脲酶测定方法

脲酶urease（水解酶）：

脲酶试验原理：

存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂：1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液

标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500µg/g，另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。

1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。

2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟 3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并 仔细混合

4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h

5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。

6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。

7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。

8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照

9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。

结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示。 M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10 式中：M－土壤脲酶活性值

X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数

X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数 X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数

100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值 10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值

注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时，本法能获得可靠结果。当脲酶活性小于3微克NH3-N，培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）

计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。 NH3-N（mg）＝a*2

A：从标准曲线查得NH3-N毫克数 2 ：换算成1k土的系数

土壤脲酶活性测定（NH4+释放量法）

脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应：

在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。脲酶含有镍，分子量在151，000 Da～480，00 Da之

间。能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。 1、试验原理

通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h后测定氨释放量，估计脲酶的活性 (Tabatabai,1994)。 2、试验仪器

50mL容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。 3、试验试剂（所用试剂均为分析纯） A、甲苯（C6H5CH3）;

B、缓冲液：三（羟甲基）氨基甲烷[c（C2H8O3N3）=0.05mol·L-1，pH9.0]：称取6.1g三（羟甲基）氨基甲烷溶入700mL蒸馏水中，用c（H2SO4）=0.2mol·L-1的硫酸溶液调pH至9.0，再用蒸馏水定容至1000mL;

尿素溶液{c[CO(NH2)2]=0.2 mol·L-1}：称取1.2g尿素溶入约80mL缓冲液中，后用该缓冲液定容至100mL。尿素溶液要当天配制，并在4℃下保存备用；

氯化钾硫酸银混合溶液[c（KCl）＝2.5mol·L-1]－[ρ（Ag2SO4）=100mg·L-1]：先将100mg Ag2SO4溶于700mL蒸馏水中，再加入188g的KCl（分析纯）使之溶解，在定容至1000mL；

氧化镁（MgO）：于高温电炉中，将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h，再放置于干燥器中冷却，贮于瓶中；

混合指示剂：溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇（95％）中；

硼酸指示剂溶液[ρ（H3BO3）=20g·L-1]：溶解20g硼酸于950mL的热蒸馏水中，冷却，加入20mL的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液[c(NaOH)=0.1mol·L-1],直至溶液呈红紫色（pH约4.5），稀释成1L；

硫酸标准溶液[c（1/2H2SO4）=0.005mol·L-1]。 4、试验步骤

将5.00g新鲜土样（<2mm）放置于50mL容量瓶中，加入0.2mL甲苯（试剂a）和9mL缓冲溶液（试剂b），轻摇混匀后加入1.0mL尿素溶液（试剂c），再次轻摇混匀并塞上瓶塞。在37℃下培养2h。然后加入约35mL的KCl-Ag2SO4溶液（试剂d），轻摇容量瓶几秒钟后，放置至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4溶液定容，摇匀。同时要仪同样步骤做空白，只是培养2h后先加35mL的KCl-Ag2SO4溶液，然后加入1.0mL尿素溶液。

蒸馏法测氨：取土壤悬浮液20mL至蒸馏瓶中，加入0.2g的MgO，用硼酸指示溶液吸收，蒸馏液的体积约为30mL。用c（1/2H2SO4）＝0.005 mol·L-1的H2SO4标准溶液滴定。 5、结果计算

式中：ω（N）－单位时间内氨态氮的释放量，mg·kg-1h-1； c－1/2H2SO4标准溶液的浓度，mol·L-1； V－H2SO4标准溶液的体积，mL； ts－分取系数，2.5；

14－氮的摩尔质量，mg·mmol-1； 2－培养时间，2h； m－样品质量，g； k－水分系数。

6,注意：

a,与其他缓冲液（如磷酸盐缓冲液）相比，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液优点在于它能够有效地防止铵的固定。在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调pH，因为后者能够促进脲酶的活性；

b,在配制KCl-Ag2SO4溶液时，应将KCl溶于溶解后的Ag2SO4溶液中，因为Ag2SO4在KCl溶液中不溶。加入KCl-Ag2SO4混合溶液后脲酶的活性停止，因此该悬浮液在测定氨之前可以放置2h。

方法来源：鲁如坤,土壤农业化学分析方法,北京,中国农业科技出版社,2000.

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

(NaClO分子量74.5,Cl原子量35.5,活性氯比例为47%,0.9%为质量百分比,所以: 假设配1000克溶液,则需要NaClO为x克,水1000-x克,0.47x=0.9,所以x=1.9克

即称取1.9g次氯酸钠，溶于1000ml水即可。)

6）氮的标准溶液： 精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。绘制标准曲线时，再将此溶液稀释10倍供用。 三、操作步骤

标准曲线制作：分别吸取稀释后的标准液0、1、3、5、7、9、11、13ml，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。 15min后加10ml 10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取3ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml

次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。

注意事项:

1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算：

脲酶活性以24小时后5g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。

NH3－N=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数； a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数； a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数； V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；

m表示烘干土重

土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法） 一、原理

测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适PH值：4~5、6~7、8~10。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。 二、试剂 1）缓冲液：

a. 醋酸盐缓冲液 PH 5.0

0.2mol/L 醋酸溶液: 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.

0.2mol/L 醋酸钠溶液 : 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L。或者取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至1L. b. 柠檬酸盐缓冲液 PH 7.0

0.1mol/L 柠檬酸溶液： 19.2g C6H7O8溶至1L.

0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 ： 53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.

取6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至100ml.

c. 硼酸盐缓冲液 PH 9.6

0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L. 0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.

取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml.

2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制）

3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml 95%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 4）甲苯

5）0.3%硫酸铝溶液 6）酚标准溶液

酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀释至1L。 7）PH9.4硼酸缓冲液

0.2 mol/L硼酸：12.37g硼酸加水溶解稀释至1000ml 0.05 mol/L硼砂：19.07g硼砂加水溶解稀释至1000ml

取800ml硼砂溶液加200ml硼酸溶液混合即为PH9.4硼酸缓冲液。

三、操作步骤

标准曲线绘制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml PH9.4硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度。30min后，在分光光度计上660nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

称2g土样置于200ml三角瓶中，加5滴甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24h。然后在培养液加入40ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm处比色。 注意事项:

1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算

以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。 磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数； a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数； V为显色液体积；

n为分取倍数； m表示烘干土重

土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理

蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关。一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂

1）8%蔗糖溶液

2）PH5.5磷酸缓冲溶：1/15M磷酸氢二钠（11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

3）甲苯

4）3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。

5）标准葡萄糖溶液：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取0.5g葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，定容，摇匀。即为5mg还原糖/mg的溶液。冰箱中4℃保存期约一星期，若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤

（1）标准曲线绘制

分别吸葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温。将溶液转移至100ml容量瓶中，定容。以空白管调零在波长508nm处比色，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶测定

称取2 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入小试管中，加3ml DNS试剂，在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将试管移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后将试管内液体转移至100ml容量瓶中，并用蒸馏水定容稀释至100ml。在分光光度计上于508nm处进行比色。

为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。 四、结果计算：

蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）*V*n/m

a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数； V为显色体积； n为分取倍数； m为土重。

过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法） 一、原理

过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H2O2→ H2O+O2），从而降低了过氧化氢的毒害作用。土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法：根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性；滴定法：用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。本实验重点采用高锰酸钾滴定法。 二、试剂

1.5mol/L H2SO4溶液:量取42ml浓硫酸稀释至500ml；

0.3%的H2O2：将30%双氧水稀释100倍，其浓度用高锰酸钾滴定；

饱和明矾溶液：铝钾矾即明矾在20℃的溶解度为10.84g，30℃的溶解度为15.41g；

0.02mol/L高锰酸钾：称取3.16g高锰酸钾溶解定容至1L，其准确浓度用草酸钠标定；

三、操作步骤

分别取2g土壤样品于三角瓶中，加入40ml蒸馏水，加5ml0.3%的H2O2溶液，立即将三角瓶瓶口密封起来。震荡20分钟后加入1ml饱和铝钾矾，立即过滤于盛有5ml1.5mol硫酸的三角瓶中，滤干后，吸取滤液25ml，用0.02mol/L高锰酸钾滴定至紫红色，同时做无土对照。 四、结果计算（如下面处理）：

KMnO4标定：准确称取0.13-0.16g草酸钠置于250ml三角瓶中，加30ml谁和20ml1.5mol/L的H2SO4，加热至75℃左右，用KMnO4 滴定至紫红色。

刚开始滴定溶液就会变成紫红色，此时并不是滴定终点。等刚开始出现的紫红色褪色之后，再继续滴定至紫红色，直到30 S 紫红色不褪色为止。

H2O2标定： 吸取5ml H2O2 加入10ml1.5mol/L的H2SO4 ，用KMnO4滴定至紫红色。

过氧化氢酶活性以20min内每克土壤分解的过氧化氢的毫克数表示 过氧化氢酶活性= (V-VS)C*51/V0*17/W V：为滴定空白所用的KMnO4 体积； VS ：为滴定样品所用的KMnO4 体积； C：为KMnO4 浓度； V0 ：为滴定体积25ml； W：为土重；

过氧化物酶活性测定（比色法）

一、试剂

（1）1%邻苯三酚溶液 （2）0.5%H2O2 溶液 （3）乙醚

（4）0.5mol/L HCL

(5) PH4.5柠檬酸-磷酸缓冲溶液:

0.1mol/L 柠檬酸溶液：19.2g C6H7O8溶至1L. 取 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶：53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.

取10.65ml柠檬酸和9.35mlNa2HPO4混匀(用量较多可以乘以倍数配制),之后再用这两种溶液调节PH即可.

（6）重铬酸钾标准溶液以及标准曲线：0.75g重铬酸钾溶于1L0.5molHCL。此时的溶液相当于50ml醚中含有5mg紫色没食子素。

（7）标准曲线：取重铬酸钾标准溶液0、1、2、4、6、8ml，用0.5mol的HCL稀释至50ml。定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 二、操作步骤

取1g土壤置于150ml三角瓶中，然后注入10ml1%邻苯三酚溶液和2ml0.5%H2O2溶液。震荡后放置30℃恒温培养箱中培养2小时。取出后加4mlPH4.5的柠檬酸-磷酸缓冲溶液，再加35ml乙醚，用力震荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相比色。比色波长为430nm。为了防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色槽一次。实验需设置空白实验以及无基质（不加邻苯三酚）作为对照。

过氧化氢酶活性，以2h后，1g土壤生成的紫色没食子素毫克数表示。 过氧化物酶活性=（a样品-a空白-a无基质）*V/m

a为标曲上相对应的浓度，V为显色体积，即为乙醚的体积35ml。

参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法

一、 土壤蔗糖酶

3，5- 二硝基水杨酸比色法：

1、 试剂的配制

① 3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）

② pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

③ 8%蔗糖溶液。 ④ 甲苯。

⑤ 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。

标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。

2、操作步骤 称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入15ml8%蔗糖

溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。

溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。

为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

3、 结果计算 蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖（毫克）=a×4

式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数 4——换算成1g土的系数

二、 土壤淀粉酶

3，5- 二硝基水杨酸比色法: 1、试剂配制

① 1%淀粉。 ② 甲苯。

③ pH5.6磷酸盐缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

④ 3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）

⑤ 麦芽糖（C12H22O11.H2O）标准溶液：配制每毫升含0.02—2mg麦芽糖液为标准液。

标准曲线绘制：分别取不同浓度麦芽糖标准液1ml，移于50ml容量瓶中，加2ml 3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却。定容后在分光光度计上于波长508nm处进行比色。

2、操作步骤 称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入10ml 1%淀粉溶液，再加10ml pH5.6磷酸盐缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。

培养结束后，将悬液迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线的显色方法进行比色测定。

为了消除土壤中原有的蔗糖、麦芽糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

3、 结果计算 蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖（毫克）=a×4

式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数 4——换算成1g土的系数

三、土壤脲酶 靛酚比色法: 1、试剂配制：

①甲苯。

②10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

③柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾分别溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000ml。

④苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水中（B液）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将A、B溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

⑤次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 ⑥氮的标准溶液： 精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 。

标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 2、操作步骤

① 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。

② 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟

③ 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合。

④ 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h。

⑤ 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。

⑥ 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。

7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。

8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照

9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。

3、结果计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。 NH3-N（mg）＝a×2

式中 A——从标准曲线查得NH3-N毫克数

2 ——换算成1g土的系数。

四、蛋白酶活性

采用茚三酮比色法测定 1、 试剂配制

1}1%的酪素溶液：用pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液配制。

pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液：0.2M磷酸氢二钠（27.8gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）19ml加0.2M磷酸二氢钾（53.65g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）81ml即成。 2}0.1N硫酸。1个当量浓度（1N）的硫酸,即0.5mol／L的硫酸： （0.5＊98／98％）／1.84＝27.17mL 量取27.17毫升98％的浓硫酸（密度1.84g／mL），缓慢倒入约900毫升水中，搅拌，待冷却后转移至1L容量瓶中，加水至刻度，即得1N硫酸。

3}20%硫酸钠。100ml水中，20g硫酸钠

4}2%茚三酮液：2g茚三酮溶于100ml丙酮。

① 甲苯。

② 甘氨酸标准溶液：取0.1g甘氨酸溶液水中，定容1L，则得1ml含0.02mg氨

基氮的标准液。再稀释10倍做成标准液。

标准曲线的绘制：分别吸取工作液1,3,5,7,9,13ml移于50ml容量瓶中，加1ml的茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在风光光度计上于500nm处比色测定颜色深度。以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。

3） 操作步骤 称4g风干土，置于50ml三角瓶中，加20ml1%酪素溶液和1ml

甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30℃恒温箱中培养24h。培养结束后，

于混合物中加2ml0.1N硫酸和12ml 20%硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心15min(6000转/min)。取上清液2ml，置于50ml容量瓶中，按绘制标准曲线显色的方法进行比色测定。

为了消除土壤中原来含有的氨基氮引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

3、结果计算 蛋白酶活性，以24小时后1g土壤中氨基氮的毫克数表示。

NH2-N(mg)=a×5

式中 a——从标准曲线查的氨基氮毫克数 5——换算成1g土的系数

五、过氧化氢酶的测定 容量法（高锰酸钾滴定法） 1、试剂配制

①0.3%过氧化氢溶液。

②3N硫酸。(N叫做当量浓度，通常用来表示酸碱溶液中的有效浓度，就拿硫酸来讲，1N就是指H+的浓度为1mol/L即硫酸浓度为0.5mol/L，这样酸碱之间的换算就不需要考虑其为几元酸了. N是当量单位，是老单位，一般来1N=1mol/L，但是 对酸而言1N=1 mol/l 1、对于一元酸来说，1N=1 mol/L，如1N HCl=1mol/L HCl， 2、对于n元酸来说，1N=1/n mol/L，如1N H2SO4=1/2 mol/L H2SO4 1N H3PO4=1/3 mol/L H3PO4)

③0.1N高锰酸钾溶液。高锰酸钾克分子量的五分之一再乘0.1的重量溶于水，稀释至1升，摇匀，标定.【贮藏】置玻璃塞的棕色玻瓶中，密闭保存 2、操作步骤 取2g风干土，置于100ml三角瓶中，并注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢溶液。将三角瓶放在往复式震荡机上，震荡20min。而后加入5ml 3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中的悬液用慢速型滤纸过滤，然后吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾溶液滴定至淡粉红色终点。

3、结果计算 用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25ml原始过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。（A-B）×T 即为过氧化氢酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。高锰酸钾的相对分子量是158，但作为氧化剂，它常被还原成二价锰离子(原来是+7价)，这样它的基本单元为1/5，这样，0.1n的质量就是0.1*(1/5)158=3.3g 六、磷酸酶

磷酸苯二钠比色法 1、试剂配制

①0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。

②pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液。 ③氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g2.6-二溴对苯醌亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色的溶液未变褐色之前均可以使用。 ④酚的标准溶液：

酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 ⑤甲苯。

⑥0.3%硫酸铝溶液。

标准曲线绘制：取1,3,5,7,9,11,13酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。

2、操作步骤 取5g风干土，置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，轻摇15min后，加入200ml0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液、中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液、碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。后于培养中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。

吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述的方法显色。用硼酸盐缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。

3、结果计算 磷酸酶活性，以24小时后1g土壤中释放出的酚的毫克数表示。

酚（mg）=a×8

式中 a——从标准曲线查的酚毫克数 8——换算成1g土的系数