● Ｃ Ｔ ● ＨＲＩＣＵＬＴＵＲ｜Ｅ 明睢ＩＬｌ一￥１ＨＩＣｌｌ 华北农学报・２００７，２２（６）：１９—２３ 马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）内蒙古分离物基因 间隔区（ ）的克隆与序列分析 郭志华 ，孙 毅２，张效梅２，张 健 ，白云凤２ （１．山西大学生物工程学院，山西太原０＂？ｇ￣０６；２．山西省农业科学院，山西太原０３００３１） 摘要：根据Ｇｅｎｂａｎｋ已报道马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）基因组序列，分析其基因间隔区（／Ｓ）两端的保守区，自行设计、合 成一对特异性引物，以ＰＬＲｖ内蒙古分离物总ＲＮＡ为模板，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到含ＰＬＲｖ 的一段３６９ ｂｐ的ｃＤＮＡ，克隆 于载体ｐＢＳ—Ｔ中。重组质粒经ＰＣＲ鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定，并进一步与ＰＬＲＶ其他分离物的同源序列作比 对。结果表明：克隆的ＰＬ ｖ内蒙古分离物的 序列与其他全部已发表的１３个全基因组中的 核苷酸序列有很高的 同源性，最高达到１００％，平均为９ｒ７．９０％，高于这１３个ＰＬ ｖ全基因组序列９６－８１％的同源性，说明 序列不仅在ＰＬＲＶ 的不同株系间比较保守，而且在ＰＬＲｖ的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示，将 构建成ＲＮＡ干扰型结 构导人马铃薯，将有可能获得抗ＰＬＲｖ多种株系且抗性更高的转基因植株。 关键词：马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲｖ）；内蒙古分离物；基因间隔区（ ）；ｃＤＮＡ克隆；序列分析 中图分类号：Ｓ４３２．４ １；Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—７０９１（２００７）０６—００１９—０５ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ／Ｓ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ Ｌｅａｆ Ｒｏｌｌ Ｖｉｒｕｓ ｈｍｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｉｓｏｌａｔｅ ＧＵ０ Ｚｈｉ ｈｕａ ，ＳＵＮ Ｙｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ．ｍｅｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ ，ＢＡＩ Ｙｕｎ．ｆｅｎｇ２ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ ０３０００６，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｈａｎｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｉｙｕａｎ ０３００３１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｐｏｔａｔｏ Ｌｅａｆ Ｒｏｌｌ Ｖｉｒｕｓ（ＰＬＲＶ）ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｙ— ｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｂｏｔｈ ｓｉｄｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＳ）ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ Ｇｅｎｂａｎｋ，ｏｎｅ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ（３６９ ｂｐ）ｃｏｎｔｉａｎｉｎｇ ｔｈｅ／Ｓ Ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ）ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ＰＬＲＶ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ｉｓｏｌａｔｅ ｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉａｎｔｏ ｐＢＳ—Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，ｒｅｓｔｒｆｉｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ／Ｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｆ ａｌｌ ｏｔｈｅｒ １３ ａｖａｉｌａｂｌｅ ＰＬＲＶ ｉｓｏ— ｌａｔｅｓ．ｈｅ ｒＴｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ（ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅａｃｈｅｄ １００％ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｎｄ ａｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｗａｓ ９７．９０％，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ １３ ＰＬＲＶ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｓ ９６．８１％）．ｈｅ／ＴＳ Ｗａｓ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｏｎｇ ＰＬＲＶ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＬＲＶ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｍ— ｐｌｉｅｄ ｔｈａｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌｎｔａ ｗｉｔｈ ｈｉｈ ｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＰＬＲＶ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔｉａｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ／Ｓ ｉｎｔｏ ｐｏｔａｔｏｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＰＬＲＶ；Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ｉｓｏｌａｔｅ；Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（／Ｓ）；ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ 马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｒｏｌｌ ｖｉｕｓ，ｒＰＬＲＶ）是马 铃薯生产中危害最重的病毒之一，在世界各产区均有 分布。病株叶片边缘以主脉为中心向上卷曲，病重时 呈圆筒状，叶质厚而脆，呈皮革状，植株矮小，枝叶僵 收稿日期：２００７—０９—１１ 化，产量严重下降。ＰＬＲＶ靠蚜虫（主要是桃蚜（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ））以持久、循环增殖型方式传播ｌ１］，在寄主植 株体内的分布主要局限于维管束内［引。因韧皮部被 破坏，在茎横切面可见黑点，茎基部和节部更为明显， 基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０４７１１０２）；山西省国际科技合作项目（２００７０８１００２） 作者简介：郭志华（１９８３一），女，山西榆次人，在读硕士，主要从事植物抗病毒研究 通讯作者：自云风（１９５７一），女，山西文水人，研究员，博士，主要从事植物基因工程研究工作。 维普资讯 http://www.cqvip.com
＾Ｃ Ｔ－一 ＩＩｎＲＩＧＵＬＩＵＲＡＥ ２Ｏ 华北农学报 ２２卷 ｌｌ哪ＬＩ－ＳＩＨＩ∞一 块茎组织表现为导管区网状坏死斑纹，严重影响马铃 薯品质。ＰＬＲＶ是单链正义ＲＮＡ病毒，属黄化病毒组 （Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）［０， ，基因组全长６．０ ｋｂ，以中间一段１９７ ｂｐ的基因间隔区（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，／Ｓ）将其分为５ 和３ 两个编码区。５ 编码区ＯＲＦ１，ＯＲＦ２ａ和ＯＲＦ２ｂ 分别编码２８，７Ｏ ｋＤ蛋白及复制酶。３ 编码区包括 ＯＲＦ３，ＯＲＦ４，ＯＲＦ５，以亚基因组方式独立表达２３ ｋＤ 外壳蛋白、１７ ｋＤ蛋白和５３ ｋＤ蛋白【 。Ｍａｙｏ等【 ｊ的 研究结果表明，ＰＬＲＶ亚基因组转录起始位点正处在 间隔区第二个保守序列中央，在转录起始位点５ 端有 ＵＵＡＵＡＵＵ序列，此序列可能为ＰＬＲＶ亚基因组启动 子，控制其下游基因的表达。因此克隆ＰＬＲＶ／Ｓ序 列，将其导人马铃薯，将有可能阻碍侵入马铃薯体内 的ＰＬＲＶ亚基因组的表达，使转基因马铃薯获得对 ＰＬＲＶ的抗病性。近年来，ＲＮＡ干扰技术发展迅速，亦 为植物抗病毒基因工程提供了新思路。由于ＲＮＡ干 扰依赖于序列的同源性＿７ ｊ，因此，分析ＰＬＲＶ的 序列同源性，将为获得ＲＮＡ干扰型抗ＰＬＲＶ转基因马 铃薯提供依据。 １ 材料和方法 １．１材料 病毒材料为经ＤＡＳ．ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ检测感染ＰＬＲＶ 的马铃薯块茎，由内蒙古大学张鹤龄教授惠赠。本 试验所用的各种限制性内切酶，Ｍ．ＭＬＶ反转录酶， Ｔ４ ＤＮＡ连接酶，ＲｎａｓｅＡ，Ｒｎａｓｉｎ，ｄＮＴＰ等购自ＴａＫａＲａ （大连宝生物工程有限公司）。Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、琼 脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒、克隆载体ｐＢＳ．Ｔ购白天 根生化科技有限公司。ＰＬＲＶ ＤＡＳ．ＥＬＩＳＡ试剂盒购 自山东省农科院生物技术中心。大肠杆菌（Ｅｓ． ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ．５ａ菌株由本实验室保存。其余试 剂为国产分析纯。 １．２植物总ＲＮＡ的提取 取经马铃薯卷叶病毒感染的新鲜叶片和茎，采 用酸性酚一硫氰酸胍一氯仿法＿９ ｊ提取总ＲＮＡ。 １．３引物设计与合成 根据Ｇｅｎｂａｎｋ已报道ＰＬＲＶ基因组序列，分析其 两端的保守区，设计合成一对特异性引物。引物 １：３０ ｍｅｒ，５ ．ＧＣＡＴＣＧＡＴＹＣＣＧＡＣＡＣＧＡＴＣＧＴＧＡＧＣＴＣ ＧＴ－３ ，其５ 端加有ＣｌａＩ酶切位点；引物２：２７ ｍｅｔ，５ ． ＧＴＧＧｒＩＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧｒＩＴＡＧＣＧＣＧＣＣＴ－３ ，其５ 端加 有ＢｓｔＥＩＩ酶切位点。引物由北京三博远志生物技术 有限责任公司合成。 １．４ ＲＴ．ＰＣＲ扩增ＰＬＲＶ基因间隔区 以感染ＰＬＲＶ的马铃薯叶片总ＲＮＡ为模板，反 转录合成ｃＤＮＡ第一链，２５ 反转录体系包含：５ Ｘ ＲＴｂｕｆｆｅｒ ５ Ｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ １．３ Ｌ，１０／￣ｍｏｌ／Ｌ弓Ｉ 物２２ ，ＲＮａｓｉｎ １ ，Ｍ．ＭＬＶＲＴ反转录酶１ ， ＲＮＡ模板２ 和ＤＥＰＣ水１２ 。以／Ｓ ｃＤＮＡ第一 链为模板ＰＣＲ扩增ＰＬＲＶ间隔序列 。５Ｏ ＰＣＲ 反应体系包括：超纯水３５ ，１０ Ｘ ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ ５ ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ １ ，反转录产物５ ，天根Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶０．３ ，１０／￣ｍｏｌ／Ｌ引物１和引物２各２ Ｌ。 程序设置为：９４ｃＩ＝变性５ ｍｉｎ，９４ｃＩ＝４５ Ｓ，５９ｏＣ １ ｍｉｎ， ７２ｃＩ＝１ ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物 经１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测后用天根胶回收试 剂盒回收。 １．５ ｃＤＮＡ克隆及重组质粒鉴定 ＲＴ－ＰＣＲ扩增的 基因片段回收纯化后连接到 ｐＢＳ．Ｔ载体上，转化至ＣａＣ１２法制备的大肠杆菌 ． ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＩ－ＩＳ￣感受态细胞中，在含有氨苄青霉 素（Ａｍｐ）的平皿上培养，挑选白色菌落，ＰＣＲ菌液和 酶切质粒ＤＮＡ鉴定筛选阳性克隆，并送北京三博远 志生物技术有限公司测序。利用美国ＮＣＢＩ的序列 提交软件工具将测序结果向ＮＣＢＩ基因数据库申请 登记注册。核苷酸序列同源性采用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ网站中的Ｂｌａｓｔｎ及ＤＮＡＭＡＮ Ｖｅｒ． ｓｉｏｎ ６软件进行分析并建立ＰＬＲＶ的系统进化树。 ２ 结果与分析 ２．１ ＰＬＲＶ／Ｓ基因的ＲＴ．ＰＣＲ扩增 以带毒马铃薯样品植物总ＲＮＡ为模板，利用 ＰＬＲＶ特异性引物进行ＲＴ．ＰＣＲ扩增，得到ＰＬＲＶ间 隔序列／Ｓ。ＰＣＲ产物进行１．２％琼脂糖凝胶电泳， 可见１条约３６８ ｂｐ的特异性扩增带（图１）。该片段 大小与预期结果一致。 ２ １ ｂｐ ４００．一 ２００－—— 产物 Ｍ．ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ Ｉ；Ｌａｎｅ １．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌａｎｅ ２．Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＲＴ－ＰＣＲ 图１ ＲＴ．ＰＣＲ扩增ＰＬＲＶ／Ｓ基因 Ｆｉｇ．１ ／Ｓ ｇｅｎｅ ｏｆ ＰＬＲＶ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰｅＲ ２．２ ＰＬＲＶ／Ｓ的克隆、序列分析与注册 回收ＰＣＲ产物，与ｐＢＳ．Ｔ载体相连，转化大肠 维普资讯 http://www.cqvip.com ６期 郭志华等：马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲｖ）内蒙古分离物基因间隔区（ＩＳ）的克隆与序列分析 ２１ 杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ，挑取平板上生长的１２个 ＡＦ４５３３８９）高度同源，形成一个大的分支，与 单克隆，碱法小量提取质粒。经ＰＣＲ检测和单酶 Ｄ１３７５３．１的同源性达到１００％，而这１３个，Ｌｓ序列 切、双酶切鉴定，初步筛选阳性重组子（图２）进行测 之间的同源性也高达９７．９０％（图４），表明不同株系 序。测序结果表明，所得目的片段大小为３６９ ｂｐ，含 ＰＬＲＶ的 序列在进化上是高度保守的。 有１９７ ｂｐ的，Ｌｓ序列，而且在／Ｓ １４９ ｂｐ的位置存在 ＵＵＡＵＡＵＵ的保守序列（图３）。将测序结果向ＮＣＢＩ 基因数据库申请登记注册，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＥＦ６０２３０２。 ２．３ 的同源性比较和系统进化分析 ４００ 将本试验克隆到的ＰＬＲＶ内蒙古分离物（ＰＬＲＶ． ２ｏ０ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ）／Ｓ序列（ＮＭ ＩＳ１９７）与ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ ／ＤＤＢＪ数据库公布的全部１３个ＰＬＲＶ全基因组序 列中所包含的 序列进行比对，并建立系统进化有 Ｍ．ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ １；１～１２．阳性重组子 根树。发现ＮＭ ＩＳ１９７与其中８个的 序列（Ｅｇｙｐｔ Ｍ．ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ １；１—１２．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＳ—Ｔ・ＩＳ ｉｓｏｌａｔｅ ＡＹ１３８９７０，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｉｓｏｌａｔｅ Ｄ１３９５３，Ｐｏｌａｎｄ ｉｓｏ－ 图２ ＰＣＲ菌液检测阳性重组子ｐＢＳ－Ｔ＿Ｉｓ ｌａｔｅ Ｘ７４７８９，ＵＫ ｉｓｏｌａｔｅ ＮＣ ００１ ７４７，Ｃａｎａｄｉｎａ ｉｓｏｌａｔｅ Ｆｉｇ．２ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＳ－Ｔ－ＩＳ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ＰＣＲ Ｄ１３９５４，Ｄ００５３０．１４．２ ｉｓｏｌａｔｅ ＡＦ４５３３９４及ｓｔｒａｉｎ ＯＰ ＡＦ４５３３８８－ＩＳ．ＳＥＱ Ａｌ４５３３８９－ＩＳ．ＳＥＱ ＡＦ４５３３９０＿ＩＳ．ｓ啦 ＡＦ４５３３９１－ＩＳ．Ｓ目Ｑ ＡＦ４５３３９２－ＩＳ．ＳＥＱ ＡＦ４５３３９３－ＩＳ．Ｓ目Ｑ ＡＦ４５３３９４一ＩＳ．Ｓ∞ ｍ３８９７０－ＩＳ．Ｓ目Ｑ Ｄ００５３０－ＩＳ．Ｓ回Ｑ Ｄｌ３９５３－ＩＳ．Ｓ目Ｑ Ｄ１３９５４一ＩＳ．Ｓ目Ｑ ＮＣ ００１７４７－ＩＳ．ｓＢＱ 灯４７８９－ＩＳ．Ｓ回Ｑ 面疆 丽 Ｃ￣ＩｓｅｌｌＳＵＳ 删５３３８８－ＩＳ．ＳＥＱ ３ＧＢＴＴＴＧＣ唧ｂ强黜＾Ｔｃ。 ｂ 麟 哪口 Ａ咖Ｉ 咖 船ｃｃＴ瑚黜哪 删 ＡＦ４５３３８９－ＩＳ．Ｓ∞ Ａ ５３３９０－ＩＳ．Ｓ∞ 罄 ， ＡＦ４５３３９１＿ＩＳ．ＳＥＱ ＡＦ４５３３９２－ＩＳ．ｓＢＱ ＡＦ４５３３９３－ＩＳ．ｓＢＱ 霎 ＡＦ４５３３９４＿ＩＳ．Ｓ目Ｑ ： 辇 ｍ３８９７０一ＩＳ．Ｓ∞ ： 蓬 Ｄ０Ｏ５３０＿ＩＳ．Ｓ目Ｑ ： 蟊 ’ ＤＩ３９５３－ＩＳ．Ｓ目Ｑ 一 Ｄｌ３９５４一ＩＳ．Ｓ目Ｑ …ｇ ＮＣ ００１７４７一ＩＳ．Ｓ∞ 主 蘑 ｘ７４７８９一ＩＳ．Ｓ啦 主 罄 ｌ鲤 塾 ：Ｓ盈Ｊ 二 蚕 Ｃ￣Ｉｓｅｌｌｓｕｓ 图３ 内蒙古分离物 序列与以报道的ｌ３组ＰＬＲＶ全基因序列的 的序列比对 Ｆｉｇ．３ Ｉｎｔｅｒｖａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ｉｓｏｌａｔｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｌｌ ｏｔｈｅｒ／Ｓ ｏｆ ａｌｌ １３ ａｖａｉｌａｂｌｅ ＰＬＲＶ ｇｅｎｏｍｅ 同时对ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ数据库公布的全 部１３个ＰＬＲＶ的全基因组序列也进行了比对，结果 ３ 讨论 表明，其核苷酸序列同源性为９６．８１％（图５），要低 本研究克隆、测定并分析了ＰＬＲＶ内蒙分离物 于 序列的同源性，同时由ＰＬＲＶ全基因组同源性 基因间隔区 序列。结果显示，ＰＬＲＶ的，５序列在 建立的系统进化树较由ＰＬＲＶ ＩＳ同源性建立的进化 不同分离物之间的同源性很高，且在ＰＬＲＶ全基因 树有很大差异，并没有表现出很多株系形成一个很 组序列中也是相对保守的， 中存在高度保守的 大分支的进化关系，这很可能是由于全基因组中其 ＵＵＡＵＡＵＵ序列。这似乎表明，，５作为ＰＬＲＶ亚基 他序列的保守性有差异造成的。这进一步表明，５ 因组的启动子在进化中保持其序列的保守性，更有 序列不仅在ＰＬＲＶ的不同株系间比较保守，而且在 利于高效、稳定地驱动其下游亚基因组的表达，促进 ＰＬＲＶ的全基因组序列中也是相对保守的。 ＰＬＲＶ的侵染和繁殖。Ｍａｙｏ等的研究表明，在ＰＬＲＶ 维普资讯 http://www.cqvip.com
ｎ Ｃ Ｔ ●—— ｎ日刚ＣＵＬＴＵＲＡＥ ２２ Ｂ●哪ＬＩ－ＳＩＨＩ∞—— 华北农学报 ２２卷 ０．Ｏ５ ＮＭＩＳ１９７．ＳＥＱ：０．０４４ ＡＹ１３８９７０一ＩＳ．ＳＥＱ：０．Ｏ４４ Ｄ１３９５３一ＩＳ．ＳＥ Ｑ：０．ｏ４４ Ｘ７４７８９一ＩＳ．ＳＥ Ｑ：０．０４４ ＮＣ＿Ｌ—Ｊ ００１７４７一ＩＳ．ＳＥＱ：０．０４４ Ｄ１３９５４一ＩＳ．ＳＥＱ：０．０４４ Ｄ００５３０－ＩＳ．ＳＥＱ：０．０４４ ＡＦ４５３３９４－ＩＳ．ＳＥ Ｑ：０．Ｏ４４ ０．Ｏ４３ ０．４２３ｌ 广 ．ＡＦ４５３３８９一ＩＳ．ＳＥＱ：０．０４４ ＡＦ４５３３９０－ＩＳ．ＳＥＱ：０．．Ｏ４Ｏ ＡＦ４５３３９２－ＩＳ．ＳＥＱ：０．０７４ ｌ１ 。。。・０…０７７Ｉ ０ＡＦ４５３３９３－ＩＳ ＳＥＱ：０．１７７ １０３ ．－１ ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一０．５０Ｏ ０．５００ ＡＦ４５３３９１－ＩＳ．ＳＥＱ：０．５００ ＡＦ４５３３８８－ＩＳ．ＳＥＱ：０．５００ Ｉ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一图４根据内蒙古分离物 与１３个ＰＬＲＶ全基因组中 序列同源性建立的系统进化树 Ｆｉｇ．４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｆｉａ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ａｌｌ １３ ａｖａｉｌａｂｌｅ ＰＬＲＶ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ０．０５ ０．０Ｄ８ ＡＦ４５３３９０．ＳＥＱ：０．０１０ ０．０１０ ０．０ｏ９ 一ＡＦ４５３３９３．ＳＥＱ：０．０１２ ＡＦ４５３３８８．ＳＥＱ：０．ＯＯ７ ＡＦ４５３３９Ｉ．ＳＥＱ：０．ＯＯ８ ０．０１７ １：竺 Ｉ ＡＦ４５３３９２．ＳＥＱ：０．０１９ ＡＹ１３８９７０．ＳＥＱ：０．００５ ０．ＯＯ６ Ｉ Ｘ７４７８９．ＳＥＯ：０．００５ ０．０２１ ： ： ＡＦ４５３３８９．ＳＥＱ：０．０１２ ＡＦ４５３３９４．ＳＥＱ：０．０１２ Ｄ００５３０．ＳＥＱ：０．ＯＯ７ ０．ｏｏ９ ＮＣ＿００１７４７．ＳＥＱ：０．００７ Ｄ１３９５４．ＳＥＱ：０．０１４ Ｄ１３９５３．ＳＥＱ：０．０３４ ０．０１３ ．０．ｏ３４ 图５根据１３个ＰＬＲＶ全基因组序列同源性建立的系统进化树 Ｆｉｇ．５ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ａＵ １３ ａｖａｉｌａｂｌｅ ＰＬＲＶ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ 转录起始位点５ 端有ＵＵＡＵＡＵＵ的序列，此序列与 ＢＭＶ亚基因组启动子部分序列十分相似，在其他植 物ＲＮＡ病毒的基因间隔区也有类似序列。这些结 因组中最为保守的序列是至关重要的。将高度保守 的 构建成ＲＮＡ干扰型结构，转基因马铃薯将有 可能获得对ＰＬＲＶ更高的抗性。并且，ＰＬＲＶ／Ｓ的 果表明基因间隔区对于植物病毒的增殖具有普遍的 重要的作用，进一步研究病毒基因间隔区的功能并 ＲＮＡ干扰型结构导入植物体后不能翻译成蛋白质， 规避了传统转病毒正义、反义基因或基因片段潜在 探索其抗病毒机制从而建立一种由基因间隔区介导 的ＲＮＡｉ抗病毒的新途径。 病原衍生的抗性（Ｐａｔｈｏｇｅｎ．ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ＰＤＲ）¨ｏＪ已有效地用于植物抗病毒基因工程，转基 的同源重组、异源包装及协生作用的生物风险。 参考文献： ｌ １ ｊ ＫＯＪ ＩＭＡ Ｍ．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ 因包括病毒外壳蛋白、移动蛋白、复制酶基因的全序 列或部分序列及其反义基因【ｌ ，转基因植物获得了 Ｌｅａｆｏｌｒｌ Ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９６９，３９：１６２—１７１． ［２］ 张鹤龄．马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）基因组研究进展［Ｊ］． 中国病毒学，１９９６，１１（１）：１—８． １３ｊ Ｒｏｂｅｒｔ Ｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｐａｕｌ Ｋ，Ｋｅｅｓｅ Ｍａｒｋ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ 对相关病毒的抗性，特别是病毒基因的ＲＮＡ干扰型 结构使转基因植物获得抗病程度相对更高 。 但是ＲＮＡ干扰效应依赖于序列的同源性，因此把 ＲＮＡ干扰用于植物抗病毒基因工程，选择病毒全基 ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆＬｕｔｅｏｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｙ，１ｇ９９０， ２８：３４１—３６３． １４ｊ Ｍｕｒｐｈｙ Ｆ Ａ，Ｆａｕｑｕｅｔ Ｃ Ｍ，Ｂｉｓｈｏｐ Ｄ Ｈ Ｌ， ａ／．Ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎ— 维普资讯 http://www.cqvip.com ｎ Ｃ Ｔ ＾ ６期 郭志华等：马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）内蒙古分离物基因闽隔区（ ）的克隆与序列分析 ｏｍｙ ｃｌａｓｓｉｉｃａｔｆｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＵＬＴＵＲＡＥ ２３ ＪＢＲＩ蛐唧Ｌｉ－ＳＨＩ髓 ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ—ｄｅｒｉｖｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｅ Ｓ ｏｗｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，１０： １８７—１９２． ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．ｈｅＴｏｒ Ｂｉｏｌ，１９８５，１１３：３９５—４０５． ［１１］ 白云风，赵晋锋，郑 军，等．反义外壳蛋白基因介导 的抗ＳＣＭＶ转基因玉米研究［Ｊ］．作物学报，２００６，３３ （５）：６６１—６６５． ｈ Ｎ Ａ，Ｓｉｔｎｇｈ Ｓ Ｐ，Ｗａｎｇ Ｍ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｔａｌ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ［１２］ Ｓｍｉ［５］Ｍａｙｏ Ｍ Ａ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｋ Ｊ，Ｂａｒｋｅｒ Ｈ．Ｉｎ Ｒｅｏｒｐｔ ｏｆ ｈｅｔ Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｃｒｏｐ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ １９８３［Ｒ］．１９８４：１８７． ［６］Ｍａｙｏ Ｍ Ａ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ｊ，Ｊｏｌｙ Ｃ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｆｐｏｔａ— ｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌｌ Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ ＲＮＡ［Ｊ］．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，１９９０，７０：１０３７— １０５１． ｉｎｔｒｏｎ－ｓｐｌｉｃｅｄ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，０７：３１９— ４３２０． ［７］Ｔｅｎｌｌａｄｏ Ｆ，Ｄｉａｚ—Ｒｕｉｚ Ｊ Ｒ．Ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ— ｔ Ｄ Ｃ，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ Ｐ Ｍ．Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｏｆ ａ ［１３］ Ｗａｎｇ Ｍ Ｂ，Ａｂｂｏｔｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｈｔ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｏｒｌｏｇｙ，２００１，７５ （２４）：１２２８８—１２２９７． ［８］Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｅ，Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｊ，Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ・ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔｎａｃｅ，ｔｒａｎｓｇｅｎｌｃ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｈｏ— ｍｏｌｏｇｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ，１９９５，７：１００１— １０１３． ［９］ Ｓａｍｂｒｅｏｋ Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ ｅｄ）［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ— ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１． ［１０］Ｓａｎｆｏｒｄ Ｊ Ｃ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｓ Ａ．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｉｒｕｓ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈａｉｐｒｉｎ ＲＮＡ ｇｉｖｅｓ ｉｍｍｕｎｉ— ｔｙ ｔｏ ｂａｒｌｅｙ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｍｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｐｌｎａｔ Ｐａｔｈｏｌ，２０００，１ （６０）：３４７—３５６． ［１４］ Ｍｉｓｓｉｏｕ Ａ，Ｋａｌａｎｔｉｄｉｓ Ｋ，Ｂｏｕｔｌａｌ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｒｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ （ＰＶＹ）ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ２００４，１４：１８５—１９７． ［１５］ 白云风，杨红春，曲 琳，等．抗甘蔗花叶病毒的无标 记反向重复转基因玉米［Ｊ］．作物学报，２００７，３３（６）： ９７３—９７８．
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