(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103626834 A(43)申请公布日 2014.03.12
(21)申请号 201310668749.9(22)申请日 2013.12.11
(71)申请人江苏省农业科学院
地址210014 江苏省南京市玄武区钟灵街
50号(72)发明人李辉 施振旦
(74)专利代理机构江苏圣典律师事务所 32237
代理人孙忠浩(51)Int.Cl.
C07K 1/14(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页权利要求书1页 说明书4页
(54)发明名称
一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用(57)摘要
本发明涉及一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用，所述缓冲液由基础液和5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20、10mM的β-环糊精、1M的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成；其配制方法为先向基础液中加入4M的尿素；后加入体积比为5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20以及10mM的β-环糊精和1M的L-半胱氨酸，即形成重组蛋白复性缓冲液；本发明所述缓冲液应用于初始蛋白浓度高于1mg/mL的重组蛋白复性，操作简单，成本低，方便工业化生产，复性后蛋白体积增大较少，蛋白浓度稀释较小，并且复性率较高。
CN 103626834 ACN 103626834 A
权 利 要 求 书
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1.一种重组蛋白复性缓冲液，其特征在于，所述缓冲液由基础液和5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20、10mM的β-环糊精、1M的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成；所述基础液包括20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl和无菌水。
2.一种如权利要求1所述的缓冲液的配制方法，其特征在于：A)基础液的配制：在无菌水中加入 20mM的Tris-HCl 、 200mM的NaCl，调节pH为8.0；
B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素；
C)向步骤B溶液中加入体积比为5‰的β-巯基乙醇 、 1%的吐温-20 以及10mM的β-环糊精 和1M的L-半胱氨酸，形成重组蛋白复性缓冲液。
3.一种如权利要求1所述的缓冲液在初始蛋白浓度高于1mg/mL的重组蛋白复性中的应用。
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CN 103626834 A
说 明 书
一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用
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技术领域
[0001]
本发明涉及生物化学领域，特别是一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应
用。
背景技术
[0002] 由于重组蛋白在细菌体内表达导致肽链的不完全修饰、错误折叠和聚集，一般以包涵体的形式存在。破碎细菌获得纯净的包涵体，经变性剂（6M盐酸胍或8M尿素）溶解后，必须经过复性使蛋白正确折叠，提高溶解度并且恢复生物活性后才能达到临床应用的水平。如果蛋白不能很好地复性，则直接表现为溶解度下降，蛋白析出沉淀，从而造成蛋白的大量损失。由于技术水平的限制，蛋白质的复性和纯化是限制生物制药领域快速发展的瓶颈。目前常用的包涵体蛋白复性的技术主要有：透析复性、稀释复性、人工分子伴侣、柱色谱复性以及反胶团溶解复性等。上述各复性方法多少存在着种种问题，例如：透析复性将变性蛋白放入透析袋中，通过缓慢联系的降低变性剂的浓度实现蛋白复性，虽然操作简单但是耗时长，处理体积小，无法大规模工业化应用。稀释复性是通过将变性蛋白溶液用水或复性缓冲液稀释，实现变性剂浓度的缓慢下降，达到蛋白复性的目的，但是在目前没有通用的复性缓冲液，而且据目前文献报道，通过该方法复性时，需将蛋白浓度控制在较低的水平，不适用于高浓度的蛋白，目前的稀释复性方法中一般将初始蛋白浓度控制在10-100µg/mL，甚至更低。因此，用传统的复性方法会大量稀释蛋白，最终造成体积的快速增加，导致后期蛋白浓缩困难，也不适用于工业化的生产。人工分子伴侣的复性常用Hsp家族蛋白和GroES /GroEL等，人工分子伴侣能够显著提高蛋白复性率，但同时也会显著提高生产成本。柱色谱复性以及反胶团溶解复性需要材料和设备特殊、成本较高、不适用于制药工业的大量制备等，而且操作过程相对繁琐。总之，目前尚未有适用于初始蛋白浓度高于1mg/mL的复性报道。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供针对蛋白复性技术的不足，提供一种高浓度重组蛋白快速复性的缓冲液。本发明的目的是这样实现的：
一种重组蛋白复性缓冲液，其特征在于，所述缓冲液由基础液和5‰β-巯基乙醇 、1%的吐温-20、10mM的β-环糊精、1M的L-半胱氨酸以及4M的尿素组成；所述基础液包括 20mM的Tris-HCl 、200mM的NaCl和无菌水。[0004] 本发明中，所述的缓冲液的配制方法：
A)基础液的配制：在无菌水中加入20mM的Tris-HCl、 200mM的 NaCl，调节pH为8.0；B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素；
C)向步骤B溶液中加入体积比为5‰的β-巯基乙醇 、 1%的吐温-20 以及10mM的β-环糊精 和1M的L-半胱氨酸，形成重组蛋白复性缓冲液。
[0005]
一种如权利要求1所述的缓冲液在初始蛋白浓度高于1mg/mL的重组蛋白复性中
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说 明 书
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的应用。
[0006]
本发明的优点在于：操作简单，成本低，所需的仪器药品均为实验室常规用品，方
便工业化生产，而且可以对浓度高于1mg/mL的蛋白进行复性。复性后蛋白体积增大较少，蛋白浓度稀释较小，并且复性率较高；复性后的蛋白可以经过等电点沉淀后，去除残留的药物，同时可以除去一部分杂蛋白，等电点脱盐和初步纯化的蛋白为清澈透明液体，方便后续纯化操作。
具体实施方式
[0007] 实施例1 重组蛋白复性缓冲液配置
A)基础液的配制：在无菌水中加入 20mM的Tris-HCl 、 200mM的 NaCl，调节pH为8.0；
B)向步骤A所述基础液中加入4M的尿素；
C)向步骤B溶液中加入体积比为5‰的β-巯基乙醇 、 1%的吐温-20 以及10mM的β-环糊精 和1M的L-半胱氨酸，形成重组蛋白复性缓冲液。[0008] 实施例2 初始蛋白溶液的配制
基础液的配制：
在无菌水中加入 20mM的Tris-HCl 、 200mM的 NaCl，调节pH为8.0；向基础液中加入8M的尿素，搅拌均匀，配制成混合溶液，将初步纯化的重组猪抑制素α亚基蛋白包涵体10g溶解在500mL所述混合溶液中，得到初始浓度为20mg/mL的重组猪抑制素α亚基蛋白包涵体溶液（以下简称初始蛋白溶液）。
[0009] 本实施例涉及的初步纯化的重组猪抑制素α亚基蛋白包涵体是申请人依据中国专利CN201010618516.4公开的方法获得。[0010] 实施例3 重组蛋白的复性
基础液的配制：
在无菌水中加入 20mM的Tris-HCl 、 200mM的 NaCl，调节pH为8.0；（1） 将实施例2获得的浓度为20mg/mL的初始蛋白溶液在4℃下慢速加入实施例1获得的重组蛋白复性缓冲液（以下简称缓冲液）中，同时缓慢搅拌，所述初始蛋白溶液与缓冲液的体积比为1:1；搅拌均匀后在4℃环境下，12000rpm离心10min，收集蛋白上清液；
（2）将基础液慢速加入缓冲液中，形成稀释的复性缓冲液，其中尿素的终浓度为1M，所述基础液与缓冲液的体积比为3:1；将步骤（1）获得的蛋白上清液在4℃环境下缓慢加入所述稀释的缓冲液中，同时缓慢搅拌，所述的蛋白上清液与稀释的缓冲液的体积比为1:1；搅拌均匀后，在4℃环境下，以12000rpm离心10min，收集蛋白上清液；
(3) 将步骤（2）获得的蛋白上清液慢速加入等体积的基础液中，同时缓慢搅拌，搅拌均匀后，在4℃以12000rpm离心10min，收集蛋白上清液，即为复性的重组猪抑制素α亚基蛋白溶液，完成重组猪抑制素α亚基蛋白的复性。[0011] 经OD280法检测，复性的重组猪抑制素α亚基蛋白溶液中蛋白终浓度约为2.2 mg/mL。蛋白的复性，直接表现在蛋白的溶解度上，即：复性好的蛋白呈溶解状态，未复性的蛋白则沉淀析出，经过离心去除。根据复性前和复性后呈溶解状态的蛋白的含量，复性蛋白占总蛋白的百分比，计算出蛋白的复性率。
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复性率计算公式如下：
本实施例中，复性前蛋白总量为10g，复性后的蛋白为约8.8g，因此蛋白复性率为88%。[0013] 实施例4 复性蛋白液的脱盐和初步纯化
（1）实施例3中所得到的复性的重组猪抑制素α亚基蛋白溶液通过调节pH至蛋白的等电点，约5.5左右，蛋白沉淀析出。经过离心（12000rpm，4℃）弃上清，收集蛋白沉淀。加入无菌水重悬，调节pH值到8.0，蛋白质重新溶解；
（2）重复步骤（1）两次，并将蛋白再次沉淀；（3）将收集的蛋白沉淀，加入无菌水重悬，调节pH值至8.0使蛋白溶解。并调节pH至7.0，获得纯净蛋白。所得到的纯净蛋白中含盐量极低，并且，复性过程中添加的有毒β-巯基乙醇等均被除去，经过高效气相色谱检测发现，β-巯基乙醇的残留量检不出。在收集蛋白沉淀时，一些等电点偏离的蛋白而溶解在上清中，弃上清的同时杂蛋白也被除去, 起到进一步纯化的作用。
[0014] 实施例5与传统的稀释复性进行对照试验
依实施例2所述方法配制初始浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的初始蛋白溶液。
[0015] 对照实验分为实验组与对照组，实验组依照实施例3所述重组蛋白复性方法；
对照组采用如下复性方法：复性缓冲液的配制：在无菌水中加入 50mM Tris-HCL、150mM NaCl 、1mM EDTA 以及2M尿素 ，pH调至8.0；
在4℃环境下，缓慢将初始蛋白溶液加入复性缓冲液中，所述蛋白溶液与复性缓冲液体积比为1：7；并用磁力搅拌器不断搅拌24h，然后在4℃以12000rpm离心10min，除去沉淀，收集蛋白上清液，用OD280法测定蛋白浓度。结果如表1所示。[0016] 表1 不同浓度初始蛋白的复性效率
在高蛋白浓度下，用传统复性缓冲液，蛋白复性率很差，不足10%。[0017] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，而非对本发明的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，
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这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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