人NF-κB亚基p65、p50基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定

维普资讯 http://www.cqvip.com 第３７卷第ｌ期第９７页　２００８年２月　华中科技大学学报（医学版）　Ａｃｔａ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　ＶｏＩ．３７　Ｎｏ．１　Ｐ．９７　Ｆｅｂ．　２００８　人ＮＦ—ＫＢ亚基ｐ　６　５、ｐ　５　０基因重组逆转录病毒　表达载体及包装细胞株的建立和鉴定　＊　桂伶俐　刘志恒　’　张传汉　△　祝　畅　高　峰　４３００３０　华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，武汉深圳市第二人民医院麻醉科，深圳５１８０３５　摘要　目的构建分别携带人核因子一　Ｂ（ＮＦ—　Ｂ）亚基ｐ６５、ｐ５０基因的逆转录病毒载体，并建立稳定产毒的包装细　胞株。方法　以ＲｃＣＭＶ－ｐ６５、ＲｃＣＭＶ－ｐ５０质粒为模板，ＰＣＲ扩增ｐ６５、ｐ５０基因编码区全长序列，分别克隆至逆转录病　毒空载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ、ｐＭＳＣＶｈｙｇ，酶切、测序鉴定。将重组载体及空载体分别转染包装细胞系ＰＴ６７，以Ｇ４１８或潮霉素　筛选产毒细胞株。收集病毒悬液，测定病毒滴度，并瞬时感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞及人神经干细胞，７２　ｈ后分别采用ＲＴ－ＰＣＲ　和免疫细胞化学观察ｐ６５、ｐ５０的表达。结果重组逆转录病毒载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５、ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０的酶切、测序鉴定　正确。将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５、ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｎｅｏ、ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０及　ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｈｙｇ，测定病毒滴度分别为４×１０。、６×１０　、２×１０　及１×１０　ｃｆｕ／ｍｌ。ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５、ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０病　毒悬液瞬时感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞７２　ｈ后，细胞ｐ６５、ｐ５０亚基ｍＲＮＡ的表达明显升高；瞬时感染人神经干细胞（ｈＮＳＣ）７２　ｈ　后，部分细胞胞核呈ｐ６５和ｐ５０阳性染色。结论成功构建了分别携带人ｐ６５、ｐ５０基因的逆转录病毒载体，建立了稳　定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株。为探讨转ＮＦ－￣Ｂ基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础。　关键词　干细胞移植；　脑缺血；　核因子　Ｂ；　逆转录病毒科　中图法分类号Ｑ９３９．４７　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　ＮＦ－ＫＢ　Ｓｕｂｕｎｉｔｓ　ｐ６５，ｐ５０　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｓｔｅａｄｙ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｃｌｏｎｅｓ　Ｇｕｉ　Ｌｉｎｇｌｉ　，Ｌｉｕ　Ｚｈｉｈｅｎｇ　～，Ｚｈａｎｇ　Ｃｈｕａｎｈａｎ　△ｅｌ　ａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａ　Ｐｓｆ　Ｐ５　ｏ　ｏｇ　，ＴｏｎｇＪｉ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００３０　２　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎｅｓｔｈｅｓｉ０ｅ０ｇｙ，ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５１８０３５　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ＮＦ—ＫＢ　ｓｕｂｕｎｉｔｓ　ｐ６５・ｐ５０　ｇｅｎｅｓ　ｒｅ—　ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｓｔａｂｌｙ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐ６５　ａｎｄ　ｐ５０　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ＲｃＣＭＶ—ｐ６５　ｏｒ　ＲｃＣＭＶ—ｐ５０　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）。ａｎｄ　ｓｕｂ—ｃｌｏｎｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａ１　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｐＭＳＣＶｎｅｏ　ａｎｄ　ｐＭＳＣＶｈｙｇ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕ—　ｃｌｅａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏ１　ｒｅｔｒｏｖｉｒａ１　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌ１　１ｉｎｅ　ＰＴ６７　ｂｙ　１ｉｐｏｓｏｍｅ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｍ　２０００．Ｔｈｅ　ｃｅｌ１　ｃｌｏｎｅｓ　ｓｔａｂｌｙ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ｇ４１８　ｏｒ　ｈｙ—　ｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｖｉｒａ１　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｖｉｒａ１　ｔｉｔｅｒ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＮＩＨ３Ｔ３　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ６５　ａｎｄ　ｐ５０　ｓｕｂｕｎｉｔｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ＮＩＨ３Ｔ３　ｃｅｌｌｓ　ｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｒａ１　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｈＮＳＣ）　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｏｒ　ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｔ　７２　ｈ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａ１　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５　ａｎｄ　ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｅｎｃｏｄｅ　ｐ６５　ａｎｄ　ｐ５０　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅｓ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｏｕｔ　ｂｙ　Ｇ４１８　ｏｒ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ　ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ａｓ　ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｎｅｏ～ｐ６５，ＰＴ６７／　ｐＭＳＣＶｎｅｏ，ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐＳＯ　ａｎｄ　ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｈｙｇ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｗｅｒｅ　４×１０　，６×１０　，２×１０　ａｎｄ　１×１Ｏ　ｃｆｕ／ｍ１　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｐ６５　ｏｒ　ｐ５０　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｄ　ａｔ　ｈｉｇｈ　１ｅｖｅ１　ｉｎ　ＮＩＨ３Ｔ３　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｉ　ｏｆ　ｈＮＳＣ　ａｔ　７２　ｈ　ａｆｔｅｒ　ＮＩＨ　３Ｔ３　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｈＮＳＣ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５　ｏｒ／ａｎｄ　ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．Ｃｏｎｃｌｕ．　ｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ＮＦ—ＫＢ　ｓｕｂｕｎｉｔｓ　ｐ６５　ａｎｄ　ｐ５０　ｇｅｎｅｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ａｎｄ　ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙＴｈｅｓｅ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｒ＿　．ｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｎｅｕｒａ１　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮＦ－ＫＢ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｂｒａｉｎ　ｉｓｃｈｅｍｉａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌ１　ｔｒａｎｓｐ１ａｎｔａｔｉｏｎ；　ｂｒａｉｎ　ｉｓｃｈｅｍｉａ；　ＮＦ－ｋａｐｐａ　Ｂ；　ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ　缺血性卒中是人类三大致死性疾患之一，传统　国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０３００３２８）　桂伶俐，女，１９７７年生，医学博士　通讯作者，Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　治疗效果欠佳，神经干细胞移植为其治疗新手段。　但移植细胞因缺血灶微环境的改变，存活时间短，分　维普资讯 http://www.cqvip.com ・　９８　・　华中科技大学学报（医学版）　２００８年２月第３７卷第１期　化成的神经元数量过少，功能低下而限制了其临床　应用口］。核因子ＫＢ（ＮＦ—ＫＢ）是一种转录因子，ｐ６５、　公司；聚凝胺购自Ｓｉｇｍａ公司；质粒ＲｃＣＭＶ—ｐ６５、　ＲｃＣＭＶ—ｐ５０（分别含人ｐ６５、ｐ５０基因）由德国Ｐａｈｌ　教授惠赠；总ＲＮＡ抽提试剂Ｔｒｉｚｏｌ、质粒提取试剂、　胶回收试剂盒和免疫细胞化学试剂盒购自上海华舜　ｐ５０亚基构成的异二聚体是其发挥生物功能的主要　形式口］。ＮＦ一　Ｂ激活后能调控一系列基因表达，有　望改善移植区微环境，因此，转ＮＦ一　Ｂ基因神经干　细胞移植可能成为治疗缺血性卒中的新途径。人神　经干细胞（ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ，ｈＮＳＣ）对外源　公司；Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、逆转录试剂盒购自Ｆｅｒ—　ｍｅｎｔａｓ公司；Ｔ　ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶（Ｈｐａ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ）购自ＴａＫａＲａ公司；脂质体Ｌｉｐｏ—　ｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００转染试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。　１．２实验方法　基因易感性低，而逆转录病毒具有高效的感染能力，　能有效地将外源基因导入ｈＮＳＣ。本研究拟将人　ＮＦ—ＫＢ亚基ｐ６５、ｐ５０基因克隆至复制缺陷型逆转　１．２．１　重组逆转录病毒栽体ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５、ｐＭ—　ＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０的构建　根据质粒ＲｃＣＭＶ－ｐ６５、ＲｃＣ—　ＭＶ－ｐ５０中人ｐ６５、ｐ５０　ｃＤＮＡ编码区全长序列，分别　引入Ｈｐａ　Ｉ和Ｘｈｏ　Ｉ酶切位点合成引物（表１）。以上　述质粒为模板进行ＰＣＲ反应，将分别扩增出的２．２　ｋｂ　ｐ６５亚基及１．４　ｋｂ　ｐ５０亚基编码区全长，通过　录病毒载体，并筛选出产生高滴度病毒的包装细胞　株。　１材料与方法　１．１主要试剂　逆转录病毒载体、包装细胞系ＰＴ６７、ＮＩＨ３Ｔ３　细胞系均购自ＢＤ公司；ＤＭＥＭ高糖培养液、胎牛　血清购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；Ｇ４１　８、潮霉素购自Ｒｏｃｈｅ　Ｈｐａ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ双酶切后，分别定向克隆至ｐＭＳＣＶｎｅｏ　及ｐＭＳＣＶｈｙｇ空载体，转化ＤＨ５ａ感受态细菌，挑选　阳性菌落，提取质粒，对其进行核苷酸测序。　表１　根据人ｐ６５、ｐ５０ｃＤＮＡ编码区全长序列及酶切位点设计的引物　下划线表示引入的酶切位点序列　１．２．２　基因转染及稳定筛选ＰＴ６７细胞在含　（ｃｆｕ／ｍ１）一形成细胞克隆的最高稀释倍数×该克隆　数。　１Ｏ　胎牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养液（完全培养液）　中培养至９Ｏ　汇合率后，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　转染重组载体及空载体。转染后２４　ｈ传代，转染后　４８　ｈ分别加入３００／，ｇ／ｍｌ　Ｇ４１８或１００／，ｇ／ｍｌ潮霉　素筛选１Ｏ～１４　ｄ，至抗性细胞克隆形成。挑选克隆，　扩大培养，收集细胞上清液即逆转录病毒悬液，储存　于一８Ｏ℃。　１．２．４病毒瞬时感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞及ｈＮＳＣ病　毒悬液用完全培养液等比稀释，加入聚凝胺至终浓　度为４／，ｇ／ｍｌ，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，６　ｈ后换新鲜培　养液，２４　ｈ后，重复感染１次。贴壁培养的ｈＮＳＣＥ　同样按此法进行病毒感染，第１次及重复感染时交　替运用ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５和ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０病毒悬　液。感染后７２　ｈ，行ＲＴ—ＰＣＲ和免疫细胞化学检　测。　１．２．５　ＲＴ—ＰＣＲ检测ｐ６５、ｐ５０基因表达Ｔｒｉｚｏｌ　１．２．３逆转录病毒滴度的测定　病毒悬液用完全　培养液以１Ｏ。、１Ｏ　、１Ｏ　和１Ｏ　倍稀释，加入８／，ｇ／ｍｌ　聚凝胺。ＮＩＨ３Ｔ３细胞以０．５×１０　／孑Ｌ接种于６孔　板，培养２４　ｈ后，取１　ｍｌ上述稀释的病毒悬液及１　ｍｌ完全培养液加于６孑Ｌ板，使聚凝胺终浓度为４　提取细胞总ＲＮＡ，取３／＊ｇ　ＲＮＡ进行逆转录，以逆　转录产物为模板行ＰＣＲ反应，扩增ｐ６５、ｐ５０片断。　ｐ６５引物，上游：５　一ＣＧＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡ一　３　，下游：５　一ＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡ一３　；ｐ５０　引物，上游：５　－ＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＴＣＣＧＴＴＡＴＧＴ一　３　，下游：５，＿ＧＴＣＣＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＡ一３　。　／，ｇ／ｍｌ，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞。２４　ｈ后更换含３００　／，ｇ／ｍｌ　Ｇ４１８或１００／，ｇ／ｍｌ潮霉素的筛选培养液，　１４　ｄ后，用１　多聚甲醛固定１０　ｍｉｎ，０．１　结晶紫　染液室温染色数分钟后，计数克隆数。病毒滴度　维普资讯 http://www.cqvip.com 桂伶俐等．人ＮＦ　Ｂ亚基ｐ６５、ｐ５０基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定　・９９。　ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性２　ｒａｉｎ，９４。Ｃ变性４５　Ｓ，　５４℃（ｐ５０）或５４．５℃（ｐ６５）或５５℃（ＧＡＰＤＨ），退　火１　ｒａｉｎ，７２℃延伸１　ｒａｉｎ，共反应３Ｏ个循环。ＰＣＲ　产物经１　琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描。　１．２．６免疫细胞化学检测ｐ６５、ｐ５０的表达　病毒　感染ｈＮＳＣ后７２　ｈ，４　多聚甲醛固定，参照试剂盒　说明采用二步法进行免疫细胞化学染色，加一抗　（ｐ６５、ｐ５０　１：５００），４。Ｃ过夜，加ＨＲＰ标记二抗，　室温孵育２０　ｒａｉｎ，ＤＡＢ显色，光镜下观察并摄片。　２　结果　２．１　重组逆转录病霉载体的鉴定　ｐ６５、ｐ５０亚基编码区全长分别定向克隆至ｐＭ—　ＳＣＶｎｅｏ及ｐＭＳＣＶｈｙｇ空载体，得到重组载体ｐＭ—　ＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５和ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０。ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５　经Ｈｐａ　Ｉ和Ｘｈｏ　Ｉ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳得到　２．２、６．５　ｋｂ的条带，分别与质粒ＲｃＣＭＶ—ｐ６５　ＰＣＲ　产物及线性化空载体大小一致（图１）。同样，ｐＭ—　ＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０可得到１．４、７．０　ｋｂ的条带，分别与质　粒ＲｃＣＭＶ－ｐ５０　ＰＣＲ产物及线性化空载体大小一　致（图２）。重组载体进行ＤＮＡ测序分析，ｐ６５、ｐ５０　基因编码序列无误，开放阅读框正确。　２．２产病毒包装细胞株的建立及病毒滴度的测定　将重组载体及空载体分别转染包装细胞系　ＰＴ６７，稳定筛选后所得不同包装细胞株，分别命名　为ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５、ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｎｅｏ、　ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０及ＰＴ６７／ｐＭＳＣＶｈｙｇ。测定　所产病毒的滴度分别为４×１０　、６×１０　、２×１０　及　１×１０　ｃｆｕ／ｍ１　２　３　Ｍ　ｋｂ　ｋｂ　１Ｏ．Ｏ　６．５　８．Ｏ　６．Ｏ　４．Ｏ　３．Ｏ　２．５　２．２　２．Ｏ　１：空载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ的Ｈｐａ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ双酶　切；２：以ＲｃＣＭＶ—ｐ６５质粒为模板ｐ６５基因全　长的ＰＣＲ产物；３：重组栽体ｐＭＳＣＶｎｅｏ　ｐ６５　的Ｈｐａ　Ｉ，Ｘｈｏ　Ｉ双酶切；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　图１重组载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５双酶切鉴定　２　３　Ｍ　ｋｂ　ｋｂ　７．Ｏ　１０．Ｏ　８　Ｏ　６　Ｏ　４．Ｏ　３．Ｏ　２．Ｏ　１ｌ４　１．５　１：以ＲｃＣＭＶ—ｐ５０质粒为模板，ｐ５０基因全长的　ＰＣＲ产物；２：空载体ｐＭＳＣＶｈｙｇ的Ｘｈｏ　Ｉ、　Ｈｐａ　Ｉ双酶切；３：重组栽体ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０的　Ｘｈｏ　Ｉ、Ｈｐａ　Ｉ双酶切；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　图２重组载体ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０双酶切鉴定　２．３病毒瞬时感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后ｐ６５、ｐ５０　ｍＲＮＡ的表达　ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５或ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０病毒瞬时　感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，ＲＴ—ＰＣＲ扩增出７１９　ｂｐ或　２３４　ｂｐ的条带，而未感染及感染ｐＭＳＣＶｎｅｏ或ｐＭ—　ＳＣＶｈｙｇ病毒的细胞则无特异性扩增（图３、４）。　２．４病毒瞬时感染ｈＮＳＣ后ｐ６５、ｐ５０的表达　ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５和ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０病毒瞬时　感染ｈＮＳＣ后，ｐ６５、ｐ５０免疫细胞化学显示，部分细　胞呈胞核ｐ６５和ｐ５０阳性染色（图５）。　３讨论　神经于细胞具有自我更新、多向分化的潜能，在　缺血性卒中的治疗中有广阔的运用前景。它不仅可　替代缺血灶退变的神经元，而且能克服单纯神经元　移植所存在的供体来源困难，供体、受体整合受限等　２　３　Ｍ　ｂｐ　２　０００　１　５００　１　０００　７５０　７１９　５００　１：未感染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞；２：感染ｐＭＳＣＶｎｅｏ　病毒的ＮＩＨ３Ｔ３细胞；３：感染ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５　病毒的ＮＩＨ３Ｔ３细胞；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　图３　Ｒ￣ＰＣＲ检测ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５病毒感染　ＮＩＨ３Ｔ３细胞后ｐ６５　ｍＲＮＡ的表达　维普资讯 http://www.cqvip.com ・　１ＯＯ　・　华中科技大学学报（医学版）　２００８年２月第３７卷第１期　２　３　Ｍ　ｂｐ　２　０００　１　５００　１　０００　７５０　５００　２５０　２３４　１：感染ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０病毒的ＮＩＨ３Ｔ３细　胞；２：未感染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞；３：感染ｐＭ—　ＳＣＶｈｙｇ病毒的ＮＩＨ３Ｔ３细胞；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　图４　ＲＴ—ＰＣＲ检测ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０病毒感染　ＮＩＨ３Ｔ３细胞后ｐ５０　ｍＲＮＡ的表达　Ａ：部分细胞胞核呈ｐ６５阳性染色；Ｂ：部分细胞　胞核呈ｐ５０阳性染色　图５　免疫细胞化学检测ｐＭＳＣＶｎｅｏ—ｐ６５和　ｐＭＳＣＶｈｙｇ—ｐ５０病毒感染ｈＮＳＣ后ｐ６５、　ｐ５０的表达（ＤＡＢ显色，×２００）　缺点。但是，移植细胞生长微环境的改变是影响疗　效的重要因素。将外源基因转入神经干细胞，改善　其自身移植后的生存微环境，成为研究热点。　ＮＦ—　Ｂ在中枢神经系统可被多种因素激活，进　而参与基因表达的调控。虽然它能导致ＴＮＦａ等　多种炎性介质释放，但有研究证实，它也能介导许多　有利于缺血区微环境改善的细胞因子的表达，如神　经营养因子为神经再生提供营养，ＩＩ　一１和ＩＬ—ｌ１影　响神经干细胞的分化，血管内皮生长因子影响血管　生成，血小板源生长因子诱导神经干细胞的化学趋　化性等　］。并且，ＮＦ—　Ｂ还可激活抗凋亡基因如　Ｂｃｌ一２、凋亡抑制蛋白等的表达，可能发挥神经保护　作用　］。因此，有必要探讨转ＮＦ—　Ｂ基因神经干细　胞在缺血性卒中的运用前景。　在体外，ｈＮＳＣ聚集成神经球悬浮生长，且细胞　增殖相对缓慢，因而对外源基因的易感性明显降低。　而负载外源基因的逆转录病毒有很高的转染效率，　可有效地整合人靶细胞基因组，稳定持久地表达所　带的外源基因。本实验使用的复制缺陷型逆转录病　毒载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ及ｐＭＳＣＶｈｙｇ，含有从鼠干细　胞ＰＣＭＶ病毒来源的５　长末端重复序列，特别适合　目的基因在干细胞中的高水平表达。在转染了含有　包装信号的逆转录病毒载体后，包装细胞合成的病　毒结构蛋白（如胞膜蛋白、衣壳蛋白等）将病毒基因　组的转录产物（包括筛选基因、目的基因等）包装成　假病毒颗粒。形成的假病毒颗粒通过胞膜蛋白能广　泛地与哺乳动物细胞膜受体结合，介导逆转录病毒　对靶细胞的有效感染。由于假病毒颗粒缺乏编码结　构蛋白的基因，所以感染细胞后不能复制，具有生物　安全性　。　将外源基因转入靶细胞的效率高低是基因治疗　的关键，其中逆转录病毒滴度是影响转染效率的重　要因素之一。病毒滴度是评价病毒生产细胞分泌感　染性病毒颗粒的主要指标，能反映病毒感染靶细胞　的效能。ＮＩＨ３Ｔ３细胞不含病毒基因和克隆的目的　基因，将筛选出的包装细胞株所产生的病毒悬液感　染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，通过耐药集落形成实验，可真实　反映包装细胞装配和释放的病毒颗粒的效果及滴　度ｌ７］。成功转染靶细胞需要足够滴度的病毒悬液，　病毒滴度为１０　～１０　ｃｆｕ／ｍｌ才能满足体外转染需　要。本研究结果显示病毒滴度均在１０　数量级，已　达到了进一步实验研究的要求。　本研究中，重组逆转录病毒载体经酶切及ＤＮＡ　测序证实构建成功，且所得产毒细胞株包装的逆转　录病毒有感染能力，能正确转录人ＮＦ—　Ｂ亚基ｐ６５、　ｐ５０　ｍＲＮＡ。进一步的实验发现，ｈＮＳＣ感染此病　毒后，ＮＦ—　Ｂ亚基可直接进入核内发挥功能，与Ｂｉ—　ｔａｒ等　的研究结果一致。这些为探讨转ＮＦ—　Ｂ基　因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验　基础。　（下转第１０８页）　维普资讯 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・１０８・　华中科技大学学报（医学版）　２００８年２月第３７卷第１期　２），其余患者均以自发性出血为首发症状，虽２例患　但不会自行消失，多采取外科手术治疗或介入治疗；　而外周动脉动脉瘤，因其部位较深，瘤体较小，手术　难度大，且经过颅内外血管重建，血流压力改变后有　自行消失的可能，多采取保守治疗［７］。　ＭＲＩ及ＭＲＡ（磁共振血管造影）虽能显示颈内　者有明确的高血压病史，但其表现为蛛网膜下腔出　血１例，脑实质出血破入脑室１例（非高血压好发部　位），因此对自发性脑出血，高度怀疑颅内血管性疾　病患者应常规行ＤＳＡ检查以明确病因。本组烟雾　病合并动脉瘤患者中，较多的还是表现为蛛网膜下　腔出血，约占全部病例的５５．５６　（５／９），这与单纯　性烟雾病出血多见于基底节区及脑室内出血有所不　动脉、大脑前动脉、大脑中动脉的狭窄及闭塞及烟雾　血管的特征，但其存在在血流较快及涡流的部位信　号丢失．可能出现假阳性及过高估计狭窄程度；对烟　雾病的颈外代偿血管显示不佳；对较小的动脉瘤可　能出现漏诊等缺点，因此对此病的诊断价值有限　］。　参　考　文　献　［１］　易梅，徐庭国，王峰，等．烟雾病并发颅内出血的ＤＳＡ影像分　析ＥＪ］．介入放射学杂志，２００２，ｌ１（１）：５－７．　　Ｓ，ＳＡＫＡＫＩ　Ｔ，ＭＯＲＩＭＯＴＯ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒ—　［２］　ＫＡＷＡＧＵＣＨＩａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ　ａｎｅｕｒｙｓｍｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｏｙａｍｏｙａ　同。本组病例还发现位于ｗｉｌｌｉｓ环附近的主要动脉　动脉瘤，其破裂出血多造成蛛网膜下腔出血；而累及　烟雾血管及侧支血管的外周动脉动脉瘤，其破裂出　血多导致脑叶出血，脑室出血，也可表现为蛛网膜下　腔出血，其出血部位与所合并动脉瘤的类型及部位　相关　。　ＤＳＡ检查是诊断烟雾病的重要方法，它可以显　ｄｉｓｅａｓｅ，ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　１１１　ｃａｓｅｓ　ｒＪ＿．Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ，１９９６，１３８　（１】）１１２８７—１２９４．　示颅内外血管有无闭塞和狭窄、颅内外血管侧支循　环的情况及有无合并动脉瘤。从图１～３的Ｃ图可　看出烟雾病患者颈内动脉末端、大脑前动脉及大脑　中动脉狭窄、闭塞，脑底较多烟雾状异常血管网形　［３］　程华怡，丁美修．烟雾病伴发动脉瘤［Ｊ］．国外医学・脑血管　疾病分册，１９９７，５（５）：２９７—２９９．　［４］　ＨＡＭＡＤＡ　Ｊ，ＨＡＳＨＩＭＯＴＯ　Ｎ，ＴＳＵＫＡＨＡＲＡ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．　Ｍｏｙａｍｏｙａ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ　ｄｕｅ　ｔＯ　ａｎｅｕｒｙｓｍ　ｒｕｐｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，１９９４，８０（２）：３２８—　３３１．　成。图１Ｂ、图２Ｂ还可见后交通动脉增粗，大脑后动　脉后胼周动脉分支代偿供应大脑前、中动脉缺血区。　图３Ｃ显示脑膜中动脉及颞浅动脉增粗，发出穿硬　脑膜支，供应大脑前、中动脉缺血区。　对于是否合并动脉瘤，ＤＳＡ检查是确诊的“金　标准”。它可显示动脉瘤的有无，大小、部位、侧支循　环情况，对制定治疗方案具有重要的参考意义。对　于主要动脉动脉瘤，随着血流冲击，往往可以增大，　［５］　张海鸥，饶明俐，于林丛．烟雾病与颅内动脉瘤的实验研究　［Ｊ］．中风与神经疾病杂志，２０００，１７（５）：２６７—２６８．　［６］　郭道芳，刘作勤，唐军，等．烟雾病伴发动脉瘤（附２２例报道）　［Ｊ］．介入放射学杂志，２０００，９（３）：１３９—１４０．　［７］　倪明，杨明琪，赵继宗，等．烟雾病合并颅内动脉瘤的临床分　析［Ｊ］．北京医学，２００３，２５（３）：１５５—１５７．　［８］　李迎春，王家平，袁曙光，等．血管造影对Ｍｏｙａｍｏｙａ病的临　床意义［Ｊ］．中国医学影像技术，２００４，２０（Ｓｕｐｐ１）：１０２—１０４．　（２００７—０６—１３　收稿）　（上接第１００页）　参　考　文　献　ＤＳＳＯＮ　Ａ，ＣＯＬＬＩＮ　Ｔ，ＫＩＲＩＫ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｒｅ—　［１］　ＡＲＶＩｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｄｕｌｔ　ｂｒａｉｎ　ａｆｔｅｒ　［６］　ＲＥＥＶＥＳ　Ｌ．ＳＭＵＣＫＥＲ　Ｐ，ＣＯＲＮＥＴＴＡ　Ｋ．Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｔｉｔｅｒ：ｔｈｅ　ｎａｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔ—　ｈｅｒ，２０００，１１（１５）：２０９３—２１０３．　ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｍｅｄ，２００２，８（９）：９６３－９７０．　［２］　ＨＡＹＤＥＮ　Ｍ　Ｓ，ＧＨＯＳＨ　Ｓ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔＯ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，２００４，１８（１８）：２１９５—２２２４．　Ｊ，ＢＡＲＲＹ　Ｓ，ＬＡＭ　Ｇ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｐｒｅｐａｒａ—　［７］　ＳＥＰＰＥＮ　ｔｉｏｎｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ＰＡ３１７　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｎｔａｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｃｏｐｕｒｉｆｙ　ｗｉｔｈ　ｖｉｒａｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ａｎｄ　ａｒｅ　ｄｅｖｏｉｄ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　［３］　祝畅，张传汉，刘志恒，等．人胚神经干细胞的长期贴壁培养　和鉴定［Ｊ］．中国康复医学杂志，２００６，２１（４）：３２２—３２４．　ＭＡＴＴＳＯＮ　Ｍ　Ｐ，ＭＥＦＦＥＲＴ　Ｍ　Ｋ．Ｒｏｌｅｓ　ｆｏｒ　ＮＦ—ｋａｐｐａＢ　ｉｎ　［４］　ｎｅｒｖｅ　ｃｅｌｌ　ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ，ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｆ—　ｆｅｒ，２００６，１３（５）：８５２—８６０．　ＲＮＡＥＪ］．Ｈｏｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，２０００，１１（５）：７７１—７７５．　［８］　ＢＩＴＡＲ　Ｒ，ＢＥＡＵＰＡＲＬＡＮＴ　Ｐ．ＬＩＮ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ—　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａ　Ｂ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｇｅｎｅｓ　ｍｏｄ　ｕｌａｔｅｓ　Ｉ　ｋａｐｐａ　Ｂ　ａｌｐｈａ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｂｅｔａ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ，１９９５，６（８）：９６５—９７６．　［５］　ＣＨＥＮ　Ｌ　Ｆ．ＧＲＥＥＮＥ　Ｗ　Ｃ．Ｓｈａｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ—　（２００６—０９－０６　收稿）　ｋａｐｐａＢ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００４，５（５）：３９２—４０１．