蛋白为N蛋白。GP4，M和N蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白，它们在病毒粒子中含量较高，决定着病毒的免疫原性及大部分生物学活性，而GP2和GP3蛋白因其含量较低，抗原性也较差，因此在感染宿主体内针对它们的抗体水平也较低，且对于GP3蛋白的具体位置则说法不一。GP5蛋白是主要的囊膜蛋白，在不同毒株之间它的变异最大，是研制基因疫苗及重组亚单位疫苗最有希望的候选基因。M蛋白和N蛋白相对比较保守，有研究认为M蛋白主要参与细胞免疫。N蛋白具有很强的免疫原性，是研究抗原诊断的首选蛋白.
4 PRRS的发病机制
猪通过呼吸系统感染PRRSV，因为PRRSV对巨噬细胞的嗜性，侵入的PRRSV首先在
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鼻粘膜、呼吸道上皮细胞及肺内巨噬细胞中增殖，特别是尚未成熟的PAM细胞最适合PRRSV的繁殖，在PAM中增殖的PRRSV可转移到局部淋巴组织的巨噬细胞和单核细胞内进一步增殖，使肺部的PAM、单核细胞等免疫相关细胞大量减少，造成肺部的免疫抑制，从而在仔猪出现典型的呼吸道症状；同时，因PRRSV的增殖导致PAM减少，PAM依赖于超氧负离子发挥杀菌作用的功能被剥弱，这样就为其它病原微生物的继发感染创造了有利条件，使疾病的症状加重[29]。PRRSV在肺部PAM、单核细胞大量增殖后，随着细胞的崩溃，释放出的PRRSV进入血液循环和淋巴循环，在血液内巨噬细胞和单核细胞内增殖，结果导致病毒血症的出现及全身淋巴结的感染和肿大。因为所有组织内都含有巨噬细胞，并且PRRSV对巨噬细胞都敏感，所以，能被PRRSV感染的组织类型没有明显限制，然而不同组织内巨噬细胞数量的差异和局部环境的变化，对PRRSV复制的可能性及增殖力不同，从而引起不同器官在病变上有差异[30，31]。在细胞水平上，病毒抗原主要定位于肺、脾、淋巴结、胸腺、扁桃体、鼻甲骨、睾丸、肾、肝、肾上腺、脑、肠等器官的巨噬细胞内，病毒抗原和核酸在生殖道细胞(精原细胞)内也可检测出，表明PRRSV存在对生殖系统的感染，通过诱发睾丸内精子细胞凋亡使精子数量减少，公猪则表现出繁殖性能的降低，这种公猪通过精液将PRRSV传染给母猪，引起母猪的繁殖障碍[32。33]。目前，对感染PRRSV的怀孕母猪是如何引起子宫内胎儿感染的机制不十分清楚，从理论上讲，大分子物质如抗体和病毒不能通过母猪的胎盘屏障，PRRSV可能由能穿过胎盘屏障的单核细胞和巨噬细胞携带，从而进入胎儿体内引起胎儿的感染[34-36] 。刘光清等[25]对繁殖母猪进行攻毒试验发现，胎儿脐带出血、扩张，呈现坏死性脐动脉炎变化，使脐血管的正常血液循环受损，结果胎儿由于缺氧而死亡。PRRSV感染后只有在电子显微镜下才能观察到胎盘病变，特征为上皮细胞坏死脱落，胎盘和子宫间微分离，可见，胎盘的病变也可能为PRRSV穿过胎盘创造了有利条件。在妊娠后期的胎儿已出现主动免疫应答，产生的抗体对经胎盘感染的PRRSV出现抗体依赖增强（ADE）效应，这可能是PRRSV感染妊娠母猪后，在怀孕后期发生流产的主要原因之一；另外，仔猪对PRRSV的易感性与亚中和水平母源抗体之间有联系，说明PRRSV的致病机理与ADE有关[37]。此外，PRRSV可继发猪链球菌感染，加重呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus virus, PRCV)和猪流感病毒继发感染的病情，对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2, PCV 2)的复制也有促进作用[38-40]。
5 PRRSV感染与细胞凋亡
细胞凋亡是1972年澳大利亚昆士兰大学的学者Kerr[41]及同事在对肝细胞溶酶体的组织化学研究中发现一种不同于坏死的细胞死亡方式，把它命名为细胞凋亡（Apoptosis）。细胞凋亡是指在一定的生理或病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，激活内源性核酸内切酶，发生细胞自动消亡的过程[42]。诱导细胞凋亡的因素很多，病毒感染是常见的导致细胞凋亡的重要因素。越来越多的资料表明，
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病毒感染与细胞凋亡有着密切而复杂的关系。病毒感染细胞后，或是因为病毒复制与病毒蛋白的表达对细胞有毒性作用，或是因为细胞自身的核酸与蛋白质代谢被病毒抑制，最终导致细胞病变，许多病毒的致细胞病变效应是通过诱发细胞凋亡来实现的[43]，细胞凋亡在病毒感染致病上具有重要意义。从病毒和细胞之间的相互作用关系来看,多种病毒感染可引起细胞凋亡,病毒感染诱导的细胞凋亡作用既可能是机体对病毒感染的防御反应,亦可能是病毒感染导致宿主细胞严重损伤的重要机制。经过选择和进化的病毒具有抑制细胞凋亡的机制,它或者激活宿主细胞的抗凋亡基因的表达,或者表达自身抗凋亡基因以阻止细胞凋亡,完成病毒的复制和生活周期,以保证其在宿主细胞内的大量增殖。近年来,越来越多的证据表明,细胞凋亡(apoptosis)或程序性死亡(programed cell death PCD)可能是病毒感染导致细胞死亡的原因之一。因此,研究病毒感染与细胞凋亡关系及凋亡的可能机制,将有助于进一步认识病毒感染性发生、发展及转归机制,为病毒病的防治提供一些新的思路.
许多资料报道PRRSV的两个基因型均能在体内外诱导细胞凋亡[33, 44-50]，现已明确，这种细胞凋亡作用与GP5蛋白有关[51-53]，这说明GP5与PRRSV的致病性有关。研究发现，GP5诱导的凋亡不能被抗凋亡蛋白Bcl-2抑制，说明GP5诱发凋亡是作用在抗凋亡因子Bcl-2的下游，或其它未知的凋亡机制在起作用[51, 54]。缺失突变质粒的体外瞬时表达试验表明，GP5 N端的118个氨基酸对于保持GP5诱导细胞凋亡的活性必不可少，而缺失其C端并不影响此活性[55]。Choi等[56]还发现，PRRSV感染肺脏引起细胞凋亡与α－肿瘤坏死因子（TNF－α）的表达有关，但同一细胞不会同时出现细胞凋亡和TNF－α，他们认为，PRRSV感染细胞后，细胞释放TNF－α，再导致其相邻的未感染的细胞发生凋亡。
尽管许多资料研究表明，PRRSV感染能诱导细胞凋亡，但是是否PRRSV的感染直接诱导细胞凋亡仍然是不清楚的。有资料表明，凋亡细胞是发生在PRRSV感染的组织，然而资料中仍然没有明确表明凋亡细胞就是PRRSV感染的细胞。这样就导致了一些研究者提出病毒感染细胞后，由于一种不明机制作用，导致PRRSV感染的邻近细胞发生凋亡。PRRSV感染后，PRRSV的复制是否会启动凋亡程序是由凋亡基因的表达来决定，Miller等[44]利用显微实验和半定量RT-PCR试验检测PRRSV感染Marc-145细胞后凋亡基因的表达，检查结果发现，26个凋亡相关基因在感染后的前24h无任何变化，表明凋亡现象不是发生在PRRSV感染的细胞。总之，到目前为止，关于PRRSV引起细胞凋亡的具体机制仍不十分清楚，有待于进一步研究。
在体外研究病毒的形态发生学和感染细胞超微结构变化，病毒引起的细胞凋亡等方面国内外已有一些相关的研究报道。Dea.S等[57]用IAF-KLOP株在Marc-145细胞上，Pol.J等[58]用LV，VR2332和JJI882三株毒株分别在PAM和CL2621两种细胞上进行了病毒形态发生学和细胞超微结构变化的研究；Kim等[50]采用PRRSV的SDSU-23983野毒株P6和细胞适应株P136在Marc-145细胞上用DNA Ladder方法和FITC标记的抗体和TUNEL双标记法，Sirinarumitr等[48]采用VR2385在ATCC CRL11171细胞上用DNA Lad-
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der方法和TUNEL方法进行了PRRSV引起细胞凋亡的研究。严亚贤等[59]采用3株上海分离株和VR2332株，李成等[60]用中国分离株感染Marc-145细胞进行了病毒形态学的初步研究。总的来说，国内外目前在这方面的研究还不够完善：（1）国外对于细胞凋亡的研究目前只有透射电镜、DNA Ladder和TUNEL检测方法以及一些凋亡基因的检测，其它方法检测未见报道。（2）国内对于PRRSV的病毒形态发生学的研究，还没有比较系统翔实的资料报道，仅仅局限于病毒的形态学，而在PRRSV引起的细胞凋亡方面的研究还是空白。
本研究以PRRSV中国四川分离株（PRRSV-SC1）感染Marc-145细胞为模型，应用超薄切片和透射电镜技术对该病毒的病毒形态发生学和感染细胞超微结构变化进行了观察，应用光镜、透射电镜、DNA Ladder、TUNEL和ELISA方法对该病毒诱导的细胞凋亡及其动态变化规律进行了检测，以期为阐明PRRSV的致病机制提供有用的实验数据。
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1 材料
1.1 PRRSV-SC1毒株
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRSV）四川分离株，由动物疫病与人类健康四川省重点实验室分离，鉴定，保存[61]。
1.2 细胞株
Marc-145细胞，由本实验室保存。
1.3 主要仪器
超纯水仪： LABCONCO-Water Pro PS-9000703型 倒置显微镜：Olympus（ModelCK40－200） pH仪：Thermo Orion-Model868型 高速冷冻离心机：AllegraTM21R 型 透射电镜：日立 H-600型 凝胶成像系统：BIO RAD,2000型 酶标仪：ELX800型，BIO-TEK公司产品
微量振荡器:WZ-2A型，北京海淀电子医疗仪器厂 细胞培养箱：QUEUE型
无菌操作工作台：SW-CJ-2FD型，苏州安泰空气技术有限公司
1.4主要试剂
MEM培养基，胎牛血清（为GIBCO公司产品）；低熔点琼脂糖，100bp的Maker
PLUS（为大连宝生物工程公司产品）；Cell Death Detection ELISA 试剂盒，Cell Death
Detection TUNEL试剂盒（为Roche公司产品）；蛋白酶K，RNase A，琼脂糖，溴化乙锭，小牛血清白蛋白（BSA）（为天泰公司产品）。
其它常用试剂均为国产分析纯。
1.5主要试剂的配制
1.5.1细胞及病毒培养所用的试剂配方
(1) MEM营养液的配制
取一袋MEM营养粉放入1000ml容量瓶中，加300ml超纯水，缓慢摇匀溶解，
加入2.2g碳酸氢钠，缓慢摇匀溶解，再加入650ml超纯水，摇匀后用盐酸在pH仪上调pH值为6.8后，定容至1000 ml，用孔径为220nm的滤膜过滤除菌，分装后4℃保存备用。 (2) 生长液的配制
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取90mlMEM营养液加入10ml小牛血清和1ml双抗（100μg/ml），4℃保存备用。
(3) 维持液的配制
取98mlMEM营养液加入2ml小牛血清和1ml双抗（100μg/ml），4℃保存备用。
(4) 无钙镁水的配制
NaCL 8.0g KCL 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.55g KH2PO4 0.2g
加双蒸至1000ml，高压灭菌，室温保存备用。
(5) 10×胰酶的准备
溶液1：取胰蛋白酶0.5g，溶解于40ml双蒸水中，37℃保温30-40 min 等胰
蛋白酶完全溶解后加入0.2g EDTA，摇匀溶解。
溶液2：取NaCL 8g溶于60ml双蒸水后再分别加入0.4g KCL和1g葡萄糖，摇
匀溶解。
将溶液1和溶液2混合后，加入0.58g NaHCO3和 0.001g酚红，摇匀、过滤除菌后加0.8ml双抗（100μg/ml），分装，－20℃保存备用。
1.5.2 酚的平衡
取100ml重蒸酚，加入0.1g 8-羟基喹啉和100ml 50mmol/L的tris碱，室温下用磁力搅拌器低速搅拌10min，使之分层，弃去上层液体，加入100ml 50mmol/L pH8.0的Tris.CL缓冲液，重复上述步骤，再连续平衡2次后，将平衡好的酚装入棕色瓶内，加入适量50mmol/L pH8.0的Tris.CL缓冲液覆盖平衡酚的表面，4℃保存备用。
1.5.3 酚：氯仿：异戊醇混合液的准备
氯仿和异戊醇按24：1体积混合后，按1：1体积与平衡酚混合，然后加入适
量50mmol/L pH8.0的Tris.CL缓冲液覆盖其表面，放在棕色瓶中,4℃保存备用。
1.5.4 TE溶液(pH8.0)
10mmol/L Tris.CL (ph8.0) 1mmol/L EDTA (ph8.0)
1.5.5 RNase A的配制
将RNase A溶于10mmol/L Tris.Cl (pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/L, 于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小分,-20℃保存。
1.5.6 TBE电泳缓冲液
108g Tris碱
15
55g 硼酸
40ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)
加水至1L,临用前取25ml原液加水至500ml,稀释成0.5倍工作浓度的TBE.
1.5.7 细胞裂解液
10mmol/L Tris-Hcl(pH7.5) 10mmol/L EDTA 0.5% TritonX-100
1.5.8 2%琼脂糖凝胶
称取2g琼脂糖加100mlTBE溶液，煮沸溶解，备用。
1.5.9 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）的配制
第1步：首先配0.2mol/L的PB溶液
A液（0.2mol/L NaH2PO4）: 31.2g NaH2PO4・2H2O加双蒸水至1000ml溶解。 B液（0.2mol/L Na2HPO4）:71.632g Na2HPO4・12H2O加双蒸水至1000ml溶解。 然后A液19ml，B液81ml混合成100ml的PB溶液。 第2步：0.2 mol/L的PB 50ml NaCl 8.5g
加双蒸水溶解至1000ml，即成0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2。
1.5.10 3％ H2O2甲醇溶液
10ml 30％H2O2 90ml 甲醇
1.5.11 4％多聚甲醛PBS溶液
4g 多聚甲醛 100ml PBS溶液
1.5.12渗透液
100ml 0.1％柠檬酸钠溶液 0.1ml TritonX－100
1.5.13 2％低熔点琼脂糖
称取2g低熔点琼脂糖于100ml PBS溶液（pH7.2）中，煮沸溶解，4℃备用。
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2 方法
2.1 Marc-145细胞的复苏与培养
从液氮罐中取出一管Marc-145 细胞，37℃水浴快速溶化，移入装有预热的10ml生长液的高压灭菌离心管中，2000r/min，37℃离心5min，弃去上清，加1ml生长液，用巴氏吸管轻轻吹打，将沉淀的细胞分散，移到100ml的细胞培养瓶内，加入7ml生长液，放置37℃恒温箱传代培养。
2.2病毒的培养
待细胞长为单层，接种PRRSV-SC1，在37℃条件下吸附1小时后，倒掉病毒液加入维持液，在37℃细胞培养箱中培养。
2.3 TCID50的测定
参照文献[62]进行。将生长良好，处于对数生长期的细胞消化，制成细胞悬液，于96孔细胞培养板孔内加入细胞悬液，每孔40μl。将病毒液作10倍梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后每孔加入病毒液40μl，每梯度加11孔，再设一列为对照组，置37℃培养，逐日观察并记录有病毒增殖细胞孔。然后按照Reed-Muech氏法来计算病毒的TCID50。
2.4 病毒感染Marc-145细胞后的形态发生和细胞超微结构观察
参照文献[63-65]制作超薄切片:①收集接毒后不同时间段的接毒细胞和对照组细
胞，倒掉营养液，加入2.5%的戊二醛固定1h后，用细胞刮刮下细胞，收集离心，取沉淀，在37℃条件下加入2%的低熔点琼脂糖，混合均匀，5000rpm离心5分钟。切下含细胞的琼脂糖，修切成电镜样品大小，固定于2.5%的戊二醛溶液中。固定1h后用PBS缓冲液漂洗3次，10min/次；②用0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液配制1%锇酸,置4℃ 1.5－2h,用相同磷酸缓冲液洗涤3次；③丙酮系列脱水；④用环氧树脂EPON618包埋；⑤超薄切片,用2%醋酸铀、柠檬酸铅双重染色,H-600透射电镜观察。
2.5 PRRSV感染Marc-145细胞后细胞凋亡的检测
2.5.1细胞凋亡的形态学检测
2.5.1.1 光镜观察
参照文献[66]进行。采用盖玻片培养，待细胞长成单层后接毒，分别于第2天取出接毒和正常对照组细胞，经PBS轻轻漂洗后，用4%的多聚甲醛在常温下固定10min，即按常规HE染色方法进行染色，脱水，透明，封片，光学显微镜下观察。
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2.5.1.2透射电镜观察
按2.4制作超薄切片并在透射电镜下观察细胞凋亡情况。
2.5.2细胞凋亡的生化检测
2.5.2.1 Marc-145细胞的PRRSV感染及材料的采集
按常规方法培养Marc-145细胞，待细胞长成单层后，按25×106.52 TCID50剂量接种PRRSV-SC1株，分别收集接毒后24h，48h，72h，96h，120h，144h和相同时间点未接毒的对照组细胞。用胰蛋白酶消化，PBS缓冲液洗涤，1500rpm离心5min，取沉淀。 2.5.2.2 DNA Ladder检测细胞凋亡
参照文献[46, 67]进行。将细胞沉淀悬浮于400μl细胞裂解液中，37℃1h，12000g离心20min，吸取上清液并加入RNaseA，使终浓度为0.1mg/ml，置65℃ 1h。再加入蛋白酶K，使终浓度为0.5mg/ml，50℃ 1h。然后用酚/氯仿按常规方法抽提DNA并用2倍体积的无水乙醇沉淀，4℃过夜，14000g离心20min，取沉淀。沉淀干燥后用20μl TE溶解，即为待测样品。取待测样品20μl用2%的琼脂糖凝胶电泳，4V/cm电压，电泳90min，紫外检测仪下观察，照相。
2.5.2.3 ELISA 检测细胞凋亡 参照试剂盒说明书和文献[68]进行。 2.5.2.3.1 样品的处理
将细胞沉淀用PBS缓冲液稀释成悬液，参照《细胞实验指南》[64]上的方法进行细胞计数后，取含1×104个细胞的细胞悬液，1500rpm离心5min，弃上清液，向沉淀中加入200μl细胞裂解液，使细胞终浓度达到5×104/ml，室温（15-25℃）孵育30min后，13000rpm离心10min，取上清，即为制备的样品。 2.5.2.3.2 ELISA检测
在已包被好的ELISA反应板内，每孔加入20μl待测样品和80μl新鲜配制的免疫反应混合物（含抗组蛋白抗体和抗DNA抗体）。每个样品做2个平行重复，每批样品检测时均设一个阴性对照（用孵育缓冲液代替免疫反应液），一个阳性对照（用试剂盒内提供的阳性对照样品代替细胞裂解液）和两个空白对照（用裂解缓冲液代替细胞裂解液）。置微量振荡器上，室温（15-25℃）下，300rpm振荡2h。反应后用孵育缓冲液洗涤3次。然后加100μl底物溶液（ABTS），置微量振荡器上，室温（15-25℃）下，250rpm振荡5min。用酶标仪在405nm处对样品进行检测，空白对照在490nm处进行检测。样品的Dλ=A405nm-A490nm，然后求每两个重复样品的平均值即为该样品的Dλ。
2.5.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 参照试剂盒说明书和文献[69-72]进行。 2.5.2.4.1 Marc-145细胞的PRRSV感染及材料的采集
采用盖玻片培养细胞，待盖玻片上的细胞长成单层后，按25×106.52 TCID50接种病毒，在含2%的胎牛血清的营养液中，37℃培养，分别于第1、2、3、4、5、6天取出接毒和正常对照组的细胞。由于接毒后第4天，几乎所有细胞脱落，所以第
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4、5、6天采用涂片法，将脱落的细胞离心、洗涤、再离心，然后加入一定量的PBS稀释细胞沉淀到一定的浓度，然后涂片均匀，让其在室温下自然干燥备用。正常组和前3天收集的细胞，在固定前先用PBS缓冲液清洗备用。 2.5.2.4.3 TUNEL法检测
操作步骤：①用4%的多聚甲醛固定1h，用PBS缓冲液漂洗3次；②加3%H2O2
阻断液，15-25℃，10min，PBS漂洗；③加渗透液（0.1%TritonX-100柠檬酸钠缓冲液）2-8℃，20min，PBS漂洗3次；④加50μlTUNEL反应混合液，加上覆盖膜，湿盒中37℃，1h，PBS漂洗3次；⑤用3%的小牛血清白蛋白（BSA）封闭，37℃，20min；⑥加50μl转换POD溶液，加上覆盖膜，放在湿盒中37℃，30min，PBS漂洗3次；⑦加50μlDAB底物，湿盒中避光显色，15-25℃，10min，PBS漂洗；⑧按常规方法进行苏木精复染，盐酸酒精分化，自来水蓝化，酒精系列脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。
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3 结果
3.1 病毒TCID50的测定结果
PRRSV感染Marc-145 细胞后，出现CPE的结果见表1。
表1. TCID50测定出现CPE的记录表 Table.1 Statistics of CPE after PRRSV infected 病毒稀释倍度 Dilute degree of virus
10 10 10 10 10 10 10 10
-8-7-6-5-4-3-2-1
出现CPE的孔数 Accumulative CPE
11/11 11/11 11/11 11/11 10/11 8/11 4/11 0/11
从表1可以看出，能使半数细胞出现CPE的稀释度（即TCID50）介于10-6和10-7之间，然后根据Reed-Muech氏方法计算病毒的TCID50，其确实的稀释倍数根据公式来计算：
公式：距离比＝————————————
高于50％的％—50
高于50％的％—低于50％的％
TCID50＝高于50％的病毒最高稀释倍数的负对数＋距离比 计算结果：实验中所用PRRSV-SC1株的TCID50为10-6.52/0.04ml。
3.2 PRRSV的形态发生
病毒粒子呈球形或椭圆形，有的中心略空，有囊膜，直径大小约为45－65nm，内含直径大小约25－30nm的核衣壳，表面有纤突（见图1d）。接种病毒后，病毒吸附于细胞膜表面（见图1a），然后通过细胞内吞噬作用进入细胞（见图1b），病毒进入细胞后释放病毒核酸进入胞浆，在胞浆内进行复制。在细胞感染病毒后16h，观察到第1代病毒粒子出现，有的存在于胞浆内电子密度不一的絮状团块内，有的存在于胞浆空泡内（见图1f）。接毒后20h，就看到感染细胞释放出完整的病毒粒子。到了后期，病毒一般存在于细胞浆的空泡内或细胞的胞质中，细胞膜表面和细胞外都分别观察到病毒，有的成熟病毒粒子，通过芽生方式，进入胞浆空泡内（见图1c），获得囊膜并在空泡内堆积，然后空泡向靠近细胞膜表面的方向移动，最后以细胞外分泌的方式释放病毒粒子（见图1h），有的病毒则单个以出芽的方式释放
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出细胞外并获得囊膜（见图1g）。
图1.PRRSV的病毒形态发生学 Fig.1 Mophogenesis of PRRSV
图1a.病毒粒子吸附于细胞膜表面（如箭头所示）。×60,000 ×60,000
图1b.病毒粒子以细胞内吞方式进入细胞(如箭头1所示)，箭头2所示为细胞膜。×60,000 1), the arrow 2 is membrance. ×60,000
Fig.1a Virions attached to the cellar surface (arrow). Fig.1b Virions entered into cell by endocytosis (arrow
图1c.子代病毒粒子以出芽方式进入细胞浆滑面内质网内（黑色箭头所示），存在于胞浆内质网内（白色箭头所示）。×80,000
accumulate in SER (white arrow). ×80,000
图1d.成熟的病毒粒子存在于细胞外，表面有纤突 （如箭头1所示），箭头2所示为细胞膜。×80,000Fig.1d Mature virions are extracellular and there is is membrance. ×80,000
Fig.1c Virions budded into SER (black arrow) and tubers on the exterior of virions( arrow 1), the arrow 2
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图1e.接毒后16h，新一代子代病毒存在于电子密度较高的絮状团块内（白色箭头所示）和空泡内（黑色箭头所示）。×60,000 vesicles (white arrow). ×60,000
图1f.成熟的病毒粒子以出芽方式释放出细胞外（如箭头2所示），箭头1所示为细胞膜。×80,000 Fig.1f Mature virion was budding to extracellular
Fig.1e Virions exist in floccules (black arrow) and (arrow 2),the arrow 1 is membrance. ×80,000
图1g.成熟的病毒粒子以细胞外分泌的方式释放出细胞外（如箭头1所示），箭头2所示为细胞膜。×40,000
Fig.1g Mature vitions were releasing to extracellular by exocytosis (arrow 1), the arrow 2 is membrance. ×40,000
3.3感染细胞的超微病变
在电子显微镜下观察到，在病毒感染初期，细胞超微结构无多大变化，随着病毒感染时间的延长,细胞出现较多空泡，有的空泡内存在病毒，粗面内质网轻微扩张，部分颗粒脱落（见图2a），线粒体增生、肿胀，嵴断裂、溶解（见图2b），胞浆内出现少量溶酶体，髓鞘样结构的物质，有的细胞核膜间隙轻微扩张，细胞核染色质浓缩、边集，嗜碱性增强，胞浆浓缩（见图2c,2d），有少量细胞的核染色质整个消失；有的细胞核膜消失，核裂解，细胞膜内陷，将细胞内容物包裹，然后出芽，形成凋亡小体（见图2e）；到了感染的后期阶段，细胞浆内的细胞器已空泡化，几乎无法辨认，只剩下一些空泡类的结构、溶酶体残体和一些电子密度较高的颗粒（见图2f）；到最后整个细胞破碎、裂解。而正常对照组细胞则无以上相应变化。
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图2.透射电镜观察PRRSV感染Marc-145细胞引起细胞的超微结构变化
Fig.2 Observation by electron microscopy for ultrastructural changes
of PRRSV-infected Marc-145 cells
图2a.病毒粒子存在于滑面内质网（SER）内(箭头所示)，滑面内质网扩张，线粒体（Mi）增生，粗面内质网(RER)轻微扩张，有部分颗粒脱落。×40,000 in the cytoplasm was hyperplastic, the RER slightly dilated and some ribosome particles dropped from it. ×40,000
图2b.线粒体增生，嵴断裂、溶解。×25,000
Fig.2b Plastosome in the cytoplasm was hyperplastic and their cristae collapsed and lysed. ×25,000
Fig.2a Virions exist in dilatate SER (arrow). Plastosome
图2c.胞浆浓缩，滑面内质网扩张呈空泡，胞浆内出现一些次级溶酶体和髓鞘样小体（箭头2所示），细胞核染色质新月状边集于核膜内侧，箭头1为细胞膜，线粒体肿胀，基质呈均质状。×10,000
图2d.胞浆浓缩，胞浆内充满空泡和一些髓鞘样小体(箭头3所示)，细胞膜起泡（箭头4所示），细胞核核膜皱缩（箭头1所示），细胞核染色质浓缩呈环形位于核膜内侧，染色质和核仁轻微空泡化，箭头2所示为
Fig.2c Cytoplasm concentrated and was full of 细胞膜。×8000
vacuolation.Some lysomose and myeloid body presented Fig.2d Cytoplasm concentrated and was full of in the cytoplasm (arrow 2). The chromatin condensed into vacuolation and myeloid bodies (arrow 3),the membrance lunate masses. Plastosome in the cytoplasm dilated and bubbled(arrow 4), the karyotheca crimple(arrow 1). base material homogenize. The arrow 1 is membrance. The chromatin condensed into orbicular, chromatin and ×10,000
nucleolus became lightly vacuolar. The arrow 2 is membrance. ×8,000
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充满空泡，×10,000
cytoplasm concentrated and was full of vacuolation.×10,000
泡。×10,000
图2e.细胞核染色质浓缩，几乎占据整个核，胞浆浓缩，图2f.细胞核染色质浓缩，核膜消失，胞浆内有较多空Fig.2e The chromatin condensed and held the nuclear, Fig.2f The chromatin condensed and karyotheca
disapeared. Cytoplasm were full of vacuolation.×10,000
图2g.细胞核膜消失，核裂解，细胞膜内陷，将细胞分割成许多由膜包裹的凋亡小体。×12,000
图2h.细胞整个空泡化，胞浆内存在一些次级溶酶体、脂褐素和一些电子密度较高的不明颗粒(箭头所示)。
Fig2g. The karyotheca disapeared and nucleus lysed, the ×8,000
membrance become sunken and the cell was divide up Fig.2h Whole cell was full of vacuolation. Some some apoptotic bodies with membrance enwraped. ×12,000
lysomoes, lipochromes and high electron density particles (arrow) presented in the cytoplasm. ×8,000
3.4 细胞凋亡检测结果
3.4.1形态学检测
3.4.1.1 光镜观察
凋亡细胞变圆、变小，细胞核固缩，染色质被染成深蓝色或蓝黑色，胞浆呈淡红色。正常细胞仍保持细胞原有的正常形态，细胞核规整，染成均一的蓝色；坏死细胞体积增大，染色质变稀疏呈网状，核膜碎裂，细胞膜不完整（见图3）。
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3.4.1.2透射电镜观察
凋亡细胞胞浆浓缩，细胞核染色质凝聚，有的呈新月状或呈环状附着于核膜内侧（见图2c,2d），有的占据整个细胞核（见图2e），随着时间进程的发展，核膜消失，核染色质裂解，细胞膜内陷，将细胞分割成许多膜包裹的凋亡小体（见图2g）。
图3.HE染色观察PRRSV感染引起Marc-145细胞凋亡的形态学变化 Fig.3 Observation by HE coloration for morphologic changes of apoptotic cells
in PRRSV-infected Marc-145 cell culture.
图3a.对照组细胞。正常细胞胞核被染成均一的蓝色。图3b. 接毒组细胞。上图：凋亡细胞和坏死细胞的细HE×200. blue. HE×200
胞核被染成深蓝色或黑色（箭头1和3所示），正常细（如箭头2所示）；凋亡细胞体积缩小，变圆，胞核被染成深蓝色，胞浆呈红色（如箭头1所示）；坏死细胞染色质变稀疏呈网状，核膜碎裂，细胞膜不完整（如箭头3所示），HE×400。
Fig3b. Infected group cells. The above picture: nuclear of apoptotic and necrotic cells were navy blue or black, natrual cells were blue, HE ×200. The below pictrue: natural cells were blue(arrow 2), apoptotic cells shrinked,their nuclear were navy blue or black and their cytoplasm were rosiness(arrow 1), necrotic cells were sparse reticulate(arrow 3),HE×400.
Fig.3a Control group cells. Nuclear of natural cells are 胞呈蓝色，HE×200。下图：正常细胞胞核被染成蓝色
3.4.2 生化检测结果
3.4.2.1 DNA Ladder检测
对照组细胞无凋亡，不呈现DNA梯状条带，接毒后24h的细胞与对照组相同，接毒后48h、72h、96h、120h的细胞DNA均出现细胞凋亡的典型梯状条带，且72h最明显，接毒后144h的细胞DNA呈模糊的涂片状（见图4）。
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图4.PRRSV感染Marc-145细胞不同时间点的DNA Ladder电泳图谱。M为100bp DNA Maker； 1、2、3、4、5、6、7条带分别为接毒后24h、48h、72h、96h、120h、144h和对照细胞的DNA。
Fig.4 Analysis by agarose gel electrophoresis for DNA fragmentation of PRRSV-infected Marc-145 cells.Lanes 1, 2, 3, 4, 5, 6 are DNA from PRRSV infected cultures; lane 7 is DNA of
uninfected cultures; lane M is 100bp DNA Maker.
3.4.2.2 ELISA检测
对照组Dλ（表示DNA降解含量）在整个测试时间内变化不大，而接毒组Dλ则变化很大。在接毒后的24h，对照组与接毒组差异不显著，而在接毒后48h、72h、96h和120h，接毒组Dλ的值明显高于对照组，并且在48h上升比较明显，在72h达到最高峰值，在96h、120h又显著下降，甚至在144h，接毒组Dλ低于同期对照组。详细情况见表2和图5。
表2. ELISA检测PRRSV-SC1株诱导的Marc-145细胞凋亡的Dλ值 Table.2 Detection by ELISA for Dλ value of PRRSV-infected Marc-145 cells 感染（或对照）天数
对照组细胞凋亡Dλ值
感染组细胞凋亡Dλ值
Days of infected/control
1天 2天 3天 4天 5天 6天
Dλ value of control group
0.964 1.011 1.111 1.088 1.217 1.151
Dλ value of infected group
1.216 2.374 2.982 1.882 1.613 0.908
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样品的Dλ值/Dλ value of sample4321012345infeted groupcongtrol group6
感染天数/Days infected图5. PRRSV引起的Marc-145细胞凋亡的Dλ值动态变化规律
Fig.5 Analysis for dynamic changing rule of Dλ value of PRRSV-infected Marc-145 cells
3.4.2.3 TUNEL检测
正常细胞的胞核被染成蓝色，凋亡细胞的胞核呈棕黄色或棕褐色。在光镜下每个时间段的样品任选6个视野进行凋亡细胞计数，结果是：对照组细胞在整个时间段内差异不显著（P>0.05），感染组细胞在接毒后的24h和144h与对照组差异不显著（P>0.05），在接毒后48h、72h、96h、120h与对照组差异极显著（P<0.01）。详情见表3和图6，图7。
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图6.TUNEL检测PRRSV引起Marc-145细胞的凋亡。图中A、B、C、D、E、F、G、H分别为正常对照组和感染后24h、48h、72h、72h、96h、120h、144h的细胞，正常对照组细胞和接毒后24h、48h的细胞仅有少量细胞表现为阳性，72h、96h、120h、144h的阳性细胞明显多于正常组。阳性细胞为棕黄色或棕黑色，阴性细胞为蓝色。
Fig.6 Detection by TUNEL for apoptotic cells in PRRSV-infected Marc-145 cell culture. A
small quantity of positive cells with brown-staining nuclei were detected (A,B,C) in cell culture of control group and 24h and 48h p.i. Positive cells obviously increased compared with control group at 24h, 48h, 72h, 72h, 96h, 120hp.i.(D,E,F,G). A great number of cells fell to pieces, just several positive cells were detected at 144 p.i.(H).
表3.光镜下计数PRRSV感染诱导Marc145细胞的凋亡（Ap）百分率
Table.3 Dtection by optical microscope for apoptotic percent of PRRSV-infected Marc-145 cells 感染（或对照）组时间
对照组细胞凋亡百分率（％）
感染组细胞凋亡百分率（％）
Time of infected/control group
24 h 48 h 72 h 96 h 120h 144h
Apoptosis percent of conrtrl group
0.65±0.27 a 0.73±0.19 a 0.71±0.36 a 0.69±0.21 a 0.83±0.30 a 0.89±0.28 a
Apoptosis percent of infected group
0.91±0.21 a 5.86±0.65 b 13.28±2.64 b
9.76±2.73 b 8.69±2.82 b 0.78±0.45 a
注：相同字母者差异不显著（p>0.05）; 不同字母差异极显著（p< 0.01）。
28
细胞凋亡百分率/percent of apoptosis(%)control group1412108642012345感染天数/Days infectedinfected group6
图7.PRRSV感染诱导Marc-145细胞的凋亡百分率的动态变化规律
Fig.7 Analysis for dynamic changing rule of apoptotic percent
of PRRSV-infected Marc-145 cells
29
4 讨论
4.1 病毒的形态发生学
PRRSV粒子呈球形，有囊膜，直径大小约为40－65nm，内含直径大小约25－30nm的核衣壳，囊膜表面有纤突。PRRSV是通过与靶细胞受体介导的细胞内吞作用(endocytosis)进入靶细胞[19, 73]，Duan等[74, 75]还在猪肺泡巨噬细胞上鉴定出210kD膜蛋白，推测它是PRRSV的受体，并针对推测的受体设计单克隆抗体成功的阻断了PRRSV与PAM细胞的结合。其机制可能是利用病毒表面的抗受体蛋白（配体）与细胞表面特定的受体有特异性结合特性，通过特异性受体配体吸附作用将病毒吸附到细胞表面上，使PRRSV与相应受体结合形成复合物，继而此部分质膜凹陷与网格蛋白形成陷窝，陷窝与质膜脱离形成吞噬小泡，经细胞内吞作用将病毒摄入细胞内，这一过程在病毒进入早期阶段可通过对PRRSV和网格蛋白的共同定位观察到[74]，在病毒进入晚期，病毒在内吞小泡内脱去外衣，经内在化后，病毒开始在胞浆内复制，在此过程中,细胞内低pH值对病毒进入尤为重要[73, 76]。病毒是否能内在化对病毒能否在细胞内复制是非常关键的。Luiz [19]等研究表明，虽然PRRSV也能通过细胞内吞机制进入Vero细胞，但却不能复制新的病毒，用聚乙二醇（PEG）处理后，同用PRRSV的RNA转染细胞一样能产生新的子代病毒，其原因是病毒虽被吞进细胞，但细胞不具有使病毒内在化的机制，病毒核酸不能释放，而PEG处理，则代替了细胞使病毒内在化的机制，使病毒核酸释放，所以才能复制。这就说明病毒能否适应于一种细胞株，关键不仅要看病毒能否进入细胞，还要看该细胞能否让进入细胞内的病毒内在化，即使病毒脱囊膜、衣壳，释放核酸进入细胞浆。病毒在胞浆内复制到第1代子代病毒出现的这段时间通常称为病毒的隐蔽期[63]，根据一些资料报道[63]，PRRSV感染后6小时就能检测到病毒抗原，9小时就发现第1代子代病毒的出现。在本研究中，观察到第1代子代病毒是在感染后16小时，分析原因可能是不同的毒株在不同细胞上的隐蔽期不同的原因。Pol[58]等分别在PAM和CL2621细胞上对LV株,VR2332株和来自于VR2332的疫苗株JJ1882三株毒株的形态发生学作了比较,结果发现在PAM细胞上LV,VR2332和JJ1882三株PRRSV检测到病毒抗原的时间分别为6h，12h，9h，观察到第1代子代病毒的时间分别为9h，12h，12h；而在CL2621上其检测到抗原的时间是12h，9h，6h，观察到病毒的时间是18h，12h，9h，说明不同的毒株在不同的细胞上复制时间是不同的。本研究结果显示，感染后16h观察到病毒出现在一些电子密度深浅和大小不一的絮状团块内和一些空泡内，这些絮状团块物质具体是什么还不清楚，但猜测可能与病毒的复制有关。从絮状团块出来的病毒有的游离存在于细胞质中，有的以出芽方式进入胞浆空泡内。研究结果表明，病毒增殖到一定的程度，病毒开始释放出细胞外，有的是以细胞外分泌的方式，有的是以出芽的方式。存在于细胞空泡内的病毒则通过空泡向胞浆膜
30
移动，与细胞质膜融合，然后以细胞外分泌的方式释放出细胞；而散在存在于细胞质中的病毒，则是通过细胞膜出芽的方式释放出细胞。
4.2病毒感染引起细胞超微结构变化
在电子显微镜下观察到，在病毒感染初期，由于病毒在细胞内复制增殖还需要一定的时间，所以对细胞的影响不大，细胞无明显的超微结构变化。而在感染后期，细胞首先出现的超微结构变化是细胞浆内的空泡增多，这些空泡可能是由于病毒向内质网出芽，存在于其中，而引起的滑面内质网扩张所致，但并不是所有的空泡都存在病毒，所以细胞内的空泡与病毒的感染有关这是一定的，但具体是什么机制导致，目前还不清楚。据资料报道[77]，线粒体是细胞凋亡中不可缺少的介质，但它与细胞凋亡的确切关系还不十分清楚。现在有一种假说[78]，细胞凋亡是一种受基因指导的主动性的细胞自我消亡的过程，这个过程需要能量，因而细胞的ATP水平与细胞凋亡密切相关。每一个细胞都有其特定的ATP水平，只要细胞的物质代谢能够维持该水平的ATP供应，细胞就能存活；当ATP水平下降，但仍能保证凋亡过程中所需的能量供应时，细胞就发生凋亡；只有当ATP水平突然下降到无法启动细胞凋亡时，细胞才会坏死。所以电镜观察发现感染早期细胞发生线粒体增生，这可能与细胞受损后能量代谢增强有关[79]，因为病毒复制后，需要细胞参与合成一些病毒装配所需的蛋白，所以导致细胞能量需求增大；随着时间进程，线粒体嵴肿胀、脱落、溶解，到最后呈现空泡化等超微结构变化。这可能是线粒体逐渐发生代谢性功能衰竭，线粒体是细胞能量供应的主要结构，一旦衰竭，则整个细胞的ATP水平下降，而下降过程是逐渐的，当下降到一定程度时，就诱导了细胞凋亡的发生。若是在体内，这些凋亡细胞会被机体的吞噬细胞清除，但在体外培养的细胞，最终也会走向坏死的结局，所以到感染的最后阶段，细胞超微结构表现为细胞坏死，整个细胞破碎，裂解，消失。另外在感染的后期，细胞内出现一些溶酶体，这可能是由于细胞内的一些细胞内容物出现病变后，细胞为了自身的生存，形成溶酶体以清除这些已无用的细胞内容物。细胞内的髓鞘样结构，有的资料说是线粒体功能丧失后形成的
[79]
，也有资料说，是溶酶体吞噬了一些物质后，最终一些物质不能被消化而形成的
残体[80]，目前还没有明确的解释。另外，细胞内出现的无膜包裹的电子密度较高的颗粒，有的资料称它为核仁样小体，是代表核仁物质进入细胞浆[79]。总之，细胞的这一切变化在对照组细胞都没发现，所以可以肯定，细胞的这些超微结构变化与病毒的感染有关。
4.3 PRRSV引起细胞凋亡
4.3.1细胞凋亡的形态学变化
细胞凋亡与坏死不同,表现在发生机制、形态学和生物化学等各个方面。细胞坏死亦称病理性死亡,是缺氧、代谢毒物等有害因子作用于细胞引起的炎症反应,主
31
要表现为染色质凝集成大小不等的团块，细胞器肿胀、膨大，最后细胞膜破裂、溶酶体酶释放,最终导致细胞和组织的炎症反应，而细胞凋亡（Apoptosis）则是发生于正常生理或病理状态下的细胞死亡,其始发因素往往源于细胞内外的死亡信息,通过信息传递而导致某些基因的转录、翻译,这些蛋白质最终作用于细胞引起细胞凋亡。细胞凋亡有着典型的形态学变化，主要表现为：细胞体积缩小，胞核、胞浆收缩，染色质固缩，常聚集于核膜上,呈境界分明的新月形或块状小体,胞膜皱摺或出泡。其特征性的改变是凋亡小体的形成，它是以细胞在凋亡晚期由完整的以出芽的形式包裹部分细胞器和染色体碎片而形成的一种膜性小体。凋亡小体被邻近吞噬细胞吞噬,不引起周围组织的炎症反应。
目前认为，细胞凋亡的特征性形态学改变是判定细胞凋亡最可靠的指标[81]，是细胞凋亡的一种定性检测方法，所以说形态学检测是生化检测的基础。在本研究中，采用了两种形态学检测方法，检测结果显示病毒感染组与对照组有明显的差别，对照组细胞基本正常，而病毒感染组在细胞形态上具有明显的细胞凋亡的形态学特征，也有部分细胞表现为坏死的形态学变化，所以说形态学检测结果表示PRRSV能引起Marc-145细胞凋亡。
4.3.2 DNA Ladder检测方法原理
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180-200bp长的DNA片段, 或其整数倍的寡核苷酸片段。凋亡细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱(DNA ladder)，而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状[82]。
4.3.3 ELISA检测方法的原理
2+2+
细胞发生凋亡时，Ca、Mg依赖性内源性核酸内切酶激活，在核小体连接区切
开双链DNA，产生带有单个或寡聚核小体的DNA片段。而核小体DNA与中心组蛋白H2A，H2B，H3和H4紧密结合，又可以防止核酸内切酶的切割作用，故产生的DNA片段是180-200bp的整数倍，在凋亡细胞的胞浆中出现核小体或寡聚核小体[83]。该法是利用 “夹心定量酶标免疫测定法”原理，用抗组蛋白-生物素和抗DNA-过氧化物酶（POD）分别结合到核小体的组蛋白和DNA成分上，洗涤除去未结合的抗体后，加入POD底物产生颜色反应，通过酶标测定仪分析，即可定量反映细胞凋亡的水平。
4.3.4 TUNEL检测方法的原理[84, 85]
在细胞发生凋亡时，由于其DNA断裂是内源性的DNA内切酶激活所致，其断端3'-OH暴露，这是凋亡细胞DNA断裂的特征之一，以此有别于细胞坏死的DNA断裂(坏死细胞DNA断裂是无规则的,其中也有少数可出现3'-OH的暴露，但数量极微弱，不易检测出来)，以此特性，在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的作用下，在无需模版
32
的情况下，可进行3' 端的脱氧核苷酸合成，如果在反应系中加入标记的脱氧核苷酸，则在3' 端出现一段带有标记物的寡核苷酸，通过荧光显示或其他显色反应，可以原位地较特异地显示发生凋亡的细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
4.3.5 细胞凋亡动态变化规律的探讨
DNA Ladder实验结果显示，PRRSV感染病毒后24h，未检测到凋亡的发生，感染后48h、72h、96h、120h检测到凋亡的发生，且72h最明显，144h表现为坏死；EILSA实验结果显示在接毒后24h接毒组与对照组无明显差异，48h、72h、96h、120h出现明显不同于对照组的细胞凋亡现象，72h达高峰，96h、120h细胞凋亡水平下降，144h甚至下降到对照组水平以下；TUNEL法检测结果显示，接毒后24h、144h与对照组细胞凋亡水平无显著差异，在接毒后48h，72h，96h，120h与对照组细胞凋亡水平有极显著所差异。分析原因可能是因为病毒感染宿主细胞后，由于病毒自身结构简单，必须利用宿主的能量和物质来进行复制、装配；而细胞在病毒感染后发生凋亡是机体的一种保护反应，有助于维持正常的生理功能，是宿主对病毒的抵抗机制之一。凋亡的发生对于病毒的大量复制显然是非常不利的，是对周围未感染细胞的一种保护性机制，病毒为了存活必须具备各种调节凋亡的机制来面对宿主发生的这种内在化的程序化细胞死亡，以便使凋亡向有利于病毒生存和复制的方向发展，就如我们在电子显微镜下观察到的，尽管在接毒后20h就已经有病毒自细胞内释放，但细胞超微结构却几乎无任何变化。因此，经过长期的选择和进化，在感染早期很多病毒具有抗凋亡的机制来阻止或延迟病毒感染的细胞发生凋亡，这段时期有可能就是本实验中的接毒后前24h的这段时期；而在感染后期，当它们已产生足够多的子代病毒时，就促进凋亡，加速病毒扩散，这段时期有可能就是本实验中的PRRSV感染后48h、72h、96h、120h、144h这段时期。但96h、120h、144h这段时期，是病毒感染的末期，从理论上说细胞凋亡水平应继续升高，而实验中实际检测到96h、120h、144h细胞凋亡水平却反而下降，其确切原因目前还不是很清楚。结合电子显微镜观察和TUNEL法在144h的检测的结果，分析原因可能是在体外培养细胞接毒后，随着时间的推移，细胞最终会发生继发性坏死，导致细胞膜和核膜破裂，细胞内容物释放到培养液中。本实验在处理样品的过程中，第一步就需要离心取沉淀，弃上清，所以很可能在这一步的操作中，将细胞破裂后，释放到营养液中的核小体丢失，最终所检测到的核小体仅仅是未破裂细胞胞浆内的核小体。这与DNA Ladder 电泳和TUNEL检测结果也相一致，在电泳图谱上我们可见到，接毒后96h、120h的梯状条带逐渐减弱，甚至在144h呈坏死的涂片状；从TUNEL检测结果中，我们可以看到，接毒后72h的细胞涂片比96h、120h、144h的阳性细胞较多。另外，ELISA和TUNEL检测正常组细胞也表现一定水平的细胞凋亡，这是细胞培养正常情况下的细胞凋亡。而ELISA和TUNEL法实验结果显示在对照组和接毒后24h、144h
33
（DNA Ladder 未检测到细胞凋亡的时间段）也检测到少量的凋亡细胞，这一点可以看出ELISA和TUNEL法较DNA Ladder法更灵敏。而在接毒的48hTUNEL所检测到的凋亡细胞与24h相比，没有DNA Ladder和ELISA方法所检测到的细胞凋亡与24h差别明显，分析原因可能是实验中接毒后24h的细胞几乎无细胞脱落现象，而48h的细胞则有部分细胞已脱落，在TUNEL检测中未收集48h脱落的细胞进行检测，而在DNA Ladder和ELISA检测中，对脱落细胞也进行了收集，而由于凋亡细胞易于脱落，所以TUNEL法所检测到的凋亡情况往往是低于实际情况。三种方法的检测结果基本一致，相互验证了其可靠性。
本实验结果表明，PRRSV感染能引起体外培养Marc-145细胞凋亡的动态变化规律为：在接毒后的24h开始出现凋亡现象，48h更加明显，72h达到高峰，96h后凋亡水平有所下降，与资料报道的基本相符。Theerapol 等[48]用 PRRSV的ATCC VR2385株感染ATCC CRL11171细胞，结果表明凋亡主要出现在48h、72h、96h；Taeg Su Kim a 等[46]用PRRSV的SDSU-23983野毒株P6和细胞适应株P136感染Marc145细胞，结果表明，P136感染的细胞，在48h出现凋亡现象，72h最明显；而P6感染细胞后，96h出现凋亡现象，所以说不同的毒株诱导凋亡的能力不同。还有，在TUNEL检测结果中，有的细胞胞浆内也出现阳性信号，关于这种现象，Theerapol等[48]的研究中也发现过，推测原因可能是因为凋亡的步调不一致，邻近正常细胞吞噬了先凋亡的细胞释放出的凋亡小体而导致。
4.3.6关于PRRSV究竟是引起感染细胞还是邻近细胞凋亡的探讨
关于PRRSV究竟是引起感染细胞凋亡，还是感染细胞的邻近细胞凋亡，目前有较大争议。Theerapol等[48]用原位末端标记和原位杂交双标记法检测凋亡阳性细胞和定位病毒感染阳性细胞，发现两种阳性结果很少在同一细胞中出现，即使有病毒感染细胞出现凋亡阳性，也是在胞浆而非胞核，随意推测这些凋亡的阳性标志是被病毒感染细胞吞噬入胞浆的，得出PRRSV诱导感染细胞的邻近细胞而非病毒感染细胞发生凋亡的结论。另外，Miller等[44]利用显微实验和半定量RT-PCR检测PRRSV感染Marc-145细胞后凋亡基因的表达，检查结果发现，26个凋亡相关基因在感染的前24h无任何变化，也得出凋亡现象不是发生在PRRSV感染细胞。在该实验中电子显微镜下，也观察到凋亡细胞无病毒粒子存在，但在同实验组的别的同学在组织内观察到凋亡细胞有病毒粒子存在，分析原因可能是由于在体外培养的细胞，机体的调节功能相对于活体猪上较弱，病毒一旦感染细胞，增殖到一定程度，细胞来不及启动凋亡机制而迅速发生坏死，所以在病毒感染的细胞主要是观察到细胞坏死的现象，而在邻近细胞，病毒对其的影响相对较弱，所以有充分的时间启动凋亡，发生程序性渐进死亡。结合前面所提到的两篇文献也都是在体外细胞培养上做的，所以认为PRRSV引起邻近细胞发生凋亡。而在组织内则不同，病毒感染后，通过机体调节，不是很快就导致感染细胞发生坏死，所以有时间启动凋亡机制发生凋亡。所
34
以认为PRRSV既能引起病毒感染细胞发生凋亡，也能引起邻近细胞发生凋亡。
4.3.7 PRRSV引起细胞凋亡机制的探讨
PRRSV感染后究竟是什么机制导致细胞凋亡，目前仍然不是十分清楚。概括地说，病毒诱导靶细胞凋亡的途径主要有两种：（1）经免疫系统介导；（2）或病毒本身具有凋亡调节基因，病毒凋亡调节基因通过模仿或调节细胞凋亡途径中某些保守成份而发挥作用。
（1）经免疫系统介导凋亡
CTL对清除动物体内的病毒具有重要意义。其细胞毒作用有两种机制，其一是通过分泌穿孔素使细胞膜穿孔，靶细胞因渗透作用肿胀、破裂，这是细胞的坏死(necrosis)。另一种机制则由CTL介导的靶细胞凋亡。CTL上调凋亡抗原及其配体基因(Fas/Fasl)，靶细胞出现胞浆空泡化、染色体浓缩、核破裂、DNA裂解、形成凋亡小体等变化。小鼠肝炎病毒(Mouse Hipatitis virus ,MHV)主要是以此机制介导凋亡的，将病毒特异性CD8+CTL加入MHV感染细胞后1h，靶细胞即发生凋亡。加入后4h，病毒复制被完全抑制。由此证明, CTL介导的凋亡是机体的抗病毒机制之一。（2）病毒编码的蛋白诱导细胞凋亡
迄今为止已知的可诱导细胞凋亡的三十多种病毒主要通过以下几种方式来诱导宿主细胞发生凋亡。 ①通过caspase途径诱导凋亡
半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protei nase,
caspase)家族成员是近两年来发现的在细胞凋亡过程中起关键作用的酶,现已发现
10余种。无活性的酶前体约30kDa-50kDa,其内部保守的天冬氨酸残基位点经蛋白酶切割后形成3个亚单位,其中N端的亚单位不参与活性caspase的形成,其余2个亚单位形成有活性的异二聚体(P20/P10)。激活的caspase又可作用于其自身和其他caspase酶原,按一定顺序激活caspase,激活的caspase作用于PARP[Poly(ADP ribose) polymerase ]、H1、PKC、fodrin、lamins、actin、Bcl-2等不同底物,经不同的信号转导途径,促进细胞凋亡。目前发现的依赖于caspase途径来诱导细胞凋亡的病毒主要是冠状病毒科成员,即猪传染性胃肠炎病毒、鼠肝炎病毒、猫腹膜炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒。已经证实猪传染性胃肠炎病毒通过caspase-6、cas-pase-7来发挥作用[86]；鸡传染性支气管炎病毒通过cas-pase-3发挥作用[87]。此外,副黏病毒科肺病毒属的呼吸道合胞体病毒通过引起caspase-1的表达来促进中性粒细胞的凋亡。非洲猪瘟病毒诱导Vero细胞凋亡的过程中伴随着caspase-3的激活[88]。人免疫缺陷病毒也通过caspase途径诱导细胞凋亡[89]。 ②通过增强P53的表达来促进凋亡
P53是一种肿瘤抑制基因，可分为野生型和突变型。其生物学功能是在G1期监视细胞基因组DNA的完整性，如果DNA受损伤，P53蛋白就使细胞停留在G1期，若
35
损伤不能修复，则诱导其凋亡，从而避免细胞癌变。若P53突变则丧失其功能。目前认为只有野生型P53才具诱导细胞凋亡的作用。基因产物主要存在于细胞核内,积累时可促进细胞凋亡,当其缺乏时会引起肿瘤细胞的无限繁殖,P53能特异性的抑制Bcl-2的表达,但对Bax的表达具有促进作用。因而某些病毒通过上调P53来刺激细胞凋亡,如腺病毒的E1A蛋白、乳多空病毒属的SV40病毒和多瘤病毒的large7蛋白、棘瘤病毒的E7蛋白、人的T细胞白血病病毒的tax蛋白等[90]。最近的研究表明人免疫缺陷病毒I型通过P53的表达诱导T细胞凋亡[91]。有实验表明,P53虽然可以促进细胞凋亡,但不是细胞凋亡的必要条件。例如:乙型肝炎病毒的HBx蛋白诱导细胞凋亡就是非P53依赖性的[92]。 ③通过抑制NF-κB的表达促进凋亡
NF-κB是一种调节基因转录的核因子,它的活化会抑制凋亡的进行。最近的研究表明,NF-κB的活化能阻止处于caspase级联反应顶端的caspase-8活化,从而抑制凋亡。NF-κB的靶基因是TRAF1(TNFR结合因子1)、TRAF2(TNFR结合因子2)、IAP(抑制凋亡蛋白)。某些病毒通过NF-κB来调节细胞凋亡,例如黄病毒科的丙型肝炎病毒的核心蛋白抑制NF-κB的活性,促进凋亡的发生[93]。 ④过促进死亡受体信号转导来促进凋亡
可引起细胞凋亡的死亡信号转导途径主要是FasL/Fas途径和TNF/TNFR途径。FasL/Fas途径:当Fas和FasL结合后发生多聚化,Fas受体胞浆中的DD(死亡区域)与胞浆中的FADD(Fas相关死亡区域)C端的DD结合。FADDN端的DED(死亡效应区)与caspase-8结合,从而激活效应caspase,引发凋亡。除了FADD外,与FasL/Fas途径相关的其他胞浆蛋白还有RIP(receptor interaction protein)、FAP-1(Fas相关磷酸酶1,抑制Fas介导的凋亡)、FLIP(FLICE抑制蛋白,抑制凋亡)。许多种病毒都通过上调FasL、Fas来促进细胞凋亡,如HIV-1(人获得性免疫缺陷病毒)的Tat蛋白就是FasL的促进剂[94]。正粘病毒科的流感病毒A/B也能上调Fas的表达。某些肿瘤细胞如黑色素瘤细胞中可见FLIP的高表达。TNF/TNFR途径:TNF/TNFR途径重要分子是TRADD(TNFR相关死亡区域),它不但介导TNFR-1的凋亡信号转导,还介导TNFR诱导转录因子NF-κB、Apaf介导的caspase活化。利用TNF/TNFR途径诱导细胞凋亡的病毒很多。腺病毒的E1蛋白、乙型肝炎病毒的的HBx蛋白可以增强细胞对TNF的敏感性。疱疹病毒科的HHV6/7病毒能提高感染细胞周围非感染的旁观者细胞(bystandercell)中的TNFR1的表达。黄病毒科丙型肝炎病毒的核心蛋白能连接TNFR1的胞浆区。最近的研究表明,鸡新城疫病毒可通过肿瘤坏死因子有关的配体来诱导细胞凋亡[95]。 ⑤其它途径
除了以上途径外,病毒还通过其它几种途径诱导感染细胞凋亡。例如细小病毒科的MVM病毒的NS1蛋白、反转录病毒科的HIV-1的Vpr蛋白都能调整细胞的生活周期,可诱导细胞在G2期发生阻滞,从而引起细胞的凋亡[96]。某些病毒能影响细胞
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内的离子转运来诱导凋亡,如HIV-1的Gp160蛋白能提高细胞内钙离子的浓度,从而引起细胞死亡[97]。还有一些病毒通过氧化应激途径来诱导凋亡,例如HIV-1的Tat蛋白[98]。
而对于PRRSV来说，现已明确，这种细胞凋亡作用与GP5蛋白有关[51-53]，而且 GP5诱导的凋亡不能被抗凋亡蛋白Bcl-2抑制，说明GP5诱发凋亡是作用在抗凋亡因子Bcl-2的下游，或其它未知的凋亡机制在起作用[51, 54]。缺失突变质粒的体外瞬时表达试验表明，GP5 N端的118个氨基酸对于保持GP5诱导细胞凋亡的活性必不可少，而缺失其C端并不影响此活性[55]。Choi等[56]研究还发现，以 PRRSV感染猪引起TNF-可在肺组织的高效表达，说明细胞凋亡与α－肿瘤坏死因子（TNF－α）的表达有关，所以推测PRRSV诱导细胞凋亡很可能是通过死亡受体信号转导来促进凋亡的。但具体是怎样的过程，在以后的实验中还有待于进一步研究。
37
5 结论
5.1 PRRSV的病毒形态发生学
病毒感染细胞后，吸附于细胞膜，通过细胞内吞机制进入细胞，内在化后，释放核酸，在胞浆内复制、装配，装配好的病毒有的通过出芽方式进入胞浆空泡内并获得囊膜，然后通过细胞外分泌的方式释放到细胞外；有的散在于细胞质中，以出芽方式向细胞外释放并获得囊膜。
5.2 PRRSV感染Marc-145细胞引起的超微结构变化
病毒感染后，细胞超微结构变化主要表现为细胞内空泡增多，线粒体增生，嵴
肿胀、脱落和典型的细胞凋亡特征以及细胞坏死现象。
5.3 PRRSV感染引起Marc-145细胞的凋亡
PRRSV感染能诱导体外培养Marc-145细胞发生凋亡，凋亡主要发生在感染后48h到120h；在感染的初期，细胞凋亡不明显，而在感染后期，细胞表现为坏死。
5.4 PRRSV感染后引起的细胞超微结构变化和细胞凋亡与病毒形态发生的关系
PRRSV感染后引起的细胞超微结构变化和细胞凋亡与病毒形态发生有着密切的关系，细胞超微结构变化和细胞凋亡受病毒形态发生的控制。
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致 谢 本研究是在汪铭书教授和程安春教授的精心指导下完成的，两位导师在繁忙的科研和教学工作中，花费了大量的心血来指导本研究的选题、设计和论文的撰写。三年的学习期间，两位导师对我的学习和生活给予了莫大的关怀和帮助。导师严谨求实、敬业奉献的人格魅力和本实验室勤奋学习，探索求知、积极实践、勇于创新的良好氛围，给我予熏陶，让我在专业理论和实验技能等多个方面得到了提高，这段学习的经历将是我今后工作和生活中最可宝贵的人生财富。在此论文完成之际，我向辛勤培养我的两位导师致以最衷心的感谢！
在本实验及论文完成的过程中还得到了周毅老师、陈孝跃老师及实验室其它研究生给予大量的支持和帮助，在此向他们表示诚挚的感谢！
感谢所有关心、支持、帮助和爱护我的领导、老师、同学和家人！
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攻读学位期间发表的学术论文目录
第一作者：
1 细胞凋亡检测技术的研究进展，中国兽医科技，2004，34（11）：45－48。 2 DNA Ladder和ELISA联合检测PRRSV诱导Marc145细胞凋亡动态变化
规律的研究，四川农业大学学报，2005，23（1）：95－98。
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