高等植物谷氨酰胺合成酶基因的研究进展

于瑶;张汉尧;杜建伟

【摘 要】Nitrogen is an important nutrient for plant growth, but the exogenous inorganic nitrogen must be assimilated into organic nitrogen which can be absorbed by higher plants. Glutamine synthetase ( GS) is the key enzyme involved in the process of nitrogen assimilation. In this article, the types, function, physicochemical and molecular biology properties and the gene expression of GS were summarized.%氮是植物生长的一个重要营养元素,但外源无机氮必须经氮同化转化为有机氮才能为植物所利用.谷氨酰胺合成酶(GS)是参与氮同化过程的关键酶,本文从GS种类、功能、理化和分子生物学性质及基因表达调控等方面介绍了其研究进展. 【期刊名称】《山东农业科学》 【年(卷),期】2012(044)004 【总页数】5页(P15-19)

【关键词】谷氨酰胺合成酶(GS);基因工程;研究进展 【作 者】于瑶;张汉尧;杜建伟

【作者单位】西南林业大学,云南昆明650224;西南林业大学,云南昆明650224;西南林业大学,云南昆明650224 【正文语种】中 文 【中图分类】Q559+.3-1

对于高等植物来说，从环境中吸收的主要是无机氮源，如:氮气(N2)、酰胺态氮、硝态氮以及铵态氮。无论什么形式的外源无机氮，进入植物体后，都必须先被转化为，再经氮同化转化为有机氮化合物才能为植物体所利用。谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶就是催化氨同化的关键酶，可在ATP供能及铁氧还蛋白的参与下，将转移给α－酮戊二酸合成谷氨酸，这一连续反应称为“GS－GOGAT循环”。 谷氨酰胺合成酶(GS)是第一个从植物中分离纯化和鉴定的酶，也是第一个被发现的能将无机盐形式的氨催化同化成有机氮形式的酶。它催化氮素同化的第一步反应，在氮素同化中起着关键的作用。此外，GS基因的表达既有组织器官专一性，又受环境(光、氮、CO2)和发育因子的影响，是分子生物学中研究基因专一性表达和时空表达及基因表达调控的好模式。另外，GS也是研究除草剂和抗除草剂的重要靶位点之一，对其的研究可能大大促进新生除草剂和抗除草剂植物的诞生。因此，植物谷氨酰胺合成酶成为近几年的研究热点之一。 1 GS的结构与种类

根据分子结构的不同，可以把谷氨酰胺合成酶分为3类:第一类是在原核生物中发现的谷氨酰胺合成酶Ⅰ(GSⅠ)，第二类是分布于真核生物和少量细菌中的谷氨酰胺合成酶Ⅱ(GSⅡ)，第三类是从一些厌氧微生物和蓝细菌中发现的谷氨酰胺合成酶Ⅲ(GSⅢ)。有些细菌只含有前两种谷氨酰胺合成酶。GSⅠ由12个亚基构成，每个亚基的分子量是52 ku;GSⅡ由8个亚基组成，每个亚基的分子量是40 ku;GSⅢ由16个亚基组成，每个亚基的分子量大于80 ku。与GSⅢ相比，GSⅠ和 GSⅡ具有较高的氨基酸同源性［1，2］。

高等植物中的GS全酶均为八聚体，分子量为360 ku左右，每个亚基分子量为38～45 ku［3］。由于亚基种类和亚基组成的不同，存在多种GS同工酶，呈现不同性质。在植物中，GS一般以两种同工酶形式存在，一种定位于细胞质部分，

称为胞质(胞液)型GS(GS1);另一种定位于叶绿体部分，称叶绿体型GS(GS2)。总体而言，组成GS2的亚基，分子量均为45 ku左右;而组成GS1的亚基，分子量均小于40 ku［4］。在大多数植物叶片中，GS主要以GS1和GS2形式存在，但也有少数植物叶片中只有GS2［5］;而在植物根中，GS虽然也以 GS1 和 GS2 的形式存在，但主要为 GS1［5，6］。

不同的植物中，GS同工酶的种类往往有差异。如:王小纯等利用Native－PAGE结合活性染色技术从不同专用小麦幼苗叶片中检测到3种GS——GS1、GS2 和 GSx，并推测，GSx受生长发育及光照强度、光质、温度和昼夜温差等因素的调节且在小麦叶片中活性很高［7］。另外，从菜豆中发现的两种形式的GS同工酶，一种为GSn1，在根瘤发育过程中出现，被认为是根瘤所特有的;另一种为GSn2，似乎与根中的GS同工酶GSr完全一样［8］。 2 GS的功能

研究表明，GS1和GS2的生理功能与它们的分布部位和细胞特异性表达模型相关。胞质型GS1主要存在于韧皮部筛管中［9，10］，在植物根中大量存在，主要功能是催化根中硝酸盐还原的铵、从土壤中吸收的铵或豆科植物根瘤菌固定的氨同化成有机态氮［11］。Haba 等［12］在转基因小麦叶片中增加GS1活性，结果提高了小麦体内的氮积累量和利用率，并且可以阻止叶片衰老过程中氨游离释放的损失。GS2定位于叶绿体，大量存在于叶肉细胞中，最初只认为GS2在硝酸盐还原成的初级同化中起作用。但Hoshida研究认为，GS2对于转基因植物的保护是因为其对光呼吸所产生的NH+4的吸收能力提高了，同时PSⅡ对电子的利用也防止了将电子传递给氧造成的氧化伤害，而光呼吸所产生的H2O2可以被过氧化物酶体解除［13］。孙辉等［14］构建了同时含有 GS1 cDNA和GS2 cDNA的植物表达载体，并将此载体转化到水稻中，成功获得了转基因水稻，同时证明了高效表达GS能够增强转基因水稻对土壤氮素缺乏的耐性。

总之，GS的不同功能由不同的GS同工酶形式承担，因不同基因的差异表达而变化。高等植物中GS1的主要功能是:同化内源性蛋白质降解和氨基酸分解代谢产生的氨，储存氮源在种子萌发时的转运，叶片衰老时氮源的转移再利用。GS2主要是参与光呼吸氨、还原氨、循环氨的再同化，植物根部的GSr及其同工酶的生理作用则有待进一步研究证实。 3 GS的性质 3.1 GS的理化性质

不同的GS同工酶呈现不同的性质。主要表现在最适pH值、热稳定性、对底物的亲和力、抑制剂的影响和免疫学性质几个方面，是区别不同GS同工酶的重要依据。 最适pH值:不同植物的GS最适pH值比较接近，其中GS2的最适pH值大多在7.5～8.0，而GS1的最适pH值大多在7.0～7.4。

热稳定性:总的来看，GS2的热稳定性低于GS1的热稳定性。相关研究表明，23℃下生长的水稻根的GS活性明显高于32℃下生长的活性，而23℃下生长的叶的GS活性显著低于在32℃下生长的活性［15］。

底物亲和性:高等植物的GS比细菌的GS对底物的亲和力高出50倍以上。在已研究过的植物中，GS2较GS1对谷氨酸的亲和力小得多，但就ATP和NH4OH而言，两者差异不大。

免疫学性质:相关研究表明，同一类型的GS抗体只能很好地识别来自不同组织以及其它植物的同类型的GS，对于不同类型的GS只能微弱识别。

感光性:光能提高许多植物，尤其是C3植物叶片中叶绿体GS的水平［16］。亚基组装方式与GS的活性关系密切，而光与GS的亚基组装方式也有密切关系。 3.2 GS的分子生物学性质

自1983年从蓝细菌Anabaena(glnA)中克隆并完全测序细菌GS的结构基因以来，已在多种植物中进行了GS cDNA和基因组DNA的克隆，推测出GS亚基的一级

结构，并用于研究其组织、结构、演化和基因表达［17］。在大多数植物中，GS同工酶由一个至少由4个功能基因组成的多基因家族所编码，这些基因至少编码1种质体型和3种胞液型GS多肽 ［18］。苏金等［19］利用RT－PCR技术，克隆了豌豆2 258个品种的GS2 cDNA序列，共包含1 293个核苷酸，包括翻译起始密码子和终止密码子;并由此cDNA序列推知其氨基酸残基为430个。Tischer等［20］对抗PPT培养的苜蓿细胞的GS基因序列分析表明，帽位点到PolyA位点长度是3 820 bp，包括12个37～159 bp的外显子和11个富含AT的90～715 bp的内含子。Melo等［21］从蒺藜苜蓿中克隆到1个表达的GS2基因，通过与PCR扩增得到的苜蓿基因组DNA比较，证明该GS2基因至少含有3个内含子。王淑春［22］采用分段PCR法克隆到甜菜GS1基因，长度为9 606 bp，包含13个外显子和12个内含子，内含子和外显子边界核苷酸为GU和AG，与真核生物同源。

近年来，随着分子生物技术和计算机网络技术的发展，生物大分子序列、结构和功能的测定技术日益丰富且不断突破，不同物种不同分子的序列、结构和功能信息每天都以惊人的速度增长［18］，目前，网络上已建立了许多可为GS研究提供信息的数据库，包含了大量不同物种、不同GS同工酶蛋白和核酸序列的基本信息，这为GS及其基因的试验研究提供了很大的帮助。表1列出了部分植物GS基因的收录号及表达定位［23］。 4 GS基因表达调控的研究 4.1 GS基因的表达调控

GS同工酶的表达是一个复杂的过程，不仅因植物种属的不同而差异表达，还受植物发育程度和时空因素的影响。外界因素如光照、氮素形态、温度、盐浓度都影响GS基因的表达。

GS1的表达受氮素影响较为明显，而GS2的表达主要受光照的影响，因此GS2的

出现和分布与叶绿体发育密切相关。有研究认为GS2基因的表达是多因素作用的过程，但这些因子在一定程度上都需要通过光照来影响GS2基因表达［24］。 可诱导部分植物GS基因的表达。GS同化速率是细胞质积累程度的一个重要因素。从转录水平上看，能够促进根GS的mRNA合成，而促进叶GS的mRNA合成。陈胜勇等［25］研究表明，氮素形态及比例能有效地在转录水平上调节甜菜幼苗叶片GS基因的表达，硝态氮比例较高的混合态氮较铵态氮比例较高的混合态氮更能促进GS基因表达。

NaCl浓度影响植物的生长和氮素同化酶的表达，是植物逆境生理研究的重要内容之一。在NaCl胁迫下，水稻根和叶中的GS活性都降低，但叶中的GS受影响更明显［26］。

表1 部分植物GS基因的收录号及表达定位水稻Oryza sativa X14245 芽 Sakamoto等1989 X14244 根 Sakamoto等1989 X14246 叶绿体 Sakamoto等1989 AAL87183 叶绿体 Park等2004豌豆Pisum sativum X04763 根、根瘤 Tingey等1987大麦Hordeum vulgare X69087 芽 Stroman等1990 X53580 叶绿体 Stroman等1990 X16000 叶绿体 Freeman等1990莴苣Lactuca sativa X60092 芽 Sakamoto等1990大豆Glycine max S46513 芽 Miao等1991 X81700 根瘤 Marsolier等1995 X81460 根瘤 Marsolier等1995玉米Zea mays D14576 根、芽 Sakakibara等1992 D14577 根、芽 Sakakibara等1992 D14578 根、芽 Sakakibara等1992烟草Nicotiana tabacum S39536 叶绿体 Becker等1992芸苔Brassicanapus X72751 叶绿体 Ochs等1993 X76736 根 Schock等1994萝卜Raphanus sativus D25324 根、芽 Watanabe等1994黄羽扇豆Lupinus luteus X71399 根瘤 Boron等1994苜蓿Medicago sativa U15591 根瘤 Dunn 1998苜蓿Medicago truncatula AAO37651 根 Melo等2003松叶菊Mesembryanthemum AAD31898 叶绿体 Michalowski等1999

杨树Populus tremula AAK49029 根 Wu等2000葡萄Vitis vinifera AJ318053 芽 Loulakais等2001甜菜Beta vulgaris AAK07678 叶绿体 Hoffmann等2001小麦Triticum aestivum AAZ30062 叶绿体 Dionisio等2005 AAZ30061 叶绿体 Dionisio等2005百脉根Lotus japonicus X94299 根 Ruiz等2005绿豆Vigna radiate AY918120 根 Pengnual等2005胡颓子Elacaguns umbellats AY620818 根 Kim等2005甘蔗Saccharum officinarum AY835453 叶 Nogueira等2005菠菜Spinacia oleracea EU057984 根 Antonacci＆Ferrant 2007甜瓜Cucumis melo AY773090 叶 Guan等2007 4.2 GS酶活性调节

GS酶活性受多种类型抑制剂的影响，包括金属离子、巯基反应试剂、多种氨基酸、核苷酸以及MSO、T－β－L和PPT等谷氨酸类似物，MSO处理水稻后显著降低了GS酶活性，相应地引起NH3挥发速率增加，而异烟肼(INH)在一定程度上导致NH3挥发速率降低［27］。此外，某些植物体内的蛋白因子也是GS的抑制剂。 GS酶活性受控于代谢中间产物的反馈机制，在转录水平进行调节。如果细胞内的氮素很富余，GS水平就会很低，并且绝大多数都会被腺苷化;但是如果细胞内氮素浓度偏低，GS含量会立即提高到原来的10倍并且不被腺苷化。

植物的GS酶始终处于一个动态的生物合成和分解过程，大量研究表明，GS催化反应的底物在GS酶活性的调节中发挥重要作用。底物的缺乏促使酶的分解，而底物的富含促使GS酶活性和稳定性的提高［28］。

GS已被证实具有抗非生物胁迫的多功能效应，为此吸引了许多实验室从事有关转GS基因植物研究工作。Peter等将苜蓿GS基因导入烟草，使转基因烟草过量表达谷氨酰胺合成酶，当GS蛋白占植株全部可溶性蛋白的5%时，GS活性提高5倍，过量表达GS的组织中游离氨的含量降低86%。Sujin等从巴西固氮螺菌Sp7中克隆了GS酶的glnA基因，并证明了表达glnA基因的转基因水稻植株比对照

植株更适应氮素贫瘠的环境。对小麦GS的测定结果表明，低浓度盐胁迫诱导了其活性的增加，高浓度盐胁迫对其有明显的抑制;NaHSO3的加入使其活性显著降低，提示NaHSO3不利于植物铵离子的同化，表现在游离铵离子含量的增加。这说明NaHSO3并不能促进盐胁迫下小麦幼苗对氮素的同化［29，30］。 5 目前存在的问题及展望

氮是植物需求量最大的矿质元素，是作物生产中的主要限制因子之一。氮素可以通过提高植物体内氨基酸和蛋白质的含量，促进植株生长，并且对植物叶绿素含量、光合速率和暗反应的主要酶以及光呼吸等都有明显的影响。但大量使用氮肥会导致环境污染，因此，提高植物的氮素利用率，特别是高等植物的氮利用率，对作物产量的提高和环境保护等都有重要作用。GS一直是植物生理学和营养学方面的研究热点，但主要集中于酶活性方面，在分子水平上研究GS基因表达的不多，目前已收录的GS基因序列多为一些经济农作物。另外，不同植物中的GS基因的结构差异也影响着其表达调控，因而其在改善植物氮素利用率等方面的应用还很有限。利用分子生物学方法分析GS的表达调控是提高植物氮素利用率的一个重要途径。 由于GS同工酶在不同组织、器官及不同发育时期的表达调控非常复杂，而且作物产量是受多因素影响的数量性状，因此，利用GS分子标记进行籽粒产量或品质的遗传改良受到许多因素的限制，但GS与产量性状的QTL定位研究为分子标记辅助选择氮高效品种提供了技术支撑［31～33］。利用特异启动子定向在根、茎中表达GS同工酶基因以改良作物耐逆性和提高生长量也有巨大的应用潜力［34］。 作为环境和谐农药的一个重要组成部分，植物源农药的开发研究越来越受到人们的重视［35］。关于GS在高等植物逆境生理方面的研究，可能大大促进新生除草剂和抗除草剂植物的诞生。

GS是植物氮同化的关键酶，在进化过程中相当保守，因此，探索GS基因起源机制，从基因进化的角度研究GS及其基因序列与功能的关系有助于进一步阐明植物

进化的分子基础，进而衡量植物之间的进化关系。生物信息学方法是一个新兴而十分有效的方法，可以利用该方法构建基于GS基因的分子进化树来分析植物的进化关系［36］。但这一技术发展还不够成熟，尚无法完全取代实验技术，研究中只能作为辅助技术。 参 考 文 献:

［1］Pesole G，Gissi C，Lanave C，et al.Glutamine synthetase gene evolution in bacteria［J］.Molecular Biology and Evolution，1995，12(2):189－197.

［2］Mathis R，Gamas P，Meyer Y，et al.The presence of GSⅠlike genes in higher plants:support for the paralogus evolution of GSⅠand GSⅡgenes［J］.Journal of Molecular Evolution，2000，50(2):116－122.

［3］Cren M，Hirel B.Glutamine synthetase in higher plants:regulation of gene and protein expression from the organ to the cell［J］.Plant and Cell Physiology，1999，40(12):1187－1193.

［4］李常健，林清华，张楚富.高等植物谷氨酰胺合成酶研究进展［J］. 生物学杂志，2001，18(4):1－3.

［5］Edwards J W，Walker E L，Coruzzi G M.Cell－specific expression in transgenic plants reveals nonoverlapping roles for chloroplast and cytosolic glutamine synthetase［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87(9):3459－3463.

［6］Tingey S V，Walker E L，Coruzzi G M，et al.Synthetase genes of pea encode distinct polypeptides which are differentially expressed in leaves，roots and nodules［J］.EMBO J. ，1987，6(1):1－9.

［7］王小纯，安 帅，熊淑萍，等.小麦叶片谷氨酰胺合成酶的分离纯化及鉴定

［J］.麦类作物学报，2010，30(1):83－86.

［8］林清华，李常健，张楚富，等.水稻谷氨酰胺合成酶同工酶免疫学性质比较研究［J］.植物学报，2000，42(5):471－475.

［9］Miflin B J，ed.Oxford surveys of plant molecular and cell biology［M］.Oxford University Press，1989，247－296.

［10］段元霖，李合生.不同光质和钙对小麦幼苗硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影响(简报)［J］.植物生理学通讯，1999，35(2):122－125.

［11］Cullimore J V，Lara M，Lea P J，et al.Purification and properties of two forms of glutamine synthetase from the plant fraction of Phaseolus root nodules ［J］.Planta，1983，157(3):245－253.

［12］Haba P，Cabello P，Maldonado J M.Glutamine－synthetase isoforms appearing in sunflower cotyledons during germination［J］.Planta，1992，186(4):577－581.

［13］Hoshida H，Tanaka Y，Hibino T，et al.Enhanced tolerance to salt stress in transgenic rice that overexpresses chloroplast glutamine synthetase［J］.Plant Mol.Biol.，2000，43:103－111.

［14］孙 辉.超量表达谷氨酰胺合成酶赋予转基因水稻抗除草剂和抗氮素瘠薄特性［D］.北京:中国农业科学院硕士学位论文，2003，12－40.

［15］陆彬彬，周 卫.温度对水稻谷氨酰胺合成酶和NADH－谷氨酸合酶表达的影响［J］.武汉大学学报，2002，48(2):239－242.

［16］印莉萍，柴晓清，李 丹，等.不同小麦品种叶片衰老过程中谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶的活性变化［J］.山西师范大学学报，1997，11(1):46－49. ［17］韩 娜，葛荣朝，赵宝存，等.植物谷氨酰胺合成酶研究进展［J］. 河北师范大学学报(自然科学版)，2004，28(4):407－410.

［18］叶 雄，张楚富.生物信息学在植物谷氨酰胺合成酶同工酶基因研究中的应用［J］.植物生理学通讯，2006，42(1):115－121.

［19］苏 金，朱汝财，伍成祥，等.豌豆叶绿体型谷氨酰胺合成酶cDNA的克隆［J］.农业生物技术学报，2000，8(4):326.

［20］Tischer E，DasSarma S，Goodman H M.Nucleotide sequence of an alfalfa glutamine synthetase gene ［J］.Molecular and General Genetics，1986，203(12):221－229.

［21］Melo P M，Lima L M，Santos I M，et al.Expression of the plastid－located glutamine synthetase of Medicago truncatula.Accumulation of the precursor in root nodules reveals an in vivo control at the level of protein import into plastids［J］.Plant Physiol.，2003，132(1):390－399.

［22］王淑春.甜菜谷氨酰胺合成酶基因的克隆［D］.哈尔滨:黑龙江大学，2007，1－12.

［23］Biesiadka J，Legocki A B.Evolution of the glutamine synthetase gene in plants［J］.Plant Seience，1997，128(1):51－58.

［24］印莉萍，柴晓清，刘祥林，等.叶绿体发育和光对小麦叶谷氨酰胺合成酶基因表达的影响［J］.植物学报，1994，36(8):597－602.

［25］陈胜勇，李彩凤，马凤鸣，等.甜菜谷氨酰胺合成酶基因在不同氮素条件下的表达分析［J］.作物杂志，2008，4:64－67.

［26］李常健，林清华，张楚富，等.NaCl对水稻谷氨酰胺合成酶活性及同工酶的影响［J］.武汉大学学报(自然科学版)，1999，45(4):497－500.

［27］陈明霞，周彩云，李明军，等.光呼吸和谷氨酰胺合成酶抑制剂对水稻冠层NH3挥发的影响［J］.植物科学学报，2011，29(2):206－211. ［28］Ortega J L，Temple S J，Sengupta－Gopalan C.Constitutive

overexpression of cytosolic glutamine synthetase(GS1)gene in transgenic alfalfa demonstrates that GS1 may be regulated at the level of RNA stability and protein turnover［J］.Plant Physiology，2001，126:109－121. ［29］秦 学，曹翠玲，梁宗锁.NaHSO3对小麦生殖生长时期氮素代谢的影响［J］.土壤通报，2005，36(6):913－916.

［30］王志强，王春丽，欧吉权，等.NaHSO3对盐胁迫下小麦幼苗氮同化酶及脯氨酸含量的影响［J］.武汉植物学研究，2006，24(6):546－550.

［31］Gallais A，Hiel B.An approach to the genetics of nitrogen use efficiency in maize［J］.Journal of Experimental Botany，2004，55(396):295－306.

［32］于明礼，王 燕，刘少坤，等.氮素对不同类型饲用玉米产量及品质的影响［J］.山东农业科学，2009，4:57－60.

［33］张 超，孟繁勤，史春余.水稻应用控释氮肥的增产效果［J］.山东农业科学，2009，12:84－86.

［34］黄冰艳，高 伟，苗利娟，等.谷氨酰胺合成酶基因研究进展及其在植物氮代谢调控中的应用［J］.中国农学通报，2010，26(23):53－57.

［35］赵志英，雷彩霞，臧爱梅.植物源除草剂研究进展［J］.山东农业科学，2010，6:91－93.

［36］陈胜勇，李观康，汪 云，等.谷氨酰胺合成酶的研究进展［J］.中国农学通报，2010，26(22):45－49.