衰老和高血压对大鼠肾皮质血管紧张素Ⅱ及肾小球足细胞自噬的影响论文

主堡耋至堕兰鲞查；！！！至！旦箜！！鲞箜！塑堡丛！』壁垒！！！：垒２１ｉ！！！！！：∑！！：！！！盟！：！４２１・基础研究・衰老和高血压对大鼠肾皮质血管紧张素Ⅱ及肾小球足细胞自噬的影响潘明娇肖梦云吕杨王小丹傅博喻陆１００８５３解放军总医院南楼保健科（潘明娇、肖梦云、喻陆、王小丹），肾脏疾病国家重点实验室（吕杨、傅博）通信作者：王小丹，ｘｄｗａｎ９１１１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４—９０２６．２０１６．０４．０１８【摘要】目的观察正常血压衰老和高血压衰老大鼠肾皮质血管紧张素ＩＩ（ＡｎｇＩＩ）及肾小球足细胞自噬的变化，探讨高血压衰老时肾损伤的可能机制。方法正常血压大鼠Ｗｉｓｔａｒ－Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ）分为３、１３、２２月龄组，均有性别、月龄、数量相匹配的自发性高血压大鼠（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔＳＨＲ）为对照。监测大鼠血压；检测尿蛋白、尿肌酐、血肌酐、血尿素、血清和肾皮质Ａｎ９１Ｉ水平；观察肾组织光镜、透射电镜下形态学改变，计数足细胞内自噬体；检测肾小球ｎｅｐｈｒｉｎ、ＬＣ３ＢⅡ、Ａｔ９５、ｐ６２表达情况。结果ＳＨＲ血压高于ＷＫＹ（Ｐ＜０．０５）；正常血压和高血压衰老时，尿蛋白／尿肌酐比值均升高［ＷＫＹ：３月龄组（０．１２±０．０１）ｇ／ｍｍｏｌ，１３月龄组（０．１４±０．０４）ｇ／ｍｍｏｌ，２２月龄组（０．３４±０．０５）ｇ／ｍｍｏｌ，Ｐ＜０．０５；ＳＨＲ：３月龄组（０．２９±０．０４）ｇ／ｍｍｏｌ，１３月龄组（０．３１±０．０５）ｇ／ｍｍｏｌ，２２月龄组（Ｏ．７２±０．１６）ｇ／ｍｍｏｌ，Ｐ＜０．０５３，但血肌酐、血尿素均无变化（均Ｐ＞０．０５）；正常血压、高血压衰老、老时血清和肾皮质ＡｎｇⅡ水平无变化（均Ｐ＞０．０５），但。肾皮质ＡｎｇⅡ水平下降［ＳＨＲ３月龄组（Ｏ．０２±０．００）ｕｇ／Ｌ，１３月龄组（０．０２士０．００）ｔ＿￡ｇ／Ｌ，２２月龄组（０．０１±０．００）／＿￡ｇ／Ｌ，Ｐ＜ｏ．０５］；正常血压、高血压衰老时肾脏均出现肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化等衰老病变，但以高血压衰老时病变更为严重；正常血压衰老时肾小球足细胞自噬体相对堆积；肾小球ＬＣ３ＢＩＩ、Ａｔ９５、ｐ６２蛋白表达增多（均Ｐ＜０．０５），而高血压衰老时肾小球ｎｅｐｈｒｉｎ、ＬＣ３ＢⅡ、Ａｔ９５、ｐ６２蛋白表达减少（均Ｐ＜Ｏ．０５）。结论高血压衰老时肾皮质ＡｎｇＩＩ水平下降；正常血压衰老时肾小球足细胞自噬活性相对下降，高血压衰老时。肾小球足细胞自噬活性相对升高，高血压衰老时肾损伤可能与ＡｎｇⅡ诱导肾小球足细胞自噬有关。【关键词】衰老；高血压；血管紧张素Ⅱ；足细胞；自噬基金项目：国家自然科学基金（８１３７０４５２）ＥｆｆｅｃｔｏｆａｇｉｎｇａｎｄｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎＰａｎｏｎｒｅｎａｌｃｏｒｔｅｘａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｏｄｏｃｙｔｅａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｒａｔｓＸｉａｏｄａｎＭｉｎｇＪｉａｏ，ＸｉａｏＭｅｎｇｙｕｎ，ＬｙｕＹａｎｇ，Ｆ“Ｂｏ，ｈＬ“，Ｗ口ｎｇ７ＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ０ｆＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，ＳｏｕｔｈＢｕｉｌｄｉｎｇ，ＣｈｉｎｅｓｅＰｅｏｐｌｅＬｉｂｅｒａｔｉｏｎＡｒｍＹＧｅｎｅｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨｏｓｐｉｔａｌ，ｏｆＫｉｄｎｅｙＢｅｉｊｉｎｇ１００８５３，Ｃｈｉｎａ（ＰａｎＭＸ，ＸｉａｏＤｉｓｅａｓｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＰｅｏｐｌｅ７ＳＭｙ，ｈＬ，ＷａｎｇＸＤ）；ＳｔａｔｅＫｅｙＬｉｂｅｒａｔｉｏｎＡｒ？ＴｌＹＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｔ＋ｉｉｎｇｊ００８５３，Ｃ＾ｉｎａ（Ｌｙｖｙ，ＦｕＢ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：Ｗ矗ｎｇＸｉａｏｄａｎ，Ｅｍａｉｌ：ｘｄｗａｎｇｌ１１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ＣＯＬＴｌ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅａｎｄｐｏｄｏｃｙｔｅａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｒｅｎａｌａｇｉｎｇｒａｔｓｃｏｒｔｅｘｖｅｒｓｕｓａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡ（ＡｎｇⅡ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ｔＯａｇｉｎｇ．ｆｕｒｔｈｅｒＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｉｔｈｉｎｎｏｒｍｏｔｅｎｓｌｏｎｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍＯｆｒｅｎａｌｉｎｊｕｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓＮｏｒｍｏｔｅｎｓｉｖｅＷｉｓｔａｒ—Ｋｙｏｔｏ—ｒａｔｓ（ＷＫＹｓ）ｗｅｒｅａｌｌｏｃａｔｅｄｇｒｏｕｐ，２２一ｍｏｎｔｈ—ｏｌｄ（ＳＨＲｓ）ｓｅｒｖｅｄａｓｔｏｇｒｏｕｐ．Ｇｅｎｄｅｒ，ａｇｅｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｂｌｏｏｄｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓｂｙａｇｅｏｆ３－ｍｏｎｔｈ—ｏｌｄｇｒｏｕｐ，１３一ｍｏｎｔｈ—ｏｌｄａｎｄｎｕｍｂｅｒ－ｍａｔｃｈｅｄｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓｗａｓｐｒｅｓｓｕｒｅｕｒｅａｍｏｎｉｔｏｒｅｄ．Ｌｅｖｅｌｓｏｆｕｒｉｎａｒｙａｌｂｕｍｉｎ，ｕｒｉｎａｒｙｃｏｒｔｅｘｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，ｓｅｒｕｍｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＳＣＲ），ｂｌｏｏｄｗｅｒｅｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ），ＡｎｇⅡｉｎｓｅｒｕｍａｎｄｉｎｒｅｎａｌｎｅｐｈｒｉｎ，ＬＣ３ＢⅡ，Ａｔ９５ａｎｄｗａｓｔＯｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｋｉｄｎｅｙｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｓａｎｄｐｏｄｏｃｙｔｅａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＲｅｓｕｌｔｓｐ６２ｉｎｌｉｇｈｔａｎｄｇｌｏｍｅｒｕｌｉｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．ＢｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｔＯＳＨＲｓｔｈａｎｉｎＷＫＹｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｆｒｏｍ３－ｍｏｎｔｈ—ｏｌｄ１３－ｍｏｎｔｈ—ｏｌｄａｎｄ２２ｍｏｎｔｈ—ｏｌｄｇｒｏｕｐ．ｔｈｅｕｒｉｎａｒｙａｌｂｕｍｉｎ／ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅｒａｔｉｏｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎＳＨＲｓｗｉｔｈｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎａｎｄｉｎＷＫＹｓｗｉｔｈｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉｏｎ［ＷＫＹ：（Ｏ．１２±Ｏ．０１）ｇ／ｍｍｏｌ，（０．１４±０．０４）ｇ／ｍｍｏｌ７３５．（Ｏ．３４±万方数据０．０５）ｇ／ｍｍｏｌ；ｉｎＳＨＲ：（０．２９士０．０４）ｇ／ｍｍｏｌ，（０．３１士Ｏ．０５）ｇ／ｍｍｏｌ７３５．（Ｏ．７２士０．１６）ｇ／ｍｍｏｌ。Ｐ＜０．０５３，ｂｕｔＳＣＲａｎｄＢＵＮｌｅｖｅｌｓｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎＳＨＲｓａｎｄＷＫＹｓｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇ（ｂｏｔｈＰ＞０．０５）．ＡｎｄＡｎｇＩＩｌｅｖｅｌｓｉｎｂｏｔｈｓｅｒｕｍａｎｄｒｅｎａｌｃｏｒｔｅｘｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉｏｎｇｒｏｕｐｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｔｈｒｅｅｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓ（ｂｏｔｈＰ＞０．０５）．Ａｎａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｏｆＡｕｇ１Ｉｌｅｖｅｌｉｎｒｅｎａｌｃｏｒｔｅｘａｐｐｅａｒｅｄｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｔｈｒｅｅｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓｉｎｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ（ＳＨＲ：（Ｏ．０２士０．００）ｇｔｇ／Ｌ，（Ｏ．０２士０．００）／ｔｇ／Ｌ仍．（０．０１士０．００）｝ｔｇ／Ｌ，Ｐ＜０．０５３，ｂｕｔｓｅｒｕｍｌｅｖｅｌｏｆＡｎｇⅡｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｔｈｒｅｅｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓ（Ｐ＞０．０５）ｉｎｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｕｂｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙａｎｄｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｗｅｒｅｈａｄｎｏｏｂｓｅｒｖｅｄｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｔｈｒｅｅｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓｂｏｔｈｉｎｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉｖｅａｎｄｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ，ｂｕｔｔｈｅｓｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅｍｏｒｅｓｅｒｉｏｕｓｉｎｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｉｎａｇｉｎｇｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬＣ３ＢｌＩ，Ａｔ９５ａｎｄｐ６２ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉｖｅＡｔ９５ａｎｄｐ６２ｒａｔｓｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇ（ａｌｌｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎＰ＜０．０５）．Ｗｈｉｌｅｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｎｅｐｈｒｉｎ，ＬＣ３ＢＩＩ，ｗｅｒｅａｇｉｎｇｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ（ａｌｌＰ＜０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓＡｎｇＩＩｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｅｖｅｌｉｎｒｅｎａｌｃｏｒｔｅｘｉｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｉｎｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ．Ｐｏｄｏｃｙｔｅａｕｔｏｐｈａｇｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｉｎｎｏｒｍｏｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ，ｂｕｔｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇｉｎｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ．ＡｎｇｌＩ—ｉｎｄｕｃｅｄｐｏｄｏｃｙｔｅａｕｔｏｐｈａｇｙｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｒｅｎａｌｉｎｊｕｒｙｉｎｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇａｇｉｎｇ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ａｇｉｎｇ；Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；ＦｕｎｄＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ；Ｐｏｄｏｃｙｔｅｓ；Ａｕｔｏｐｈａｇｙｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１３７０４５２）自噬一溶酶体体系是真核细胞受损细胞器、大分子物质的主要降解途径，抑制自噬可加速衰老，促进自噬可延长寿命，在自然衰老过程中，自噬活性逐渐降低Ｅ１３，但尚不知在高血压状态下衰老细胞白噬活性的变化。肾小球足细胞是一种基础自噬活性较高的终末分化细胞［２］，近年研究结果表明，导致血压升高的主要活性物质一血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇＩＩ）可诱导增强足细胞自噬活性［３］。我们于２０１３年２月至２０１５年１月观察Ｗｉｓｔａｒ－Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ）大鼠、自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）衰老时大鼠肾皮质ＡｎｇⅡ、肾小球足细胞自噬的变化，进一步探讨高血压衰老时肾损伤的可能机制。材料和方法一、材料１．大鼠：雄性ＷＫＹ及ＳＨＲ均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，雄性按月龄分为ＷＫＹ３月龄组、１３月龄组、２２月龄组，雄性ＳＨＲ作为对照，按月龄分为３月龄组、１３月龄组、２２月龄组，每组均为６只。大鼠饲养于持续层流，温度（２３±２）℃，相对湿度４０％～６０％，人工光照明暗各１２ｈ的普通级动物房中，每笼３只，普通饲料（由军事医学科学院实验动物中心提供）和自来水自由饮食。２．试剂：Ｎｅｐｈｒｉｎ抗体（美国Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ公司）；ＬＣ３Ｂ抗体（美国Ｓｉｇｍａ公司）；Ａｔ９５抗体、ｐ６２抗体（英国Ａｂｃａｍ公司）；１３－ａｃｔｉｎ抗体、兔二抗、小鼠二抗（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）；ＡｎｇＵ放免药盒（北京原子高科股份有限公司）。二、方法１．血压测定：采用鼠无创血压仪测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压。测量对象为ＷＫＹ２２月龄组和ＳＨＲ２２月龄组，自１８月龄起，每月测量１次，至２２月龄，共５个月。２．血清及肾组织取材：苯巴比妥钠４０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射麻醉，开腹腔，腹主动脉取血，置于促凝管中，３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心１０ｒａｉｎ后取血清。夹闭肾动脉后立即剪取肾脏，冰上分离肾被膜，取左肾上级皮质标本１０％甲醛固定，待行过碘酸雪夫染色；取左肾上级皮质２～３块（每块体积约１１ｍｍ×ｒａｍ）置于２．５％戊二醛固定，待行电镜检查；取左、右肾皮质置于液氮中，转移至一８０℃冰箱冻存，待行相关指标的分子生物学检测。３．尿肌酐、尿蛋白、血肌酐、血尿素、血清及肾皮质ＡｎｇＵ水平测定：邻苯三酚红钼法测定尿蛋白，肌氨酸氧化酶法测定尿肌酐，计算尿蛋白／尿肌酐比值。酶法检测血肌酐，比色法检测血尿素，放免法检测血清及肾皮质ＡｎｇＩＩ。４．肾组织过碘酸雪夫（ＰＡＳ）染色：石蜡包埋，连续切片，厚度２／Ｌｍ，于４５℃温水中展片，多聚赖氨酸防脱玻片捞片，置于５８℃烘箱中烤片１０ＰＡＳ染色，倒置显微镜镜下观察。５．肾组织透射电镜观察：已充分固定，体积约１ｍｍＸｌｍｍ×１ｈ，ｍｍ肾组织经过梯度脱水、纯丙酮一包埋液包埋、加热固化、切片（厚度为５０～６０ｎｍ）、３％醋酸铀一枸橼酸铅双染色后，透射电镜观察足细胞形态及细胞器变化，计数每１５个放大２６５００倍视野下足细胞自噬体数量。万方数据６．免疫印迹法检测肾小球ｎｅｐｈｒｉｎ、ＬＣ３Ｂ１１、Ａｔ９５、ｐ６２表达情况：孔径分别为１２０肚ｍ、９０ｐ．ｍ、３７．５ｐ．ｍ的筛网由上至下叠放，在１２０ｐ．ｍ筛网上将大鼠肾皮质剪碎、研磨、生理盐水冲刷完全后，在９０肚Ｉｎ筛网上收集残余液体，镜下观察所收集的液体中肾小球可占９０％以上，其余为少量团状小管，３０００ｒ／ｒａｉｎ离心，采用免疫印迹试验检测沉淀中相关指标的蛋白表达水平：以ｐ－ａｃｔｉｎ的蛋白表达为内参照，用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ图像分析系统图像分析软件通过灰度值比值对蛋白的表达进行半定量分析。三、统计学方法采用ＳＰＳＳ２０．０软件。计量资料以孟±Ｓ表示。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用ＬＳＤ检验或Ｄｕｎｎｅｔｔ７Ｓ检验；同月龄ＷＫＹ与ＳＨＲ的两组比较采用独立样本ｔ检验，从低月龄到高月龄依次比较。Ｐ％０．０５为差异有统计学意义。结果一、血压的比较ＷＫＹ和ＳＨＲ血压随着月龄增加均无明显变化（Ｆ一０．５３、０．９９，均Ｐ＞０．０５），但ＳＨＲ血压均明显高于同月龄ＷＫＹ（ｔ一１９．５４、９．４６、４．４３、８．９３、８．７８，均Ｐ％０．０５），见图１。拗枷瑚ｍ一８Ⅲ趟目∞ｏ１７１８１９２０２１２２２３月龄（月）注：ＷＫＹ：血压正常Ｗｉｓｔａｒ－Ｋｙｏｔｏ大鼠；ＳＨＲ：自发性高血压大鼠；下表图同图１２２月龄组ＷＫＹ及ＳＨＲ血压比较二、肾功能、血清及肾皮质ＡｎｇＩＩ水平的比较ＷＫＹ和ＳＨＲ尿蛋白／尿肌酐比值升高（Ｆ一５２．４２、３０．６４，均Ｐ％０．０５），且ＳＨＲ尿蛋白／尿肌酐比值均高于同月龄ｗＫＹ（￡一８．６８、６．６４、５．４８，万方数据均Ｐ％０．０５）。ＷＫＹ衰老时，肌酐、尿素水平均无变化（Ｆ一３．２４、２．１０，均Ｐ＞０．０５）；ＷＫＹ衰老时，肌酐、尿素水平亦无明显变化（Ｆ＝１．９３、２．９３，均Ｐ＞０．０５）；两组比较，仅ＳＨＲ３月龄、ＳＨＲｌ３月龄的ＢＵＮ水平分别高于ＷＫＹ３月龄、ＷＫＹｌ３月龄（≠一３．３６、３．９２，均Ｐ＜０．０５）。ＷＫＹ衰老时，血清和肾皮质ＡｎｇＩＩ水平均无变化（Ｆ一１．５５、１．６５，Ｐ＞ｏ．０５）；ＳＨＲ衰老时，血清ＡｎｇⅡ水平无变化（Ｆ一０．１９，Ｐ＞０．０５），但肾皮质ＡｎｇＩＩ水平下降（Ｆ一３．８２，Ｐ＜０．０５）；两组比较，仅ＳＨＲ２２月龄肾皮质ＡｎｇⅡ水平低于ＷＫＹ２２月龄（ｔ一７．０７，Ｐ＜０．０５），见表１。三、肾组织ＰＡＳ染色观察ＰＡＳ染色显示，ＷＫＹ３月龄组和ＳＨＲ３月龄组肾小球、肾小管、小动脉无明显异常；ＷＫＹｌ３月龄组可偶见肾小球基质增宽，无明显细胞增殖，散在肾小管萎缩，无明显间质纤维化；ＳＨＲ１３月龄组部分小球出现系膜细胞增殖、系膜基质增多，缺血皱缩明显的小球约占３０％，灶性小管萎缩、间质纤维化，炎细胞浸润，小动脉壁、内膜明显增厚；ＷＫＹ２２月龄组可见部分小球出现局灶阶段性硬化，偶见全球硬化或皱缩废弃的肾小球，灶性小管萎缩、间质纤维化；ＳＨＲ２２月龄组肾小球鲍曼氏囊囊壁明显增厚分层，明显缺血皱缩的肾小球约占７０％，可见全球硬化肾小球，中至重度小管萎缩间质纤维化，炎细胞浸润，见图２～７。四、肾组织透射电镜观察透射电镜显示，ＷＫＹ３月龄组、ＳＨＲ３月龄组肾小球足细胞形态正常，但ＳＨＲ３月龄组线粒体多于ＷＫＹ３月龄组；ＷＫＹｌ３月龄组足细胞基本正常，ＳＨＲ１３月龄组足细胞的胞体和初级足突、初级足突与次级足突不相连，视野中多见体积较大的足突结构，覆盖在基底膜在上的足突部分短缩、融合，无明显脱失；ＷＫＹ２２月龄组可见足细胞内线粒体、自噬体增多，部分基底膜上足突短缩、融合，ＳＨＲ２２月龄组足细胞中线粒体增多，可见部分线粒体肿胀破裂，视野中散布的足突结构体积较小，基底膜不规则增厚，覆盖在上的足突短缩、融合，局部脱失，见图８～１３。ＷＫＹ衰老时，足细胞内自噬体增多（Ｆ一１６．０１，Ｐ＜０．０５），ＳＨＲ衰老时，足细胞内自噬体无明显变化（Ｆ一０．０２，Ｐ＞０．０５），两组比较，仅ＳＨＲ２２月龄组足细胞自噬体少于ＷＫＹ２２月龄组（ｔ一３．６０，Ｐ＜０．０５）。４２４表１蛔２Ｉ｜ＷＫＹ与ＳＨＲ体重、肾功能、肾皮质ＡｎｇＩＩ水平的变化（ｚ－ｉｓ）尿蛋白／尿肌酐４…鼠数（只）体质量肌酐尿素血清ＡｎｇＩＩ肾皮质ＡｎｇＩＩ（“ｇ／Ｌ）（ｇ）（ｇ／ｒｅｔ００１）（弘ｍｏｌ／Ｌ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）（ｐｇ／Ｌ）注：体质量未参与统计分析）ＷＫＹ或ＳＨＲｌ３月龄组、２２月龄组与３月龄组比较，ａＰ＜０．０５，２２月龄组与１３月龄组比较，ｂＰ＜０．０５；ＳＨＲ３月龄与ＷＫＹ３月龄比较，。Ｐ＜０．０５；ＳＨＲｌ３月龄与ＷＫＹｌ３月龄比较，。Ｐ＜Ｏ．０５；ＳＨＲ２２月龄与ＷＫＹ２２月龄比较，ｅＰ＜Ｏ．０５；表２同五、肾小球ｎｅｐｈｒｉｎ、ＬＣ３ＢⅡ、Ａｔ９５、ｐ６２蛋白表达的变化ＷＫＹ衰老时，肾小球ｎｅｐｈｒｉｎ表达无变化（Ｆ一０．００，Ｐ＞０．０５），ＬＣ３ＢⅡ、Ａｔ９５、ｐ６２表达增多（Ｆ一２１．９３、５．９３、９．９２，均Ｐ＜０．０５）；而高血压衰老时，ｎｅｐｈｒｉｎ、ＬＣ３ＢＩＩ、Ａｔ９５、ｐ６２表达减少（Ｆ一１０３．６０、２２．８０、１６．３０、８．０２，均Ｐ＜０．０５）。两组比较，ＳＨＲ１３月龄组、ＳＨＲ２２月龄组的ｎｅｐｈｒｉｎ表达分别少于ＷＫＹｌ３月龄组、ＷＫＹ２２月龄组（￡＝６．５９、６．３１，均Ｐ＜Ｏ．０５）；ＳＨＲ３月龄组ＬＣ３ＢＨ表达高于ＷＫＹ３月龄组（￡＝４．５３，Ｐ＜ｏ．０５），但ＳＨＲ２２月龄组的Ｉ￡３ＢⅡ表达却低于ＷＫＹ２２月龄组（￡一４．７８，Ｐ＜Ｏ．０５）；ＳＨＲ２２月龄组的Ａｔ９５表达低于ＷＫＹ２２月龄组（ｔ＝９．０４，Ｐ＜０．０５）；ＳＨＲ３月龄组、ＳＨＲ１３月龄组的ｐ６２表达分别高于ＷＫＹ３月龄组、ＷＫＹｌ３月龄组（￡一４．６１、２．５８，均Ｐ＜０．０５），但ＳＨＲ２２月龄组的ｐ６２表达却低于ＷＫＹ２２月龄组（ｆ一４．３５，Ｐ＜０．０５），见表２。一图２图６噬体ＳＨＲＷＫＹ３月龄组肾皮质ＳＨＲ图３图７ＷＫＹｌ３月龄组肾皮质ＳＨＲ图４ＷＫＹ２２月龄组肾皮质图５图８ＳＨＲ３月龄组肾皮质１３月龄组肾皮质２２月龄组肾皮质图１０图２～７为碘酸雪夫染色×４００图１１ＳＨＲＷＫＹ３月龄组足细胞自图１２图９ＷＫＹｌ３月龄组足细胞自噬体图１３ＳＨＲＷＫＹ２２月龄组足细胞自噬体３月龄组足细胞自噬体１３月龄组足细胞自噬体２２月龄组足细胞自噬体图８～１３放大倍数为×２６５００万方数据表２ＷＫＹ与ＳＨＲ肾小球自噬体计数和ｎｅｐｈｒｉｎ、ＬＣ３８１Ｉ、Ａｔ９５、ｐ６２蛋白相对表达量（ｚ－ｉｓ）讨论衰老是一种生物体随着时间的推移在结构和机能上发生衰退的自然过程，影响肾脏衰老的因素错综复杂，主要包括性别、种族、基因背景、慢性炎症、氧化应激和肾素一血管紧张素一醛固酮系统（ＲＡＡＳ）等［４］。本实验无论是正常血压衰老的ＷＫＹ还是高血压衰老的ＳＨＲ在结构上均出现肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化等衰老病理变化，但ＳＨＲ病变更加严重，且ＳＨＲ出现了高血压肾损伤较为典型的病变一肾小球缺血皱缩；功能上，ＷＫＹ和ＳＨＲ随着月龄的增加尿蛋白／尿肌酐比值上升，且３月龄、１３月龄、２２月龄ＳＨＲ血尿蛋白／尿肌酐比值高于同月龄的ＷＫＹ，３月龄、１３月龄ＳＨＲ血尿素高于同月龄ＷＫＹ。表明衰老是肾脏结构变化、功能衰退的因素之一，而高血压则加重了这些衰变。ＲＡＡＳ及交感神经系统激活，可引起血管张力增加，血流剪切力增加，阻力血管重构和血管收缩反应增强［５］，是原发性高血压主要病因之一，肾脏本身存在完整的ＲＡＡＳ［６］，高血压加重肾脏衰变可能与肾脏ＲＡＡＳ相关，因为：（１）本实验血清ＡｎｇⅡ水平无论是正常血压衰老还是高血压衰老时均无明显变化，但高血压衰老时肾皮质ＡｎｇⅡ水平下降，推测高血压衰老时肾皮质ＡｎｇⅡ水平下降很可能因为局部生成减少或消耗增多引起而不是因为循环Ａｎｇ１Ｉ水平的影响，此外，国内研究发现ＳＨＲ肾脏ＡｎｇＩＩ１型受体（ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｔｙｐｅ１ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＴｌＲ）随增龄表达是升高的［７３，表明高血压衰老时肾皮质ＡｎｇＩＩ水平下降可能是与ＡＴ。Ｒ结合增多，消耗增加；（３）Ｃｒｏｗｌｅｙ等［８１认为，ＡｎｇＩＩ主要是通过肾脏ＡＴ。Ｒ参与原发性高血压的发病，因此即使Ａｎｇ１Ｉ随增龄生成减少，增多的肾脏ＡＴ。Ｒ也可维持甚至是加重ＡｎｇⅡ的病理、生理作用。万方数据ＬＣ３ＢＩＩ、Ａｔ９５是自噬体膜上分子，尤其是ＩＩ、Ａｔ９５表达升高除了是因为自噬活性增强，也可中，电镜可见ＷＫＹ２２月龄组的肾小球足细胞自噬ＩＩ、Ａｔ９５、ｐ６２表达下降，电镜所见ＳＨＲ２２月龄组肾小球足细胞自噬体计数少于ＷＫＹ２２月龄组，因的［１１－１２］，为这一结论提供了证据。足细胞是肾小球滤过屏障的主要成员，足细因素，足细胞损伤表现主要包括足突融合消失或４Ｉ。本实验中，高１３月龄组、ＳＨＲ２２月龄组肾小球ｎｅｐｈｒｉｎ２２月龄组足白质的质控途径，但是当白噬活性持续保持高水ＬＣ３ＢⅡ是目前公认的自噬体的标志蛋白，其蛋白水平与自噬体数量成正比，需要强调的是ＬＣ３Ｂ能是细胞内自噬途径障碍，自噬体堆积［９］。ｐ６２是一类衔接蛋白，同时也是自噬的底物，其蛋白水平与自噬活性在一定范围内呈现负相关口…。本实验体明显多于其他组，正常血压衰老时肾小球的ＬＣ３ＢⅡ、Ａｔ９５、ｐ６２表达上升，表明ＷＫＹ肾小球足细胞随增龄自噬活性下降，自噬体有所堆积，这与国外研究结果是一致，即在自然衰老过程中，细胞自噬活性下降［１１。。高血压衰老时，肾小球ＬＣ３Ｂ此，相对于ＷＫＹ，ＳＨＲ肾小球足细胞自噬活性随增龄是增强的，且有研究结果表明，高血压时脑组织、心肌、网膜神经节细胞的自噬活性是过度增高胞丢失可推动’肾小球疾病进展并加速肾脏衰老，最终导致肾小球硬化［２］。衰老进程中，交感神经兴奋、肾脏ＲＡＳ及内皮缩血管肽系统活性增强、氧化应激、一氧化氮效能下降都是足细胞损伤的尿液中检测到脱落的足细胞标志分子如ｎｅｐｈｒｉｎ［１３，此外，ＡｎｇⅡ诱导足细胞损伤时，ｎｅｐｈｒｉｎ表达下降且分布异常［１血压衰老时肾小球ｎｅｐｈｒｉｎ蛋白表达下降，且ＳＨＲ表达少于同龄ＷＫＹ，电镜可见ＳＨＲ细胞足突明显融合脱失，可知高血压衰老时肾小球足细胞发生损伤。自噬途径是真核细胞内蛋平或过度增强，亦可导致细胞损伤或是细胞自噬４２６主堡耋至蜃堂銎查！！！！生！旦蔓！！鲞箜！塑曼坠ｉ翌』Ｑ！旦！堕：叁旦！ｉ！；！！！！∑！！：！！：盟！：！性死亡［１５｜。结合本实验研究结果，可能在高血压衰老时，ＡｎｇＩＩ通过表达增多的ＡＴ。Ｒ持续刺激足细胞，诱导足细胞自噬活性保持在高水平或是过度增强，自噬降解包括ｎｅｐｈｒｉｎ在内的足细胞大分子结构蛋白过多，此类蛋白清除多于合成，足细胞就会发生损伤，这可能是高血压衰老时肾损伤的机制之一，这一结论仍有待相关研究进一步验证。利益冲突：无参考文献［１］ＲｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎＤＣ，ＭａｒｉｎｏＧ，ＫｒｏｅｍｅｒＧ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄａｇｉｎｇ［Ｊ］，Ｃｅｌｌ，２０１１，１４６：６８２－６９５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０７．０３０．Ｉ－２］ＨａｒｔｌｅｂｅｎＢ，ＷａｎｎｅｒＮ，ＨｕｂｅｒＴＢ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］，ＳｅｍｉｎＮｅｐｈｒｏｌ，２０１４，３４：４２—５２．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｎｅｐｈｒ０１．２０１３．１１．００７．［３］ＹａｄａｖＡ，ＶａｌｌａｂｕＳ，ＡｒｏｒａＳ，ｅｔａ１．ＡＮＧＩＩｐｒｏｍｏｔｅｓａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｐｏｄｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１０，２９９：４８８—４９６．ＤＯＩ：１０．１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００４２４．２００９．［４］ＢｏｌｉｇｎａｎｏＤ，Ｍａｔｔａｃｅ－ＲａｓｏＦ，ＳｉｊｂｒａｎｄｓＥＪ，ｅｔａ１．Ｔｈｅａｇｉｎｇｋｉｄｎｅｙｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃＡｇｅｉｎｇＲｅｓＲｅｖ，２０１４，１４：６５—８０．ＤＯＩ：ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．１０．１０１６／ｊ．ａｒｒ．２０１４．０２．００３．［５］辛红菊，王淼，王义围．老年人杓型高血压晨峰现象与尿蛋白和肌酐的关系［Ｊ］．中华老年医学杂志，２０１３，３２：９３７—９３９．ＸｉｎＨＪ，ＷａｎｇＭ，ＷａｎｇＹＷ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｍｏｒｎｉｎｇｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅｓｕｒｇｅａｎｄｕｒｉｎａｒｙａｌｂｕｍｉｎｃｒｅａｔｉｎｉｎｅｒａｔｉｏｉｎｅｌｄｅｒｌｙｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｄｉｐｐｅｒｅｓｓｅｎｔｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ口］．ＣｈｉｎＪＧｅｒｉａｔｒ，２０１３，３２：９３７—９３９．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４—９０２６．２０１３．０９．００４．［６］ＭｏｏｎＪ．Ｒｅｃｅｎｔｕｐｄａｔｅｏｆｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ［Ｊ］．ＥｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅＢｌｏｏｄＰｒｅｓｓ，２０１３，１１：万方数据４１．ＤＯＩ：１０．５０４９／ＥＢＰ．２０１３．１１－２．４１．［７］黄群英，罗素芬，晋学庆．不同年龄自发性高血压大鼠肾脏ＡＴＩＲ和ＡＴ２Ｒ的表达Ｉ－Ｊ］．中国比较医学杂志，２００９，１９：１９－２３．ＨｕａｎｇＱＹ，ＬｕｏＳＦ，ＪｉｎＸＱ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＴｌＲａｎｄＡＴ２Ｒｉｎｔｈｅｋｉｄｎｅｙｏｆｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｇｅｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００９，１９：１９－２３．［８３ＣｒｏｗｌｅｙＳＤ，ＧｕｒｌｅｙＳＢ，ＨｅｒｒｅｒａＭＪ，ｅｔａ１．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｃａｕｓｅｓｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎａｎｄｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｔｈｒｏｕｇｈｉｔｓｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｔｈｅｋｉｄｎｅｙ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００６，１０３：１７９８５—１７９９０．ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０５５４５１０３．Ｉ－９－１ＫｌｉｏｎｓｋｙＤＪ，ＡｂｄａｌｌａＦＣ，ＡｂｅｌｉｏｖｉｃｈＨ，ｅｔａ１．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｕｓｅａｎｄｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆａｓｓａｙｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２０１２，８：４４５—５４４．ＤＯＩ：１０．４１６１／ａｕｔｏ．１９４９６．Ｊ，ＸｉａＭ，ＸｕＭ，ｅｔａ１．ＡｕｔｏｐｈａｇｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＣＤ３８一ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｙｓｏｓｏｍｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｐｏｄｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＭｏｌＭｅｄ，２０１３，１７：１５９８—１６０７．Ｄ０１：１０．１ｌｌｌ／ｊｃｍｍ．１２１７３．Ｔ，ＧａｏＬ，ＺｈｕＸＣ，ｅｔａ１．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－（卜７）ｉｎｈｉｂｉｔｓａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｏｆｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ［Ｊ］．ＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｓ，２０１３，７１：６卜６８．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｈｒｓ．２０１３．０３．００１．１２ＰａｒｋＨＹ，ＫｉｍＪＨ，ＰａｒｋＣＫ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｄｕｃｅｓｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎａｃｈｒｏｎｉｃｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｇｌａｕｃｏｍａｍｏｄｅｌ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ，２０１２，３：ｅ２９０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１２．２６．Ｍ，ＣａｒｐｉＡ，ＣｉｎｉＧ，ｅｔａ１．Ｐｏｄｏｃｙｔｅｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｇｉｎｇ－ｒｅｌａｔｅｄｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ（ＳｃｈｏｌＥｄ），２０１１，３：９９５—１００６．ｏｆｎｅｐｈｒｉｎｉｎｐｏｄｏｃｙｔｅｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｏｎⅡＩ－Ｊ］．ＪＲｅｃｅｐｔＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＲｅｓ，２０１４，９：１－５．ＤＯＩ：１０．３１０９／１０７９９８９３．２０１４．９６３８７２．Ｚ，ＬｕｏＹ，ＺｈｏｕＴＴ，ｅｔａ１．Ｃｏｕｌｄｐｌａｎｔｌｅｃｔｉｎｓｂｅｃｏｍｅｐｒｏｍｉｓｉｎｇａｎｔｉ—ｔｕｍｏｕｒｄｒｕｇｓｆｏｒｃａｕｓｉｎｇａｕｔｏｐｈａｇｉｃｃｅｌｌｄｅａｔｈ［Ｊ］．ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆ，２０１３，４６：５０９—５１５．ＤＯＩ：１０．１ｌｌｌ／ｃｐｒ．１２０５４．（收稿日期：２０１６—０１—２２）（本文编辑：段春波）［１０］Ｘｉｏｎｇ［１１］Ｊｉａｎｇ［１３］Ｃａｍｉｃｉ［１４］Ｙｕ＆Ｒｏｌｅ［１５］Ｌｉｕ