密度梯度离心法分离血液单个核细胞

密度梯度离心法分离血液单个核细胞

14级拔尖 赵子杰 141270054

一．实验目的

1.掌握密度梯度离心法。

2.进一步熟练显微镜的细胞观察方法。

二．实验原理

1.血液单个核细胞分离原理

外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为1.09~1.11g/L；粒细胞密度次之，为1.080~1.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.050~1.077g/L；血小板密度最小，只有1.030~1.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。

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细胞生物学实验 赵子杰 2016年2月25日

图1：血细胞分类

当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。

图2：分离液分离原理

2.显微镜操作技巧

（1）旋转物镜转换器到10×物镜，先将粗调焦螺旋外旋，使标本升至最高点。（2）一边用眼睛通过目镜观测标本，一边逐渐向内旋转粗调焦螺旋，直至视野中出现晃动的液体，观测细胞即在其中。（3）如视野中细胞太小，转换物镜至40×高倍镜，一般稍微向外旋转微调焦螺旋即可看到清晰的物像。

三．实验器材

1.肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IU／mL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。

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2.10mL低速离心机。

3.托盘天平。

4.10mL离心管。

5.胶头滴管。

6.40mL小烧杯等。

四．实验试剂

1.肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。

2.D-Hanks液。

3.人淋巴细胞分离液：市售。20℃时密度应为（1.077±0.001）g/L。

五．实验步骤

1.稀释血液：用D-Hanks液按1：1稀释抗凝血。

2.加样：先在10 mL离心管中加入2 mL鸡血淋巴细胞分离液，再沿管壁在距分层液界面上1 cm处缓慢加入2 mL稀释血。应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。

3.离心：2000 r/min离心20 min。

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4.肉眼观察分离效果。

5.收集PBMC：用胶头吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出PBMC，转入另一离心管。

6.制片观察PBMC：制备装片，显微观察所分离的细胞形态。

六．注意事项

1.制备介质梯度及加样时注意不要破坏下层液面。

2.离心机加速、降速时应缓慢、平稳，以免突然震荡导致分层破坏。

3.分离不同密度的细胞时，应配制或选购对应密度的分离液。

4.与血液样品接触时应注意生物安全防护，避免血源性传染病。

七．实验现象与结论

实验现象：

①离心前：离心管的上方是稀释血，下方是无色透明的人淋巴细胞分离液，二者有清晰的界限。

②离心后，管底为红色的细胞沉淀（红细胞和粒细胞），分离液和深黄色的血浆之间有灰白色薄层的PBMC。

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③光镜下观察单个核细胞呈球状，透明。分离效果较好。

图3：分离结果 图4：光镜下观察结果

（灰白层大部分已被吸取出来）

实验结论：

利用密度梯度分离液经过离心能够将血液中的单个核细胞进行分离，且分离效果较好。如果用特殊染料对细胞进行染色，则观察效果会更好。

八．思考题

1.向分层液上加完要分离样品后若拖延离心时间会出现红细胞沉至管底的现象。这会影响后面的分离结果吗？

答：会影响。如果加样完成后不立刻离心，密度较大的红细胞和粒细胞等在沉至试管

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底部的过程中，从分离液间穿过，会使离心后各部分细胞的界限不清晰或者条带过宽，对分离PBMC造成影响。

2.细胞悬液加在分层液上面后离心的速度增大和减少分别可能出现什么情况？

答：若离心速度的速度过快会损伤血细胞，甚至使血细胞裂解，对观察细胞形态造成影响；若离心速度过慢，会使细胞分离不完全，或者由于颗粒的扩散作用，会使区带越来越宽，对下一步分离PBMC产生影响。

参考文献

[1] 薛雅蓉，张晶,等.实用细胞生物学实验[M].北京,科学出版社,2013:69~71.

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