小陷胸汤合丹参饮含药血清对Ang-Ⅱ损伤人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

湖北中医药大学学报　・２０１４年ｌ２月第１６卷第６期　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２０１４，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．６　１６・　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　小陷胸汤合丹参饮含药血清对Ａｎｇ一１Ｉ损伤　人脐静脉内皮细胞ＩＣＡＭ一１表达的影响　张智华　，吴建红　，李德顺　，吕银娟　，王世友　，朱光建　，袁华品　（１．湖北中医药大学基础医学院，湖北武汉４３００６５；２．湖北中医药大学２０１２级中医学拔尖班，湖北武汉４３００６５）　摘要：目的从影响淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的角度探讨小陷胸汤联合丹参饮抗动脉硬化作用的机制。方　法采用Ａｎｇ—ＩＩ损伤体外培养的人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）作为病理模型，研究小陷胸汤合丹参饮对淋巴细胞与　血管内皮细胞粘附的影响及其分子机制。结果　用Ａｎｇ一１Ｉ损伤ＨＵＶＥＣ后，细胞ＩＣＡＭ一１ｍＲＮＡ表达、ＩＣＡＭ一１蛋　白含量以及淋巴细胞粘附率显著升高，而不同浓度的小陷胸汤合丹参饮含药血清则能降低ＩＣＡＭ—ｌｍＲＮＡ表达、ＩＣＡＭ　一１蛋白含量，减少ＨＵＶＥＣ与淋巴细胞粘附，且基本呈浓度相关。结论　通过降低细胞表面粘附分子的表达而减少　淋巴细胞与内皮细胞的粘附，可能是小陷胸汤合丹参饮抗ＡＳ作用的机制之一。　关键词：小陷胸汤；丹参饮；血管紧张素一ＩＩ；人脐静脉内皮细胞；细胞粘附分子一１　中图分类号：Ｒ２８５　文献标识码：Ａ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８—９８７ｘ．２０１４．０６．０５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｘｉａｏｘｉａｎｘｉｏｎｇ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｄａｎｓｈｅｎ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｓｅｒｕｍ　ＩＣＡＭ一１　ｏｆ　Ａｎｇ一ⅡＩｎｊｕｒｙ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｉｈｕａ　，ＷＵ　Ｊｉａｎｈｏｎｇ　，ＬＩ　Ｄｅｓｈｕｎ　，ＬＶ　Ｙｉｎｊｕａｎ　，ＷＡＮＧ　Ｓｈｉｙｏｕ’，ＺＨＵ　Ｇｕａｎｇｊｉａｎ　，ＹＵＡＮ　Ｈｕａｐｉｎ　（１．Ｂａｓｉｃ　ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ　４３００６５；　２．Ｇｒａｄｅ　２０１２　Ｅｌｉｔｅ　ｃｌａｓｓ　ｓｔｕｄｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ　４３００６５）　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｘｉａｏｘｉａｎｘｉｏｎｇ　ｄｅｃｏｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｎｓｈｅｎ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ（ＸＡＤ）ｏｎ　ａｎｔｉ—ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｂｙ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏ－　ｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ（ＨＵＶＥＣ），ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＸＡＤ　ｏｎ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ—ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｗｅｒｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ．Ｒｅｓｕｌｓｔ　Ｍ－　ｔｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ＨＵＶＥＣ　ｗｉｔｈ　Ａｎｇ—ＩＩ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＣＡＭ一１　ｍＲＮＡ，ＩＣＡＭ一１　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ａｎｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ＸＡＤ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＩＣＡＭ一１　ｍＲＮＡ，ＩＣＡＭ一１　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ＨＵＶＥＣ　ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ａｎｄ　ｂａｓｉｃａｌｌｙ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ—ｒｅｌａｔｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｎｔｉ—ＡＳ　ｏｆ　ＸＡＤ　ｉｓ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ—ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｘｉａｏｘｉａｎｘｉｏｎｇ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ；Ｄａｎｓｈｅｎ　ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ；Ａｎｇ—ＩＩ；ＨＵＶＥＣ；ＩＣＡＭ一１　动脉粥样硬化（Ａｓ）是众多心脑血管疾病共同的病理基础，　严重危害人类健康。目前普遍认为，ＡＳ是血管内皮损伤导致的　慢性炎症反应性血管疾病　。已有的研究证实细胞间黏附分　，为了明确小陷胸汤合　丹参饮对血管内皮细胞的保护作用，本实验以血管紧张素Ⅱ　（Ａｎｇ—ＩＩ）损伤培养的人脐静脉内皮细胞株（ＨＵＶＥＣ）作为模　型，观察小陷胸汤合丹参饮含药血清对淋巴细胞粘附率以及　子一１（ＩＣＡＭ一１）的表达上调促进和加速了ＡＳ进程，而小陷胸　汤与丹参饮均有显著的抗ＡＳ作用　ＩＣＡＭ一１表达的影响，进一步明确此复方治疗冠心病的作用及　机制，为小陷胸汤合丹参饮应用于临床治疗Ａｓ提供科学的理　基金项目：２００７年湖北中医药大学校级课题（２００７青年项目一１）。　作者简介：张智华（１９７７一），女，湖ｊＥ中医药大学副教授，研究方向：方剂学。　２０１４年ｌ２月第１６卷第６期　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２０１４，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．６　湖北中医药大学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｖ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　‘ｌ　７・　论依据。　１材料与方法　１．１　动物　ＳＤ大鼠６只，ＳＰＦ级，体重（１６０±２０）ｇ，雄性（由武汉大学　动物实验中心提供，合格证号：４２０００５００００１４６６）。　１．２药物和试剂　小陷胸汤合丹参饮：由全瓜萎、黄连、法半夏、丹参、檀香、砂　仁６味药组成，选用配方颗粒剂（由北京康仁堂药业有限公司　提供）；ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ／Ｆｌｏｕｒｅｓｅｅｉｎ　ｑＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（２Ｘ）（购自　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）；Ｅｘ　Ｔａｑ咖、ＤＬ２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ（均购自ＴＡＫＡ．　ＲＡ公司）；引物由金斯瑞合成；Ｉ丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺　（Ａｍｒｅｓｃｏ公司生产）；ＧＡＰＤＨ抗体（购于杭州贤至生物有限公　司）；Ａｎｇ—ＩＩ（购自Ｓｉｇｍａ公司）；ＩＣＡＭ一１兔抗人多克隆一抗　（购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司）；ＨＲＰ标记羊抗小鼠二抗、ＨＲＰ标记羊　抗兔二抗（购自武汉博士德生物工程有限公司）；显影定影试剂　盒（购自武汉巴菲尔生物有限公司）；其他试剂均为国产分析　纯。　１．３主要仪器　ＴＨ４—２００型倒置相差显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司生产），　ＣＯ　培养箱（Ｓａｎｙｏ公司生产），实时荧光定量ＰＣＲ仪（ＡＢＩ公司　生产），水平电泳仪、紫外分析仪（北京君意东方电泳设备有限　公司生产），分光光度计（上海舜宇恒科学仪器有限公司生产），　垂直电泳槽、电转仪（北京六一仪器厂生产）等。　１．４血清制备　小陷胸汤合丹参饮含药血清制备：取ＳＤ大鼠３只，分别灌　服小陷胸合丹参饮（将配方颗粒溶于２０ｍＬ超纯水，即４ｇ／ｍＬ），　灌胃量为ｌＯｍＩＭｋｇ（为人临床剂量的ｌＯ倍），每天２次，连续　３ｄ；空白血清制备：取ｓＤ大鼠３只，灌服等体积的生理盐水（按　ｌＯｍＬ／ｋｇ灌服），每天２次，连续３ｄ。末次灌药ｌｈ后腹主动脉　取血，分离血清，所取血清经５６℃，３０ｍｉｎ灭活处理后，用０．２２　ｍ的微孔膜过滤除菌，置一２０℃保存备用。　１．５　ＨＵＶＥＣ培养　按常规方法进行原代细胞培养，将生长成致密单层的ＨＵ－　ＶＥＣ细胞用０．２５％胰酶消化。在室温下放置ｌＯｍｉｎ，倒去消化　液，加入ｌＯｍＬ培养液，制成细胞悬液，接种于９６孔板，每孔　０．２ｍＬ。置培养箱３７￣Ｃ、５％ＣＯ：的环境下培养，细胞生长至底　面积的７０％一８０％时进行实验。　１．６分组　取对数生长的ＨＵＶＥＣ接种于培养板内。实验分为６组：　正常组（２０％正常鼠血清）；模型组（２０％正常鼠血清预处理２ｈ　后加入１０一Ｍ　Ａｎｇ—ＩＩ）；５％含药血清组；１０％含药血清组；　１５％含药血清组；２Ｏ％含药血清组。其中含药血清组均用各组　含药血清预处理２ｈ后加入ｌＯ～Ｍ　Ａｎｇ—ＩＩ。各组细胞继续培　养２４ｈ后进行各项指标测定。　１．７　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测ＩＣＡＭ一１ｍＲＮＡ表达　将ＨＵＶＥＣｓ接种于６孔板内，经上述实验干预２４ｈ收集细　胞。用Ｔｉ￣ｚｏｌ提取细胞总ＲＮＡ，测定（Ａ２６０／２８０）比值。以反转　录试剂盒逆转录为ｅＤＮＡ，１０倍稀释后用ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ荧光染　料进行Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ反应，以ＧＡＰＤＨ为内参照。扩增条件　为９５￣Ｃ３０ｓ变性，（９５￣Ｃ５ｓ，６０￣Ｃ３０ｓ，７２￣Ｃ３０ｓ）共４０个循环。最　后用２一ＡＡＣｔ法计算基因表达水平。引物序列见表１。　表１引物序列　１．８　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＩＣＡＭ一１蛋白表达　将ＨＵＶＥＣ接种于６孔板内，经上述实验干预后２４ｈ收集　细胞。按试剂盒说明提取总蛋白，ＢＣＡ法进行蛋白定量，以　ＧＡＰＤＨ为内参照蛋白，根据蛋白分子量配置８％的ＳＰＡＧＥ胶　电泳，ＰＶＤＦ膜转印，用含５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ（封闭液）浸泡　ＰＶＤＦ膜，室温摇床封闭２ｈ，ＩＣＡＭ一１一抗（１：４００）、ＧＡＰＤＨ一　抗（１：３０００）４℃孵育过夜。ＴＢＳＴ洗膜，用封闭液稀释相应的　ＨＲＰ标记二抗（１：８００００），使ＰＶＤＦ膜浸泡于二抗孵育液中，　室温摇床孵育２ｈ室温孵育ｌｈ，ＴＢＳＴ洗膜后，每张ＰＶＤＦ膜正面　相应蛋白相对分子质量区域上滴加适量的ＥＣＬ底物液，孵育数　分钟，待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，　ｘ光胶片压片后依次放入显影液显影，定影液定影，蛋白条带用　ＢａｎｄＳｅａｎ分析胶片灰度值。　１．９淋巴细胞黏附率的测定　培养的ＨＵＶＥＣ在２４孔板上生长至致密融合的单层后。用　不含血清的ＤＭＥＭ洗涤２次，置镜下观察，如无其他细胞污染，　则开始做黏附试验：在相应孑Ｌ中加入３７℃预温ｌＯｍｉｎ的活化淋　巴细胞，１ｍＬ／￣Ｌ。将培养板置３７℃、５％ＣＯ：孵箱中培养３０ｍｉｎ　后，轻轻吹洗上清液后收集，并加入含０．１ＭＥＤＴＡ的ＤＭＥＭ液　洗涤２次，收集各孔上清及洗涤液，混合后离心计数细胞。计算　黏附百分率：黏附百分率＝（１一未黏附细胞数／加入的细胞数）　×１００％。　１．１０统计学方法　采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行分析，对计量资料的各项指标　评定的分值采用均数４－标准差（　４－ｓ）表示，组问比较进行ｔ检　验，计数资料进行ｘ　检验。　２结果　２．１　ＨＵＶＥＣ鉴定　从人脐静脉上分离下来的内皮细胞为圆形或椭圆形，多呈　小团存在，４ｈ细胞开始贴壁。培养２—３ｄ后，细胞生长融合形　成排列紧密的单层细胞，呈铺路石样排列。Ⅷ因子抗体免疫荧　光染色后的阳性细胞占总细胞数９５％以上，细胞呈短梭形或多　角形，胞浆丰富，内含绿色荧光染色。