细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究

第１０卷第１期　２００９年２月　北华大学学报（自然科学版）　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＥＩＨＵＡ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ１．１０　Ｎｏ．１　Ｆｅｂ．２００９　文章编号：１００９－４８２２（２００９）０１－００３４—１２　细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究　孙宇，陈建光　１３２０１３）　（北华大学药学院，吉林吉林摘要：近年来的研究表明，细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）与心肌缺血再灌注损伤（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ—ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ，　ＭＩＲＩ）有着密切关系．全面了解有关研究进展，进一步开展相关的研究，将会为心肌缺血再灌注损伤的防治提供　更多的途径．为此，从细胞凋亡的基本知识、心肌缺血再灌注与细胞凋亡的关系、药物干扰作用及研究方法等方　面进行了阐述．　关键词：细胞凋亡；缺血再灌注损伤；研究方法　中图分类号：Ｒ５４２．２　文献标识码：Ａ　Ｏｎ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　ＳＵＮ　Ｙｕ，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ—ｇｕａｎｇ　（Ｐｈａｒｍａｃｙ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＢｅｉｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ　１３２０１３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｃｅｎｔ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ　ｈａｖｅ　ｓｈｏｗｎ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ａ　ｉｎｄｉｖｉｓｉｂｌｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ—ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ（ＭＩＲＩ）．Ａ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｏｎ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｗｉｌｌ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｍｏｒｅ　ｗａｙｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＭＩＲＩ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｐａｐｅｒ　ｒｅｖｉｅｗｅｄ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＩＲＩ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｅｔｃ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ・ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ；Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　近些年来，缺血性心脏病发病率不断上升，而随　着各种心血管外科手术如静脉溶栓、经皮冠状动脉　介入治疗（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，ＰＣＩ）　制，即坏死和凋亡，并且凋亡是引起心血管系统疾　病的重要原因．心肌再灌注虽然恢复了血流，但同　时也可能加速了受损心肌细胞的凋亡过程．故细胞　等方法的广泛开展，对于恢复心肌灌注、挽救濒死心　肌或缩小心肌梗死范围、保护心脏功能起到了很重　凋亡在心肌缺血再灌注损伤的病理过程中发挥着　重要的作用　．　要的作用，而心脏在缺血和恢复血流灌注后发生的　病理生理学改变——缺血再灌注损伤（ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ，ＩＲ）引起了人们的普遍关注．　随着分子心血管病学研究的不断发展，人们发　现缺血再灌注损伤引起的心肌细胞死亡有两种机　１　细胞凋亡　１．１　细胞凋亡的概念　细胞凋亡的原词ａｐｏｐｔｏｓｉｓ是来源于希腊语，　其含义为“花瓣或树叶的凋落”．细胞凋亡研究经　收稿日期：２００８—１０—１２　基金项目：吉林省科技发展计划项目（２００７０５３９７）．　作者简介：孙宇（１９８２一），女，硕士研究生，主要从事心血管药理学研究；　陈建光（１９６２一），男，教授，博士，硕士生导师，主要从事心血管药理学研究　第１期　孙宇，等：细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究　３５　历了近６０年的历史．早在１９５０年，发育生物学家　就通过对蛾变态的观察指出，在脊椎动物正常发育　过程中存在着细胞消亡现象，并提出了程序性细胞　死亡的概念，认为整个发育程序是受时间和空问条　件控制的　］．２０世纪７０年代，科学工作者应用光　镜和电镜等技术手段观察了哺乳动物体内形态学　变化，认识到生理性死亡的形态学特征．直到１９７２　年，澳大利亚的病理学家Ｋｅｒｒ等　首次从形态学　上描述了这种不同于坏死的细胞死亡方式．近年　来，随着分子生物学技术的不断发展和对细胞凋亡　研究的深入，比较规范地把细胞凋亡定义为：在一　定生理或病理条件下遵循自身程序的主动性细胞　自杀，是一个积极的、精确调控的、要消耗能量的过　程．即有核细胞在一些外部死亡信号的刺激下，通　过信号传递途径激活内源性ＤＮＡ内切酶，启动自　身内部的基因表达和调控而引发的连续性程序化　细胞死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ，ＰＣＤ），在整个过　程中涉及到一系列特殊基因的表达，随之细胞发生　特征性的形态学和生化变化　．　１．２　细胞凋亡的特征　作为细胞的一种由基因控制的主动性死亡过　程，细胞凋亡有着其独特的形态学特征和生化　特征　Ｊ．　１．２．１　形态学特征　在细胞凋亡早期，首先表现为细胞核的一系列　形态变化，细胞核固缩，核内染色质浓缩并聚集在　核膜的内侧呈镰刀状（或新月体形），与其邻近的　核孔消失，此时胞膜结构保持完整，容积皱缩，与邻　近细胞失去联系．随后胞膜起皱，表面不平，呈泡状　突起，细胞质和细胞器密度增高，细胞体积缩小变　得致密，细胞浆空泡变、固缩，但细胞膜的完整性未　遭到破坏．最后细胞膜突出、芽生，形成大小不等的　膜包裹的凋亡小体（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｏｄｉｅｓ），内含有完整　的细胞器和核碎片．凋亡的细胞及碎片可在数小时　内很快被附近的吞噬细胞吞噬，不同于细胞坏死的　是其并不引起周围组织的炎性反应和继发性损伤，　因此，又称为清洁性死亡（ｃｌｅａｎ　ｄｅａｔｈ）．　１．２．２　生化特征　细胞凋亡过程中可出现各种生化改变，其中基　因组ＤＮＡ有规律的片段化断裂及蛋白质的不可逆　性降解尤为重要．凋亡细胞的内源性ｃａ　，Ｍｇ　依　赖性核酸内切酶的活化，将细胞核染色体在核小体　连接处切断，形成１８０～２００　ｂｐ倍的ＤＮＡ片段，在　琼脂糖凝胶电泳上出现特征性“ＮＤＡ梯状条纹”，　因此，称ＤＮＡ梯（ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ）．目前认为，这是判　断细胞发生凋亡的主要标志之一　Ｊ．此外，还有Ⅱ　型转谷酰胺酶激活所致的交联蛋白质网形成和胞　浆膜修饰．　２　心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡　传统的观点认为，心肌细胞和神经元等终末分　化的不具备再生能力的细胞不会发生凋亡反应，直　到１９８９年首次证实人类心肌细胞也存有凋亡．　１９９３年Ｅｎｇｌｅｒ等　首次从形态学和生物化学方面　证实，缺血再灌注心肌中存有凋亡细胞．此后，越来　越多的证据显示，心肌缺血和再灌注损伤引起心肌　细胞凋亡．关于心肌细胞凋亡的研究起步较晚，其　原因有：凋亡过程短暂且不易发现（持续约１—３　ｈ）；方法学限制；低估凋亡在心脏病中的作用．近　年来，随着方法学的进步和凋亡研究的深入，已发　现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡之间有着密切　的关系，并且在心脏的生理、病理发展过程中起重　要作用　Ｊ，被认为是心脏由代偿性变化向病理性　变化发展的细胞学基础．　２．１　细胞凋亡在心肌再灌注损伤中存在的依据　多项研究证实，缺血再灌注可诱发心肌细胞凋　亡．但是，由于实验动物的种属和年龄、实验模型、　心肌缺血及再灌注的时间和程度、凋亡的检测方法　存在一定的差异，所以，目前关于凋亡是由心肌缺　血性损伤所诱发还是由再灌注损伤所诱发的问题　仍然存在着争议．　在ＭＩＲＩ中，研究细胞凋亡首先见于１９９４年　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ等　。。的报道，他们利用家兔离体心脏灌注　模型，观察发现单纯缺血３０　ｍｉｎ，４．５　ｈ和缺血　５　ｍｉｎ再灌注４　ｈ的心肌细胞均未出现凋亡现象，而　缺血３０　ａｒｉｎ后再灌注４　ｈ则出现心肌细胞凋亡，形　态学上呈现核染色质浓缩，并且有典型的ＤＮＡ梯　状条带现象，提示在缺血再灌注后的心肌中存在　ＤＮＡ的核小体问降解即凋亡，因此，认为凋亡是心　肌对缺血再灌注损伤的一个特殊反应．而Ｆｌｉｓｓ　等　应用在体大鼠心肌缺血再灌注模型，采用原　位末端标记法（ＩＳＥＬ）及琼脂糖凝胶电泳技术发　现，持续缺血２　ｈ或缺血４５　ｍｉｎ后再灌注１　ｈ均有　典型的凋亡形态改变与特征性ＤＮＡ梯状条带，并　且随着再灌注时间的延长，凋亡细胞的数目增加，　且后者的凋亡发生率（２３％）显著低于前者　（３３％），因此，认为缺血和再灌注大鼠心肌均可发　生细胞凋亡．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等¨　在大鼠离体心脏灌　注模型上发现心肌缺血１０　ｍｉｎ即出现心肌细胞凋　亡，缺血３０　ｍｉｎ达高峰，证实了缺血可引起心肌细　北华大学学报（自然科学版）　第１Ｏ卷　胞凋亡．姚震等¨　研究表明，不同时间的心肌缺血　再灌注损伤均可导致心肌细胞凋亡，以缺血３０～　６０　ｍｉｎ后再灌注时明显，说明心肌细胞凋亡的发生　率与此前心肌缺血时间长短有关．赵明中等¨　研　存在着一定的交叉和联系，抑制心肌细胞凋亡的发　生可能是临床上有效防治心肌缺血再灌注损伤的　一条重要途径．　究发现心肌缺血再灌注可减少心肌缺血细胞凋亡，　同时也能加速受损心肌细胞的凋亡过程，且凋亡细　胞主要位于心肌纤维收缩带区域内和心肌梗死区　周围，心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡随再灌注时　３　心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡　的发生机制　心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中所起　的作用越来越引起人们的重视，但确切机制还不　间的延长而显著增多．　在人类心肌梗死尸检中也发现梗死灶收缩带　有明显的细胞凋亡，该细胞凋亡多分布在短暂缺血　后血管再通的相邻部位和梗死灶的收缩带区域，病　理学认为，细胞凋亡机制与心肌短暂缺血后再灌注　损伤密切相关．Ｂａｒｄａｌｅｓ等　运用原位凋亡检测方　法对因明显心肌梗死者、可疑早期心肌梗死者和没　有心肌梗死者的心脏标本中心肌细胞的凋亡情况　进行了研究，结果发现所有明确诊断为心肌梗死的　心肌细胞均出现凋亡现象，可疑者为９７％出现细　胞凋亡，而没有心肌梗死者则仅为８％，因此，认为　缺血再灌注损伤中有细胞凋亡参与，且再灌注可以　加速不可逆转的细胞凋亡，而且心肌细胞的凋亡与　缺血再灌注持续时间长短有关．　综上所述，目前认为，缺血再灌注过程中有明　确的细胞凋亡参与，细胞凋亡加重了缺血再灌注损　伤．长时间持续性缺血和再灌注均可诱发心肌细胞　凋亡，尤其是再灌注后细胞内ＡＴＰ水平迅速恢复，　胞浆和线粒体内钙超载，以及自由基大量生成，更　是加速了不可逆性细胞凋亡的发生¨　．　２．２　细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用　由于再灌注期间凋亡细胞主要是出现在坏死　心肌的周围区域，所以提示凋亡可能在缺血再灌注　后心肌梗死范围的扩大中发挥着一定的作用…　．　为此，有研究人员采用核酸内切酶抑制剂——金精　三羧酸（ａｕｒｉｎＩｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ，ＡＴＡ）分析了凋亡在　缺血再灌注后心肌梗死中的作用¨　．结果显示，在　犬冠状动脉梗阻１　ｈ再灌注２４　ｈ模型上，再灌注开　始时采用ＡＴＡ处理可明显减少坏死组织周围区凋　亡心肌细胞的数目，同时伴有特征性“ＤＮＡ梯状条　纹”的缺失．这种凋亡程度的降低主要是与Ｂｃｌ一２　上调以及Ｂａｘ和细胞凋亡蛋白酶（Ｃａｓｐｓａｓｅ一３）活性　降低有关．更为重要的发现是，ＡＴＡ所致的心肌凋　亡抑制可明显缩小心肌梗死的面积．因此，抑制细　胞凋亡的发生不仅有助于减轻缺血再灌注心肌的　坏死性损伤，而且还可改善心脏的机械收缩功能．　上述研究充分说明，细胞凋亡和细胞坏死之间　清楚．　细胞凋亡是一个很复杂的过程，其触发机制尚　不清楚．细胞增殖剂可促进已进入细胞周期的增殖　型细胞增殖，但启动终末分化细胞的凋亡．心肌细　胞是非增殖型细胞，已不能进行细胞分裂进入细胞　周期，但在一定因素的刺激下仍可跨过Ｇ１／Ｓ期限　制点屏障进入细胞周期，发生分裂增生，并引发细　胞凋亡．Ｋａｊｓｔｕｒａ等　观察到在急性心肌梗死　（ＡＭＩ）时心肌细胞发生凋亡时确实存在Ｓ期细胞　突然增多的现象．　细胞凋亡区别于细胞坏死的一个显著特征即　受基因调控，是机体在内外环境刺激下启动的由基　因调控的细胞死亡过程．心肌缺血／再灌注损伤过　程中，心肌细胞凋亡的发生同样受到细胞周围刺激　信号的诱导，并且由特定的凋亡相关基因所控制．　细胞凋亡的发生机制目前仍未完全阐明，可能与以　下因素有关．　３．１　缺血再灌注损伤中细胞凋亡的相关调控　基因　尽管对缺血／再灌注损伤中细胞凋亡的调节机　制还不甚明确，但资料表明，ｂｃｌ一２家族，ｐ５３，Ｆａｓ抗　原及肿瘤坏死因子（ＴＮＦ一仅）等参与了细胞凋亡的　调节．　细胞凋亡的调控基因分为诱导基因（死亡基　因）和抑制基因（生存基因）．在生理条件下，心肌　细胞有序而协调地激活凋亡诱导基因（Ｂａｘ，Ｆａｓ，　ｐ５３等）和／或凋亡抑制基因（Ｂｃｌ一２等），共同调控　细胞代谢而维持细胞内环境的稳定．但在缺血再灌　注过程中，凋亡相关基因及其表达产物发生了变　化，从而导致心肌细胞凋亡的发生．在调控凋亡的　基因中，目前研究较多的是Ｂｃ１．２基因家族　Ｊ．　３．１．１　Ｂｃｌ－２基因的作用　Ｂｃｌ一２是一种原癌基因，具有促进细胞生存、抗　凋亡作用．Ｂｃｌ－２家族是最先被注意到与细胞凋亡　有密切关系的基因之一，１９８４年由Ｎａｋｍａｕｒａ等　首先在Ｂ细胞滤泡性淋巴瘤中发现的抗细胞凋亡　基因，在缺血再灌注损伤中表现得尤为突出．按其　第１期　孙宇，等：细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究　功能可分为抗凋亡的Ｂｃｌ一２亚族（包括Ｂｃｌ－２，Ｂｃｌ－　ｘＬ，Ｂｃ１．Ｗ，Ｍｃｌ一１，Ｎｒ．１３等）和促凋亡的Ｂａｘ亚族　（包括Ｂａｘ，Ｂａｋ，Ｂｉｄ，Ｂａｄ，Ｂｉｋ，Ｂｎｉｐｓ等），Ｂｃｌ－２和　Ｂａｘ是其中最重要的成员．Ｂｃｌ－２家族在心肌缺血　再灌注损伤所致细胞凋亡中发挥重要的调节作用．　Ｘｉｅ等　研究了Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ在大鼠缺血再　灌注损伤心肌的再灌注区和非再灌注区表达的不　同，在再灌注区未发现Ｂｃｌ一２表达，而Ｂａｘ表达增　加，表明该区心肌有发生凋亡的趋势；在非再灌注　区Ｂｃ１．２表达明显增加，这可能是尚存活的心肌的　一种自我保护机制．Ｚｈａｏ等　研究了结扎犬冠状　动脉左前降支１　ｈ后分别再灌注６，２４，４８，７２　ｈ对　心肌细胞表达Ｂｃ１．２和Ｂａｘ的影响，结果为随着再　灌注时问延长Ｂｃ１　２表达逐渐减少，而Ｂａｘ表达逐　渐增多，相应地心肌细胞凋亡指数也随再灌注时间　延长而增加．上述结果提示心肌缺血再灌注后局部　心肌表达Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ的多少可影响心肌细胞凋　亡的严重程度，提高Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ比率能减少心肌细　胞凋亡．　抗细胞凋亡的作用机制有以下几方面：１）抑　制ｃａ　的释放．应用转基因方法发现，Ｂｃｌ一２高表　达可抑制内质网释放Ｃａ¨，故Ｂｃｌ一２对细胞凋亡的　抑制作用可能与内质网中Ｃａ　有关．钙泵特异性　抑制剂ＴＧ诱导的ＷＥＨ１７．２等细胞凋亡可被Ｂｃｌ一２　抑制，其原因是Ｂｃｌ一２抑制了钙离子的跨膜流动，　提示Ｂｃｌ－２可通过调节细胞内钙离子浓度来调节　凋亡．２）Ｂｃｌ－２通过阻止促细胞凋亡基因信号传递　或阻止这些诱导基因产物发挥作用．３）细胞内抗　氧化作用．Ｂｃｌ一２可通过抑制氧自由基而发挥抗细　胞凋亡作用．在去除生长因子所诱发的凋亡中，活　性氧是触发细胞死亡的主要诱因，Ｂｃｌ一２的过度表　达可减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成．　这些发现提示，Ｂｃｌ一２可能通过抗氧化来抑制细胞　凋亡．同一基因家族的成员何以具有两种截然不同　的功能尚有待进一步观察．　３．１．２　ｐ５３基因　ｐ５３基因是著名的抗癌基因，参与细胞周期调　控和ＤＮＡ修复．ｐ５３是细胞生长过程中的分子感　受器，监测细胞的ＤＮＡ状态，起到分子警察的作　用．当细胞的ＤＮＡ损伤时，ｐ５３使细胞分裂停止于　Ｇ１期，即ｐ５３表达增加使细胞中止增殖以便使损　伤的ＤＮＡ进行修复取得时间；如果ＤＮＡ受损严重　无法修复，则ｐ５３蛋白持续增高，导致细胞凋亡．可　见，ｐ５３实质上是一种“分子警察”．正常的ｐ５３基　因可分为野生型和突变型两种，即野生型ｐ５３基因　（ｗｔ—ｐ５３）与突变型ｐ５３基因（Ｉｎ—ｐ５３）均参与细胞　凋亡的调节．野生型ｐ５３基因能诱导促进细胞的凋　亡，突变型ｐ５３则抑制细胞凋亡．　近年来，人们发现ｐ５３与细胞凋亡有密切关　系．齐丽彤等　应用Ｗｉｓｔａｒ大鼠结扎左冠状动脉　４５　ｍｉｎ再灌注４　ｈ，观察到缺血再灌注过程中心肌　细胞ｐ５３表达增加．Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ等　研究心肌细　胞凋亡的分子调节机制，结果证实，ｐ５３基因为心　肌细胞凋亡的激活因子，并且指导促凋亡基因Ｂａｘ　的转录，而且由ｐ５３激活的心肌细胞凋亡可以被抗　凋亡基因Ｂｃ１．２所阻断，支持了Ｂｃｌ一２是一个强有　力的抗凋亡因子　．　３．１．３　Ｆａｓ／Ａｐｏ—ｌ抗原家族　Ｆａｓ又称Ａｐｏ一１或ＣＤ９５，是位于细胞膜上的一　个肿瘤坏死因子受体／神经生长因子受体超家族成　员，广泛分布于各种组织细胞中，属Ｉ型膜蛋白，由　胞外区、穿膜区和胞浆区组成，主要通过Ｆａｓ／ＦａｓＬ　系统介导细胞凋亡．心肌缺血缺氧能引起凋亡促进　因子Ｆａｓ表达升高．　Ｆａｓ介导的细胞凋亡需要其天然配体ＦａｓＬ参　与．Ｆａｓ诱导凋亡发生的机制有两种解释，一为Ｆａｓ　抗原作为细胞表面受体，与ＦａｓＬ或抗Ｆａｓ抗体结　合，诱导酸性神经鞘磷酸酶的活化，分解神经鞘磷　脂，释放神经酞胺，随后神经酞胺可通过膜结合性　的苏氨酸或丝氨酸蛋白激酶等激活第二信使途径，　导致细胞内钙离子浓度增高，诱导多种生化反应，　从而诱导细胞凋亡发生．二为从Ｆａｓ受体，经　Ｃａｓｐｓａｓｅ的调节，活化ＪＮＫ和ｐ３８一ｋ，再通过某种方　式激活第二信使途径，使细胞内钙离子浓度升高，　进而诱导凋亡的发生．　实验发现，心肌缺血再灌注后梗死周边区发现　有大量Ｆａｓ受体表达，经既是抗氧化剂又是Ｂ受体　阻滞剂的卡维地洛处理后，梗死周边区凋亡细胞数　目减少７７％，同时Ｆａｓ受体表达显著降低．与野生　型小鼠相比，缺乏功能性Ｆａｓ的小鼠离体心脏缺血　再灌注损伤明显减轻．以上结果提示，Ｆａｓ具有促　进凋亡发生的作用．赵明中等　实验证实，心肌缺　血再灌注后Ｆａｓ基因的ＲＮＡ及蛋白表达均增多，　且随心肌缺血或再灌注时问延长而增加．通过比较　研究体外培养的鼠新生心肌细胞和非心肌细胞在　缺氧情况下的细胞凋亡，发现缺氧后１２　ｈ心肌细　胞的ＤＮＡ就发生降解，而非心肌细胞在缺氧７２　ｈ　后仍没有发生类似现象，同时心肌细胞Ｆａｓ的　ｍＲＮＡ表达上调２倍，相反非心肌细胞Ｆａｓ的　ｍＲＮＡ则呈下降趋势，表明缺氧引起的Ｆａｓ表达增　北华大学学报（自然科学版）　第１０卷　加可能是其引起心肌细胞凋亡的主要机制．进一步　研究发现新生大鼠心室肌细胞在缺氧的情况下给　予重组的ＦａｓＬ，能明显增加心肌细胞的凋亡，并且　伴有Ｆａｓ死亡结构域相关蛋白等明显增加，而在正　常供氧条件下则无上述改变＿２　．Ｆａｓ及Ｆａｓ．Ｌ蛋白　阳性表达细胞的分布与心肌凋亡细胞的分布趋势　一致进一步显示了它们之间的关系密切，表明　Ｆａｓ，Ｆａｓ—Ｌ系统在缺血再灌注后心肌细胞凋亡中有　重要意义．　３．１．４　核因子ＮＦ—ＫＢ的作用　ＮＦ—ＫＢ是Ｒｅｌ蛋白家族成员　，由多肽ｐ５０　和ｐ６５亚基形成ｐ５０和ｐ６５同源二聚体及ｐ５０一ｐ６５　异源二聚体，其中发挥主要生理功能的是ｐ５０．ｐ６５　异源二聚体．ＮＦ—ＫＢ多位于细胞的胞浆中，缺血再　灌注期间它可被细胞因子如ＴＮＦ一仅，ＩＬ一１Ｂ，ＩＬ一１７　激活，其中过氧化物对ＮＦ—ＫＢ的激活更为重要；　ＮＦ．ＫＢ激活后能调节多种细胞因子的表达，如ＩＬ．　６，ＩＬ一８，ＴＮＦ—　及粘附分子ＩＣＡＭ一１，ＶＣＡＭ一１Ｈ和　ＥＬＡＭ一１的表达，因而具有重要的作用．　ＮＦ－ＫＢ与细胞凋亡的关系尚未明确，ＮＦ—ＫＢ具　有抗细胞凋亡作用，它能抑制ｃａｓｐａｓｅ一８；从其能上　调许多有害细胞因子的作用来看，ＮＦ．ＫＢ能促进细　胞凋亡．总之，ＮＦ—ＫＢ在缺血再灌注损伤中的作用　尚未阐明，对缺血再灌注组织的细胞凋亡有何调节　作用亦不清楚．　３．１．５　半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Ｃａｐｓａｓｅ家族）　Ｃａｓｐｓａｓｅ是一个特殊的蛋白水解酶家族，全称　是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，目前为止已经　发现１４种．这类蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶类和　特异酶切Ａｓｐ氨基位点两大特点，其与心肌细胞凋　亡的关系是近年研究的热点之一．Ｃａｓｐｓａｓｅ家族主　要在凋亡的执行阶段起主要作用，凋亡的发生是一　系列Ｃａｓｐｓａｓｅ家族成员共同参与完成的　，它们　的活性部位含半肤氨酸，于底物ＡＳＰ部位产生特　异性水解．在众多Ｃａｓｐｓａｓｅ成员中，Ｃａｓｐｓａｓｅ一３被　认为是各种凋亡刺激因子激活的Ｃａｓｐｓａｓｅ家族中　的关键蛋白酶．Ｃａｓｐａｓｅ一３引起ＤＮＡ损伤修复酶降　解，同时激活核酸内切酶，从而使细胞凋亡．　Ｃａｓｐｓａｓｅ－３可被该家族其他成员活化，简而言之，　多种多样刺激因素启动的信号激活Ｃａｓｐｓａｓｅ．３．活　化的Ｃａｓｐｓａｓｅ一３可作用于一些其他Ｃａｓｐｓａｓｅ成员，　以瀑布式活化，引起细胞形态上的改变，使凋亡最　终得以完成．因此，Ｃａｓｐｓａｓｅ一３是凋亡蛋白酶级联　反应的必经之路．正常状态下无活性形式存在于组　织中，经凋亡信号刺激活化，导致凋亡细胞解体，能　酶解灭活凋亡抑制物，被认为是凋亡过程中关键的　通路，但并非是唯一的通路．　有学者　研究表明，Ｃａｓｐｓａｓｅ．３对线粒体有正　反馈作用，而且对于已经决定走向凋亡的细胞来　说，在仅仅依靠Ｃａｓｐｓａｓｅ一３初始激活后对凋亡信号　级联反应下游蛋白的水解作用还不能引起细胞凋　亡的情况下，必须依靠Ｃａｓｐｓａｓｅ－３对线粒体的反馈　作用来放大凋亡信号的力度，破坏更多的线粒体，　使其能量和氧化还原电势下降，为线粒体渗透性转　运孔道（ｍｉｔｏｅｈｒｏｎｄｒｉａｌ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｐｏｒｅ，　ＭＰＴＰ）进一步开放和细胞色素Ｃ的释放创造条　件，使凋亡不可逆转．曾志勇等　在猫的体外循环　实验中发现，再灌注１５　ｍｉｎ时心肌Ｃａｓｐｓａｓｅ一３　ｍＲＮＡ的表达量较主动脉阻断前明显增加，再灌注　９０　ｍｉｎ时心肌Ｃａｓｐｓａｓｅ一３　ｍＲＮＡ的表达量为主动　脉阻断前的４倍．徐强等　研究大鼠心肌再灌注　不同时相Ｃａｓｐｓａｓｅ一３激活与心功能变化的关系，提　出Ｃａｓｐｓａｓｅ一３激活是ＭＩＲＩ后心肌细胞凋亡导致心　功能下降的机制之一．据此，对半胱氨酸蛋白酶，尤　其是Ｃａｓｐｓａｓｅ一３表达的研究有助于进一步了解　ＭＩＲＩ心肌细胞凋亡病理过程的规律，亦为通过抑　制细胞凋亡防治ＭＩＲＩ提供了新的位点．　在大鼠和家兔的心肌缺血再灌注模型上应用　ＺＶＤＡ—ｆｍｋ（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂）后表　现为心肌原位缺口末端标记法阳性细胞数减少，心　肌梗死面积减少．过度表达心脏特异性半胱氨酸天　冬氨酸蛋白酶．３的转基因小鼠表现为心脏功能减　退，心肌梗死面积增加，细胞核、线粒体和肌纤维的　超微结构发生改变，但并未观察到凋亡细胞的特征　物“凋亡小体”．以上结果提示，凋亡的发生是一组　半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应的结果．　Ｃａｓｐｓａｓｅ一旦被激活，便可经过以下３条途径　引发细胞凋亡：１）影响ＤＮＡ的代谢和修复机制．　２）作用于维持细胞正常形态的蛋白成分．３）作用　于与细胞凋亡有关的基因．因为该酶在细胞凋亡中　起着灭活细胞凋亡的抑制物与促进细胞凋亡的重　要作用．　３．１．６　ＨＳＰ７０　ＨＳＰ７０（Ｈｏｔ　Ｓｈｏｃｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　７０，热休克蛋白７０）　是一组在外界刺激下维持细胞内稳态的自身保护　蛋白，作为真核细胞最重要的分子伴侣，在蛋白质　折叠、装配、转运和降解过程中起着重要作用．研究　表明，转染ＨｓＰ７Ｏ的转基因小鼠经历缺血再灌注　后，心肌细胞凋亡指数显著降低；对转染ＨＳＰ１０和　（或）ＨＳＰ６０的新生大鼠心肌细胞进行缺氧／复氧　第１期　孙宇，等：细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究　３．２．２　氧化应激增强　３９　打击，发现Ｃａｓｐａｓｅ一３活性降低、胞质中细胞色素Ｃ　含量减少，心肌细胞凋亡指数减少　．　３．２　心肌细胞凋亡的外部诱发因素　活性氧（ａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ）是活泼的氧自由基和具　在心肌缺血再灌注的过程中，炎症细胞、血管　内皮细胞和心肌细胞之间发生异常的相互作用，通　过释放大量的可溶性炎症介质和介导细胞内钙超　载而影响心肌细胞生存的微环境，从而诱发心肌细　胞凋亡．　有氧自由基反应性的其他含氧物质的总称，故又称　反应性氧类（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）．活性氧　包括超氧阴离子自由基（ｏ－・）、羟自由基（・ＯＨ）、　单线态氧（　Ｏ　）和过氧化氢（Ｈ　Ｏ：）等氧自由基．在　生理状态下，机体需要不断地产生自由基参与正常　代谢过程，多余的自由基可及时地被清除，其产生　３．２．１　中性粒细胞浸润　近２０余年的临床与基础研究证明，缺血再灌　注所致的心肌细胞凋亡中大量中性粒细胞聚集，与　缺血再灌注心肌的损伤程度密切相关　．　在再灌注早期，中性粒细胞与血管内皮细胞、　心肌细胞上的粘附因子结合，释放许多具有趋化作　用的炎症介质，并可级联放大，促使血管内皮细胞　收缩，血管通透性增加，诱导细胞粘附分子（Ｉ．　ＣＡＭ）以及血管细胞粘附分子（ＶＣＡＭ）广泛表达，　促使中性粒细胞粘附、滚动、激活和穿过血管壁游　走，通过产生的超氧自由基和蛋白水解酶等多种机　制造成血管功能障碍及组织损伤，进而吸引更多的　中性粒细胞、血小板，发挥趋化作用，促进中性粒细　胞与血管内皮细胞更广泛的粘附，导致“无复流现　象”形成．随着再灌注时间的延长，中性粒细胞逐　渐迁移进人细胞间隙而直接与心肌细胞发生细胞　间相互作用，诱发心肌损伤．在诱发心肌细胞凋亡　的过程中，中性粒细胞活化亦同样扮演着极其重要　的角色．　研究显示，在大鼠心肌缺血４５ｍｉｎ再灌注４　ｈ　引起的凋亡心肌细胞中，采用髓过氧化酶（ＭＰＯ）　活性来测定中性粒细胞的含量发现，其含量为正常　心肌组织的３倍　¨．采用在体大鼠心肌梗死模型　的另一项研究同样显示，中性粒细胞在再灌注心肌　中聚集增加可加重心肌细胞凋亡的程度．在犬和大　鼠局部心肌缺血再灌注模型进行的研究发现，危险　区中性粒细胞聚集与凋亡细胞数目的增加呈线性　关系，提示中性粒细胞与心肌细胞凋亡的发生密切　相关　．　但是，关于中性粒细胞如何介导心肌细胞凋亡　的发生机制目前尚不十分清楚，可能是由于中性粒　细胞聚集堵塞微血管而导致无复流现象，亦可能与　中性粒细胞活化后释放大量的炎性介质（例如自　由基和细胞因子）有关．因此，对于中性粒细胞在　再灌注诱发的心肌细胞凋亡中的直接作用机制，尚　需做进一步的研究．　与清除处于动态平衡．活性氧有很强的氧化活性，　可破坏机体氧化／还原动态平衡，造成生物大分子　（核酸、蛋白质、脂质）的氧化损伤．凋亡是机体氧　化损伤的后果之一．　心肌缺血再灌注时可产生大量的氧自由　基＿３　．氧自由基（ＯＦＲ）含量增高明显，生物膜脂质　过氧化，蛋白质变性以及合成障碍，线粒体损伤，组　织水肿，酶受体和离子通道活性及结构改变，从而　造成心肌损伤．在心肌缺血再灌注过程中，心脏可　通过下列途径产生大量的氧自由基　∞　：１）中性　粒细胞是氧自由基产生的一个重要途径．缺血期　间，活化的中性粒细胞可在促炎因子的刺激下聚集　到缺血组织，细胞因子转录和表达增加，促使细胞　膜脱颗粒，释放蛋白水解酶，炎症浸润线粒体，致使　呼吸链电子传递受损，耗氧量增加；随着再灌注期　间Ｏ，的重新供应，所摄取的氧通过ＮＡＤＰＨ氧化　酶途径产生超氧阴离子，然后在嗜苯胺蓝颗粒释放　的髓过氧物酶（ＭＰＯ）的催化作用下，超氧阴离子　可快速异常地产生大量过氧化氢、氢自由基和次氯　酸＿３　．２）通过上调嘌呤氧化酶和一氧化氮合成酶　的活性，内皮细胞和成纤维细胞可合成和释放大量　的氧自由基．　研究显示，氧自由基是启动凋亡的重要因子，　采用抗氧化剂和自由基清除剂可有效抑制细胞凋　亡的发生　．Ａｎｌｂｏｒｓｏｉ等　通过在体犬心肌缺血　再灌注模型进行研究发现，重组人超氧化物歧化酶　可明显减少心肌缺血再灌注所诱发的ＴＵＮＥＬ阳性　细胞．Ｇａｌａｎｇ等　通过研究亦发现，给予ＳＯＤ和　过氧化氢酶可消除缺血再灌注所诱发的心肌细胞　凋亡．　前面提到缺血再灌注期间，尤其在再灌注期间　组织内氧自由基大量产生，它可能通过以下途径诱　导细胞发生凋亡＿４　：１）氧化破坏内质网和线粒体　膜的完整性而导致细胞内钙超载，引起脂质过氧　化，从而影响信号转导系统，激发有关调控基因，导　致细胞凋亡．２）粒体膜通透性转运孔开放而释放　ｃｙｔｏ　Ｃ＿４　．３）直接损伤ＤＮＡ，激活转录因子ＡＰ．１　４０　北华大学学报（自然科学版）　第１０卷　和ＮＦ．ＫＢ，后者可通过上调ＴＮＦ一０ｌ和白介素＿６而诱　导心肌细胞凋亡的发生　Ｊ．４）攻击蛋白质，使许多　蛋白质尤其是具有酶活性的蛋白质功能丧失．心肌　缺血缺氧可使内源性抗氧化剂如ＳＯＤ失活或耗　尽，导致ＡＴＰ代谢产物在心肌组织中堆积，产生大　量ＲＯＳ，使细胞内氧化还原状态失衡，诱导某些基　因的表达，引起细胞凋亡．　３．２．３　细胞内钙超载　近年来，关于Ｃａ“细胞功能的研究报道很多，　游离ｃａ　是信号传递途径的成员之一，并认为细　胞内钙超载及其所触发的一系列有害代谢是导致　心肌细胞死亡的“最后共同通路”，在细胞凋亡中　有重要作用．　心肌缺血缺氧期，由于Ｎａ　一Ｋ　－ＡＴＰ酶活性降　低，使ＡＴＰ生成减少，影响离子的跨膜转运，导致　胞浆及线粒体内Ｎａ　超载，后者激活细胞质膜上的　Ｎａ　一ｃａｎ交换蛋白，因而在再灌时随着Ｎａ　外移，　大量Ｃａｎ进入细胞内，形成细胞内Ｃａ“超载现象．　缺血再灌注期间多种因素造成细胞内ｃａ　超载，　ｃａ　作为信号转导系统的第二信使，在细胞凋亡过　程中起着重要的作用．　钙超载Ｃａ“诱导细胞凋亡的调节机制有：　１）细胞内Ｃａ　浓度升高后可激活内源性Ｃａ“，　Ｍｇ“依赖性核酸内切酶，使细胞核内双链ＤＮＡ在　核小体Ｌｉｎｋｅｒ部位降解成寡核苷酸片段．２）钙超　载可直接调节某些Ｃａ　敏感蛋白酶活性，如核骨　架蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、拓扑酶Ⅱ、磷脂酶等．　３）ｃａ　可激活蛋白激酶Ｃ，激发或促进细胞凋亡，　令其转移到细胞膜，使Ｇ．蛋白磷酸化，Ｇ一蛋白减　少，胞内ｃＡＭＰ增加，导致细胞凋亡．４）Ｃａ“还可调　节谷氨酰胺转移酶的活性，使大量蛋白质发生交　联，在脂质膜下形成蛋白质网，防止胞浆内成分外　漏，避免了像坏死所致的炎症反应．而且，转谷酰胺　酶还参与了胞浆膜的修饰，从而有利于吞噬细胞识　别形成的凋亡小体而将其吞噬．５）线粒体内大量　ｃａ　聚集，引起线粒体内膜上的通透性转换孔开　放，释放细胞色素Ｃ入胞质内，进一步激活　Ｃａｓｐｓａｓｅ诱致细胞凋亡＿４　．应用ｃａ　通道阻断剂　硝苯地平能拮抗Ｃａ　所致的心肌细胞凋亡．　事实上，细胞内钙离子超载及氧自由基的过量　产生是同一病理生理过程中的两种不同现象，且两　者存在互为因果关系．细胞内产生过量的氧自由基　可直接损伤细胞膜，导致细胞膜通透性增加，钙离　子内流．而细胞内钙离子浓度增高，又可激活钙离　子依赖性蛋白酶，后者可催化黄嘌呤脱氢酶　（ＸＤＨ）转化为黄嘌呤氧化酶（ＸＯＤ），而ＸＯＤ在有　氧条件下能促进次黄嘌呤分解为尿酸的同时产生　大量的氧自由基．因此，在对缺血再灌注损伤致细　胞凋亡的机制认识上不可将两者分开．　３．２．４　一氧化氮及一氧化氮合酶　一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）是由血管内皮合成　并释放的一种内源性舒张因子，是体内一种重要的　生物信号分子，在心血管生理学和病理学过程中发　挥着重要调节作用．大量的ＮＯ具有细胞毒性作　用，在体内缺氧状态下，巨噬细胞、中性粒细胞、心　肌细胞等均可激活诱生型ＮＯ合成酶（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉＮＯＳ）产生超剂量的ＮＯ，干扰　能量代谢、直接损害ＤＮＡ、激活多聚ＡＤＰ核糖聚合　酶或扰乱细胞内Ｃａ　稳态，从而引起细胞损伤，导　致细胞凋亡．　但ＮＯ也是一种细胞保护因子，ＮＯ可分别通　过ｃＣＧＭＰ与ｃＡＭＰ途径降低细胞内Ｃａ　浓度或　阻断ｃａ“内流，通过平滑肌细胞舒张等多种途径　起到减少心肌再灌注损伤的作用．这些保护作用均　由结构型ＮＯ合酶（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｃＮＯＳ）完成．所以，ＮＯ在心肌缺血再灌注　过程中是发挥促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡的　作用，可能取决于ＮＯ在心脏内发挥作用的浓度和　心脏的氧化还原状态．不同的实验方法可能会出现　完全不同的实验结果．　３．２．５　细胞因子与粘附分子大量表达　细胞因子是体内白细胞及其他不同的细胞分　泌的一类小分子水溶性蛋白质，具有多种细胞调节　活性．在心肌缺血再灌注损伤中，活化的巨噬细胞、　肥大细胞、中性粒细胞以及心肌细胞本身可产生大　量的细胞因子和粘附分子．细胞因子不仅可促进心　肌炎症，而且还可与粘附分子相互作用而加重心肌　细胞凋亡．白细胞介素一１（Ｌ　１），白细胞介素　（Ｌ－　６），白细胞介素一８（Ｌ一８）和肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）都参与了心肌缺血再灌注的　损伤．　ＴＮＦ—ＯＬ是一类具有多种生物学效应的细胞因　子，目前有关ＴＮＦ一仅在心肌细胞凋亡诱导中作用　的研究较多．在缺血和再灌注期间，心肌细胞内的　ＴＮＦ．ＯＬ表达明显上调．徐世安等　应用大鼠　Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ离体心脏灌注模型，通过酶联免疫法测　定心肌组织ＴＮＦ含量，原位杂交检测ＴＮＦ　ｍＲＮＡ　的表达情况．结果显示缺血再灌注心肌的ＴＮＦ水　平明显升高，并且ＴＮＦｍＲＮＡ也出现表达．　多项研究显示，ＴＮＦ一仅可通过下列机制诱发心　第１期　孙宇，等：细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究　４１　肌细胞凋亡：１）与其受体ＴＮＦＲＩ结合后，直接激活　心肌细胞凋亡的信号转导通路．２）激活酸性鞘磷　脂酶，通过产生脂质信使神经酰胺而介导细胞凋亡　的发生　ｊ．３）诱导内皮细胞和部分心肌细胞表达　ＩＬ一１，ＩＬ．２，ＩＬ－６，细胞间粘附分子．１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ．１，ＩＣＡＭ　１）和血小板活化因子，　的凋亡细胞和正常细胞．　４．１．３　电子显微镜　虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和　凋亡小体，但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超　微结构，因此，用光镜观察难以令人满意，而透射电　镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变　化．电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、　最可靠的方法，被认为是确定细胞凋亡的金标准．　促进中性粒细胞与内皮细胞的粘附和脱颗粒，并激　活ＮＡＤＰＨ氧化酶而释放氧自由基，从而间接地调　控凋亡过程　．　４　心肌细胞凋亡的研究方法　基于凋亡细胞独特的形态学和生物化学特征，　我们可以将凋亡细胞与活细胞和坏死细胞区别开　来．心肌细胞凋亡是一个非常复杂的过程，凋亡散　在心壁中，并且限制于单个细胞中，整个凋亡过程　历时短暂．用凋亡诱导因素处理心肌细胞，细胞很　快开始皱缩，并且在几分钟内伴随着细胞表面以出　芽方式生成凋亡小体　．如果凋亡小体没有被吞　噬掉，它们在心肌组织中也只保留几个小时，由于　从凋亡开始到凋亡结束的时间相当短，因此，即使　是在某种情况下，凋亡的比例相当高，能够观察到　的也只是小部分　…．由于心肌细胞凋亡时程短暂　不易观察，再加上方法学的限制，使心肌细胞凋亡　的研究相对滞后．目前，对心肌细胞凋亡的研究，主　要采用形态学特征检测法、生物化学、免疫化学、组　织化学及分子生物学方法来进行定性、定量研究．　４．１　形态学特征研究方法　检测细胞凋亡的方法种类很多，形态学是鉴定　细胞凋亡的最可靠的方法，简便而适用．　４．１．１　光学显微镜　观察细胞形态特征，如细胞缩小、核质固缩聚　集、形成小体及吞噬现象等．但一般只能作细胞凋　亡的推测，不具有诊断价值，因为在光镜下某些类　型的细胞坏死（如凝固性坏死）与细胞凋亡的形态　相似，难于区别．　４．１．２　荧光显微镜　胞膜完整的活细胞对阳离子染料如台盼蓝、碘　化丙咤（ＰＩ）、溴化乙锭Ｅ（Ｂ）、氨基放线菌素　Ｄ（７ＡＡＤ）等有拒染能力，但坏死细胞（包括凋亡后　期的继发性坏死细胞、机械损伤细胞等）可被上述　染料标记　．细胞凋亡的早期细胞膜虽然尚完整，　但可出现细胞膜转运功能一过性的损失，这个阶段　凋亡细胞与正常活细胞相比，可对上述几种染料的　摄取量增加，但又不如凋亡后期细胞那样明显或深　染，此时结合其他方法，可较好地区分早期或晚期　缺点：１）只能定性，不能定量．２）标本处理过　程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求　较高，不适于大批标本检测．３）在组织切片上进行　电镜观察时，有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相　鉴别，因为两种情况下都可出现染色质浓聚．如同　时进行荧光染色，可弥补电镜检查的不足．　４．１．４　激光共聚焦显微镜　激光共聚焦显微镜是２０世纪８Ｏ年代发展起　来的新型仪器，它在荧光显微镜基础上加装了激光　扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光　或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部　微细结构的荧光图像．在细胞凋亡研究方面，借助　激光共聚焦显微镜可以更清楚地观察到细胞内部　的结构，对凋亡细胞固缩染色质和核碎片进行定　位，借助荧光标记还可以了解凋亡细胞内部的信号　转导，实时检测细胞内环境的各种动态变化．　４．２　生物化学特征研究方法　生物化学特征检测法检测细胞凋亡的依据是：　在细胞凋亡过程中，染色质ＤＮＡ在核酸内切酶的　作用下，于核小体之间被切断，从而形成以１８０～　２００　ｂｐ为基本单位、长度不一的一系列寡核苷酸　片段．　４．２．１　琼脂糖凝胶电泳法　琼脂糖凝胶电泳法是最早用于研究Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　生物化学变化特征的方法．通过琼脂凝胶电泳的典　型ＤＮＡ梯形谱可检测凋亡．而且这种方法不能提　供单个细胞或相关细胞的组织学定位或细胞分化　等凋亡信息．目前该方法已经逐渐被新的方法所取　代．此方法是判断细胞有无凋亡发生的一种简便方　法，比较适用于体外培养的非增殖性细胞的检测．　细胞经处理后，采用常规方法分离提纯ＤＮＡ　后，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色．琼脂糖　凝胶电泳法常规是以苯酚氯仿对１８０—２００　ｂｐ的　单位或１８０～２００　ｂｐ倍数的ＤＮＡ寡聚体进行去组　蛋白纯化，将纯化后的双链ＮＤＡ片段点样于含有　溴化乙锭（ＥＢ）的１．５％～１．８％琼脂糖凝胶电泳　中直接进行电泳分析．在凋亡细胞群中可以观察到　４２　北华大学学报（自然科学版）　第１０卷　典型的呈特征性的“梯状”电泳图谱．　缺点：１）特异性较差，特征性的１８０～２００　ｐｂ　抗体．除免疫组化外，也可用免疫细胞化学、　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ及ＥＬＩＳＡ等方法检测Ｃａｓｐｓａｓｅ，测定　早期和晚期细胞凋亡．　４．２．４　流式细胞仪检测法（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）　ＤＮＡ梯带的出现并非凋亡所独有，另外，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ＤＮＡ链断裂包括单链和双链的断裂，当单链断裂　时不出现典型的ＤＮＡ梯形谱．２）不能提供单个细　胞或相关细胞的组织学定位或细胞分化等凋亡信　息．３）不能进行准确定量，只能进行半定量．４）灵　敏性较差．５）适用于只含有单一细胞成分标本的　测定，对组织细胞组成复杂者，不能确定凋亡发生　细胞凋亡的流式细胞仪检测法是一种可以对　单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析与分　选，是定量检测细胞凋亡的重要方法．用ＦＣＭ检测　凋亡细胞时，必须用荧光染料对细胞进行染色，并　要求细胞呈悬浮状态．它能进行细胞ＤＮＡ，ＲＮＡ含　于哪类细胞．　４．２．２　原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ法）　原位末端标记法是细胞凋亡时ＤＮＡ裂解，在　内源性核酸内切酶的作用下，在核小体单位间被随　机切断，形成１８０～２００　ｂｐ核小体ＤＮＡ多聚，ＤＮＡ　双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系　列ＤＮＡ的３’一ＯＨ末端，可在脱氧核糖核苷酸末端　转移酶（ＴＤＴ）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光　素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍　生物标记到ＤＮＡ的３’一末端，从而可进行凋亡细　胞的检测．通常采用的有两种方法：一种是末端脱　氧核糖核酸转移酶介导的ｄＵＴＰ缺口末端标记法；　一种是ＤＮＡ聚合酶或Ｋｌｅｎｏｗ大片段介导的原位　缺口平移法（Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ＩＳＮＬ）．　ＴＵＮＥＬ实验可以在培养细胞、石蜡包埋或冰　冻切片上进行，因此，具有较好的定位作用．此法既　可定性，又能定量，还可动态观察凋亡细胞超微结　构的变化．只要凋亡的细胞ＤＮＡ中有一定量的断　裂点形成，就可以出现阳性反应，因此敏感性较高．　但也存在假阳性问题．缺点是实验方法复杂、费时，　每次只能处理少量样本．这种方法实质上是分子生　物学和形态学相结合的研究方法，已广泛用于心肌　细胞凋亡研究中．　４．２．３　免疫法　１）ＥＬＩＳＡ检测法：此法主要是测定核小体．根　据细胞凋亡时ＤＮＡ断裂后产生的各核苷酸小体与　核组蛋白Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３Ｈ紧密结合成复合物，基　于定量问接酶标免疫鉴定原理，利用抗ＤＮＡ的单　克隆和抗组蛋白抗体进行检测的方法．目前也有开　发的检测试剂盒出售．该法敏感性高，不需特殊仪　器，不需提取ＤＮＡ，适合基层工作单位使用，但不　能精确测定凋亡细胞的绝对量．　２）活性Ｃａｓｐｓａｓｅ免疫组化检测：Ｃａｓｐｓａｓｅ为　ＩＣＦ／Ｃｅｄ一３家族的统称，直接参与凋亡的早期启　动、信号转导及凋亡晚期事件，因而检测激活的　Ｃａｓｐｓａｓｅ可反映细胞凋亡，用于特异性检测的系列　量分析、细胞周期分析、细胞表面标志分析及细胞　受体分析等，但对样品处理要求较高．　基本原理：细胞出现凋亡时，在细胞学上发生　一系列特征性改变，如细胞周期停滞、ＤＮＡ梯度降　解、细胞膜通透性增加及细胞ＤＮＡ和蛋白质含量　降低等，通过在代谢、生物化学及分子水平对凋亡　细胞单一或多种成分的识别，可以定量检测出凋亡　细胞的数量．　５　缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡　的防治　细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的一个重要　特征，细胞凋亡的多少决定着缺血再灌注心肌损伤　的严重程度．有效抑制细胞凋亡的发生和发展，是　促进缺血再灌注后心功能恢复和减轻心肌致死性　损伤的一条重要途径．　目前，在心肌缺血再灌注过程中防治细胞凋亡　发生的措施包括：消除诱发细胞凋亡的因素、切断　细胞凋亡信号转导途径、提高心肌细胞内源性保护　机制和瓦解细胞凋亡信号．由于心肌缺血再灌注过　程中细胞凋亡的发生是多因素和多途径的，所以阻　断细胞凋亡级联反应中的关键环节和抑制参与多　信号途径的介质是防治细胞凋亡的最有效方法．　５．１　药理干预　Ｃａｇｌｉ等　在缺血前１０　ｒａｉｎ用咖啡酸苯乙基　酯预处理结扎左前降支鼠的缺血再灌注模型，缺血　３０　ｍｉｎ再灌注１２０　ｍｉｎ后检测ＤＮＡ末端转移酶介　导的缺口末端标记的阳性心肌细胞，缺血再灌注、　缺血再灌注＋咖啡酸苯乙基酯、缺血再灌注＋谷胱　甘肽组分别为６０％，３０％，４０％，并且缺血再灌注　＋咖啡酸苯乙基酯组具有明显减低一氧化氮的生　成，增加超氧化物歧化酶的活性，降低血清肌酸激　酶、天冬氨酸氨基转移酶的水平．Ｏｎｏ等　用ＴＡＴ－　四氢生物蝶呤预处理鼠心离体再灌注模型后发现，　四氢生物蝶呤组Ｃａｓｐｓａｓｅ一３的表达和细胞凋亡数　均明显下降，ＴＡＴ．四氢生物蝶呤通过抗细胞凋亡　第１期　孙宇，等：细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究　４３　减轻ＭＩＲＩ，可能成为心脏外科心肌保护的一个新　的治疗因素．　５．２　缺血预适应　在心脏功能恶化中起到了重要的作用．心肌细胞的　凋亡一方面造成了心肌工作细胞数目的减少，另一　方面凋亡后的心肌广泛纤维化有可能导致心肌重　塑和恶性心律失常的发生．细胞凋亡是通过多条信　缺血预适应是近年研究热点之一，缺血预处理　（ｉｓｅｈｅｍｉｃ　ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ＩＰＣ）具有抑制缺血再灌　号转导通路启动的细胞自杀过程，是维持机体自身　稳定的一种重要机制．在心肌缺血再灌注损伤中，　细胞凋亡同样具有这一方面的意义．但是，细胞凋　亡过度则可加重心肌组织的破坏，因此，细胞凋亡　在心肌缺血再灌注损伤过程中具有一定的病理学　注心肌细胞凋亡的作用．ＩＰＣ抑制细胞凋亡的机制　与激活ＰＫＣ和减轻缺血期细胞内酸化有关．此外，　ＩＰＣ还可通过减轻炎症细胞与内皮细胞的相互作　用抑制Ｂａｘ在缺血区的表达　彤Ｊ、减少线粒体　ＣｙｔｏＣ释放和抑制半胧天冬酶的活性而减少细胞　凋亡的发生　．Ｎａｋａｍｕｒａ等　提出，缺血预适应　通过抑制中性白细胞积聚和下调Ｂａｘ表达而减少　心肌细胞凋亡．　５．３　热休克预处理　石永忠等　。。报道，热休克预处理增加热休克　蛋白的表达，并且阻断线粒体和死亡受体途径，具　有明显的抗缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡的　作用．　５．４　基因治疗　利用转基因技术可以从各个环节对缺血再灌　注引起的细胞凋亡进行阻断．Ｈｕａ等　副转染Ａｄ５一　ｄｎＭｙＤ８８到鼠心肌３　ｄ后，进行缺血４５　ｍｉｎ再灌注　４ｈ，并与对照组相比，发现核因子ＫＢ的活性下降　５０％，Ｂｃ１．２水平上升８１％，缺血再灌注后的心肌　细胞凋亡显著降低５９％．Ｈｕａｎｇ等　在大鼠缺血　再灌注４　ｄ前以腺病毒为载体将Ｂｃｌ—ｘＬ基因转入　大鼠心脏，发现转入Ｂｃｌ—ｘＬ的大鼠缺血再灌注后　心肌细胞凋亡较对照组明显减轻，并减小梗死面　积，降低血浆肌酸激酶水平．　５．５　中药对心肌缺血再灌注损伤诱发细胞凋亡　的抑制作用　国内大量研究表明，中药及提取成分具有良好　的抑制心肌细胞凋亡的作用，如丹参、川芎嗪、黄　芪、葛根素等．有实验研究，丹参注射液是通过抑制　心肌细胞凋亡等作用起到保护心肌缺血再灌注损　伤的　Ｊ．李庆林等　¨通过实验发现，金丝桃苷能　明显降低缺血再灌注时的细胞凋亡率．黄芪因具有　抗自由基、拮抗钙超载、改善内皮功能等多种作用，　目前被应用于心肌缺血再灌注损伤并取得显著疗　效，但其对再灌注损伤诱发的细胞凋亡的影响在国　内未见报道，需进一步实验研究．　６　结束语　心肌细胞凋亡是正常心肌组织生长的特征之　一．但是，发生在心肌病理状态下的心肌细胞凋亡　意义．　综上所述，缺血再灌注组织发生细胞凋亡的机　制是一个多因素的过程．细胞凋亡是缺血再灌注损　伤的特征性改变，细胞凋亡的多少决定着缺血再灌　注损伤的轻重．现在对心肌缺血再灌注引起细胞凋　亡的确切机制尚未阐明，对抗心肌细胞凋亡的治疗　也大多处于动物试验阶段，特别是基因治疗离临床　应用还有一段距离．抗氧自由基及钙离子拮抗剂的　许多试验结果并不一致，以致难以真正的应用于临　床实践．这就需要人们更深入地研究启动再灌注期　心肌细胞凋亡程序的各种刺激因素及其介导的细　胞分子活动，努力寻求阻断细胞凋亡信号或其转导　通路的合理方法．随着分子生物学、免疫学等基础　医学及临床医学的深入发展，对细胞凋亡、基因调　控、信号转导、细胞保护等方面的认识和研究都在　逐步提高和深化，对心肌缺血再灌注引起的细胞凋　亡的机制和防治正待取得真正的突破．　凋亡是细胞控制生与死的手段．研究凋亡不仅　能够提高对疾病，包括心血管疾病的认识，获得医　学上新的治疗方案，而且能够加深对生命本质的理　解，具有极其重要的生物学和哲学意义．　参考文献：．　［１］Ｚｈａｏ　Ｚ　Ｑ，Ｖｉｎｔｅｎ　Ｊｏｈａｎｓｅｎ．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２００２，５５（３）：４３８４５５．　［２］杨彦玲，师养荣，李建龙，等．心肌缺血再灌注损伤研　究进展［Ｊ］．心血管病学进展，２００３，２４（２）：６１１－６１６．　［３］Ｌｏｅｋｓｈｉｎ　Ｒ　Ａ，Ｗｉｌｌｉｍａｓ　Ｃ　Ｍ．Ｐｒｏｇｒａｍｎａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｉ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｓｅｇｍｅｎｔａｌ　Ｍｕｓｃｌｅｓ　ｏｆ　ｈｔｅ　Ｐｅｍｒｔｉ　Ｓｉｌｋｍｏｈｔ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９６５，１１：１２３—１３３．　［４］Ｋｅｒｒ　Ｊ　Ｆ，Ｗｙｌｌｉｅ　Ａ　Ｈ，Ｃｕｒｒｉｅ　Ａ　Ｒ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ａ　Ｂａｓｉｃ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｗｉｄｅ—ｒａｎｇｉｎｇ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９７２，２６（４）：２３９—２５７．　［５］刘士廉，郑德先．细胞凋亡及其基因调控［Ｊ］．基础医　学与临床，１９９４，１４（３）：１－４．　『６］Ｍａｌｌａｔ　Ｚ，Ｔｅｄｇｕｉ　Ａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｅ华大学学报（自然科学版）　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ａｔｈｅｒｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］　Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，２００１　８８：９９８—１００３．　第１０卷　报：医学版，２００４，２９（５）：５０９—５１２　［２１］Ｎａｋｍａｕｒａ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｎ　Ｐ，Ｚｈａｏ　Ｚ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｃｏｎ—　ｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　Ｂａｘ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰＭＮ　Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　［７］赵燕．茶多酚在体外诱导ＨＬ－６０细胞的凋亡［Ｊ］．中国　病理生理杂志，１９９９，１５（３）：４６２－４６５．　［８］Ｅｎｇｌｅｒ　Ｒ　Ｌ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　Ａ　Ｒ，Ｂｕｒｌｅｓｉｎ　Ｋ　０，ｅｔ　ａ１．Ｍｙｏｃｙｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ｂｙ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｒｅｐｅｆｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９３，８８（ｓｕｐｐⅡ）：１—５．　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ　Ｒａｔ　Ｈｅａｒｔ［Ｊ］．　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，４５（３）：６６１－６７０．　［２２］Ｘｉｅ　Ｚ，Ｋｏｙａｍａ　Ｔ，Ｓｕｚｕｋｉ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｒｏｎａｒｙ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂｃｌ一２　ａｎｄ　［９］Ｚ　Ｌｉ，Ｏ　Ｈ　Ｂｉｎｇ，Ｘ　Ｌｏｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　Ｂａｘ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｐｎ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｈｅａｒｔ　Ｆａｉｌｕｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　Ｒａｔ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１　９９７，　２７２：２３１３—２３１９．　［１０］Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　Ｒ　Ａ，Ｂｕｒｌｅｓｏｎ　Ｋ　Ｏ，Ｋｌｏｎｅｒ　Ｒ　Ａ，ｅｔ　ａ１．　Ｒｅｐｅｆｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　Ｉｎｄｕｃｅｓ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｒａｂｂｉｔ　Ｃａｒｄｉｏ—　ｍｙｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，１９９４，９４（１０）：１６２１—１６２８．　［１　１］Ｆｌｉｓｓ　Ｈ，Ｇａｔｔｉｎｇｅｒ　Ｄ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅｐｅｒ—　ｆｕｓｅｄ　Ｒａｔ　Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，１９９６，７９（５）：９４９—　９５６．　［１２］Ｃｈａｋｒａｂａｔｒｉ　Ｓ，Ｈｏｑｕｅ　Ａ　Ｎ，Ｋａｒｍａｚｙｎ　Ｍ．Ａ　Ｒａｐｉｄ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ—ｉｎｄｕｃｅｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　Ｒａｔ　Ｈｅａｒｔｓ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｓｏｄｉｕｍ—ｈｙｄｒｏｇｅｎｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＨＯＥ　６４２（ｃａｒｉｐｏｆｉｄｅ）［Ｊ］．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ，　１９９７，２９（１　１）：３１６９—３１７４．　［１３］姚震，焦解歌，冯建章．心肌缺血再灌注损伤与细胞　凋亡关系的实验研究［Ｊ］．海南医学院学报，２０００，　６（３）：１２９—１３３．　［１４］赵明中，陈运贞．大鼠实验性心肌缺血再灌注时细胞　凋亡的动态变化及意义ｆ　Ｊ］．基础医学与临床，２０００，　２０（１）：５２—５５．　［１５］Ｂａｒｄａｌｅｓ　Ｒ　Ｈ，Ｈａｉｌｅｙ　Ｌ　Ｓ，Ｘｉｅ　Ｓ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｄｅｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅａｒｌｙ　Ａｃｕｔｅ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，１９９６，１４９（３）：　８４５—８５２．　［１６］Ｗａｎｇ　Ｑ　Ｄ，Ｐｅｒｎｏｗ　Ｊ，Ｓｊｏｑｕｉｓｔ　Ｐ　０，ｅｔ　．Ｐｈａｒｍａ—　ｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｍｖ（￣ｃａｒｄｉａｌ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，　５５（１）：２５—３７．　［１７］Ｚｈａｏ　ｚ　Ｑ，Ｎａｋｍａｕｒａ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｎ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｌａｔｅ　Ｐｈａｓｅ　ｏｆ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２００１，６：２７９—２９０．　［１８］Ｚｈａｏ　Ｚ　Ｑ，Ｍｏｒｒｉｓ　Ｃ　Ｄ，Ｂｕｄｄｅ　Ｊ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗｉｔｈ　Ａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｈｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｄｕｃｅｓ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｐｒｏｖｅｓ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ，Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　［Ｊ］．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１，１０４（ｓｕｐｐ）：１１．　［１９］Ｋａｊｓｔｕｒａ　Ｊ，Ｃｈｅｎｇ　Ｗ，Ｒｅｉｓｓ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ａｎｄ　Ｎｅｃｒｏｔｉｃ　Ｍｙｏｃｙｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈｅｓ　ａｒｅ　Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ　Ｖａｒｉａｂｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｔｆａｒｃｔ　Ｓｉｚｅ　ｉｎ　Ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ，１９９６，７４（１）：８６—１０７．　［２Ｏ］石永忠，肖卫民，蒋碧梅，等．热休克预处理抑制缺血一　再灌注所致心肌细胞凋亡及其机制［Ｊ］．中南大学学　Ｈｅａｒｔ　Ｊ，２００１，４２（６）：７５９－７７０．　［２３］齐丽彤，张钧华，李大元，等．血管紧张素ⅡＩ型受体　阻断剂抑制大鼠缺血一再灌注模型心肌细胞凋亡［Ｊ］．　中华心血管病杂志，２００１，２９（２）：１１８－１２１．　［２４］Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ　Ｌ　Ａ，Ｍｏｉｓｓａｃ　Ｄ．Ｔｈｅ　ｂｃｌ一２　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅｖｅｎｔｓ　Ｐｒｏｇｒａｍｎ￣Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ｏｆ　Ｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒ　Ｍｙｃｃｙｔｅｓ［Ｊ］．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９７，９６：１５８０—１５８５．　［２５］彭黎明，王曾礼．细胞凋亡的基础与临床［Ｍ］．北京：　人民卫生出版社，２０００：３６９—３７０．　［２６］赵明中，陈运贞，李媛媛，等．大鼠心肌缺血／再灌注　损伤心肌细胞凋亡与Ｆａｓ、Ｆａｓ—Ｌ基因表达的变　化［Ｊ］．中华心血管病杂志，２００１，２９（１０）：６０５－６０８．　［２７］Ｙａｎｉｖ　Ｇ，Ｓｈｉｌｋｒｕｔ　Ｍ，Ｌｏｔａｎ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ　Ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｒａｔ　Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　Ｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｔｏ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆａｓ（ＣＤ９５／Ａｐｏ一１）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｆａｓ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｈｙｐｏｘｉｃ　Ｍｙｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，５４（３）：６１１－６２３．　［２８］Ｂａｅｕｅｒｉｅ　Ｐ　Ａ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　Ｄ．ＮＦ—ｋａｐｐａ　Ｂ：Ｔｅｎ　Ｙｅａｒｓ　Ａｆｔｅｒ『Ｊ１．Ｃｅｌｌ，１９９６，８７（Ｉ）：１３—２０．　［２９］Ｍｉｒａｋｉａｎ　Ｒ，Ｎｙｅ　Ｋ，Ｐａｌａｚｚｏ　Ｆ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，２６５：１６１—１７５．　［３０］厦天，蒋春笋，李林江，等．呼吸代谢控制在Ｃａｓｐａｓｅ一３　对线粒体凋亡信号正反馈作用中的机制和意义［Ｊ］．　科学通报，２００１，４６（２１）：１７９１—１７９６．　［３１］曾志勇，王志农，何斌，等．猫体外循环时心肌　ｃａｓｐａｓｅ一３　ｍＲＮＡ表达的变化［Ｊ］．第二军医大学学　报，２００４，２５（４）：３８３—３８５．　［３２］徐强，司良毅，张红．大鼠心肌再灌注不同时相　ｃａｓｐａｓｅ一３激活与心功能变化的关系［Ｊ］．第三军医大　学学报，２００５，２７（２３）：２３３８－２３４０．　『３３］Ｋｕｒｔ　Ｍ　Ｉ　．Ｂｒｉａｎ　Ｌ，Ｌａｎ　Ｙ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ａｎｄ　Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＨＳＰ６０　ａｎｄ　ＨＳＰ１０　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｍｙｏｅｙｔｅｓ　Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｓ　Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈｓ　ｉｎ　Ｃｌｕｔｅｄ　ｂｙ　Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ　Ｒｅｎｘｙ　Ｇｅｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１，１０３　（１３）：１７８７—１７９２．　『３４］Ｒｕｓｓｅｌｌ　Ｒ，Ｐｈ　Ｄ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ａｎ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇ　Ｊ．『Ｍｅｄ，１９９９，３４０：１１５—１２６．　［３５］郭来敬，张志仁，陈东辉，等．电子顺磁共振检测心肌　缺ｍ再灌注产生的氧自由基及其保护的实验研究［Ｊ］．　心肺血管病杂志，２０００，１９（１）：８５—８８．　第１期　‘孙宇，等：细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究　２２３＿２５４．　４５　［３６］Ｈａｕｎｓｔｅｔｔｅｒ　Ａ，Ｉｚｕｍｏ　Ｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，１９９８，８２：１１１１—１１２９．　［５Ｏ］Ｗｅｅｄｏｎ　Ｄ，Ｓｅａｒｌｅ　Ｊ，Ｋｅｒｒ　Ｊ　Ｆ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ｉｔｓ　Ｎａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｄｅｒｍａ—　ｔｏｐａｔｈｏｌ，１９７９，１（２）：１３３—１４４．　［３７］Ｄｕｉｌｉｏ　Ｃ，Ａｎｌｂｒｏｓｉｏ　Ｇ，Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ａｒｅ　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　Ｏ２　Ｒａｄｉｃａｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　［５１］Ｈａｍａｔｋａｅ　Ｍ，Ｉｕｇｅｈｉ　Ｋ，Ｈｉｍａｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｚｉｎｃ　Ｉｎｄｕｃｅｓ　Ｍｉｘｅｄ　Ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ，Ｎｅｃｒｏｓｉｓ，ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ａｆｔｅｒ　Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｈｅａｒｔ　Ｃｉｒｃ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，２８０：２６４９—２６５７．　ｍｏｌｔ４－　Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｅｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ），２０００，１２８（６）：　９３３－９３９．　．　［３８］邓耀祖，曲伸．医学分子细胞生物学［Ｍ］．北京：科学　出版社，２００２：４９４．　［５２］Ｃａｇｌｉ　Ｋ，Ｂａｇｃｉ　Ｃ，Ｇｕｌｅｃ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｃａｆｆｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ　Ｅｓｔｅｒ　ｏｎ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ—　［３９］Ｆｌｉｓｓ　Ｈ．Ａｃｃｅｌ　ｃｒａｔｅｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ　Ｍｙｏｃａｒ—　ｄｉｏｍ：Ｆｒｉｅｎｄ　ｏｒ　Ｆｏｅ［Ｊ］．Ｂａｓｉｃ　Ｒｅｓ　Ｃａｒｄｉｏｌ，１９９８，９３：　９０－９３．　［４０］Ａｎｌｂｒｏｓｉｏ　Ｇ，Ｚｗｅｉｅｒ　Ｊ　Ｌ，Ｂｅｅｋｅｒ　Ｌ　Ｃ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｉｓ　Ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ　ｂｙ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｉｎ　Ｄｏｇｓ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂａｓｉｃ　Ｒｅｓ　Ｃａｒｄｉｏｌ，１９９８，９３：９４－９６．　［４１］Ｇａｌａｎｇ　Ｎ，Ｓａｓａｋｉ　Ｈ，Ｍａｕｌｉｋ　Ｎ．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　Ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０Ｏ０，１４８：１１１—１１８．　［４２］Ｈａｙａｓｈｉ　Ａ，Ｉｔｏ　Ｈ，Ｓｈｏｍｏｒｉ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ　Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ａｃｕｔｅ　Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｒｆａｔｅｄ　Ｒａｔ　Ｌｉｖｅｒ［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｌ　Ｉｎｔ，１９９７，４７（８）：５１８－５２４．　［４３］Ｋｏｗａｌｔｏｗｓｋｉ　Ａ　Ｊ，Ｖｅｒｅｅｓｉ　Ａ　Ｅ．Ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ　Ｄａｍａｇｅ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　Ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ，１９９９，２６：４６３４７１．　［４４］Ｍａｚｉｅｒｅ　Ｃ，Ｃｏｎｔｅ　Ｍ　Ａ，Ｄｅｇｏｎｖｉｌｌｅ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ　Ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｎ　Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　Ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ＡＰＩ　ａｎｄ　ＮＦｋａｐｐａ　Ｂ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９，２６５：１　１６—１２２．　［４５］Ｈｏｆｆｍａｎ　Ｊ　ｗ　Ｊｒ，Ｇｉｌｂｅｒｔ　Ｔ　Ｂ，Ｐｏｓｔｏｎ　Ｒ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｒｅｐｅｆｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ：Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｔｒａ　Ｃｏｒｐｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏ，２００４，３６（４）：　３９ｌ－４１１．　［４６］徐世安，朱兵，陈晓慨，等．大鼠心肌缺血再灌注损伤　中肿瘤坏死因子的实验研究［Ｊ］．中国医科大学学报，　２００３，３２（２）：４８８－４９２．　［４７］李拥军，丁文惠．肿瘤坏死因子、缺血再灌注损伤和　心肌细胞凋亡［Ｊ］．中国循环杂志，２００２，１７（５）：７９３—　７９４．　［４８］Ｆｒａｎｇｉｏｇｉａｎｎｉｓ　Ｎ　Ｆ，Ｌｉｎｄｓｅｙ　Ｍ　Ｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｌ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．　Ｒｅｓｉｄｅｎｔ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｍａｓｔ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｅ　ａｎｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　Ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ　ＴＮＦａ，Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｃａｓｅ　ｉｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃａｎｉｎｅ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９８，９８：６９９—７１０．　［４９］Ａｒｅｎｄｓ　Ｍ　Ｊ，Ｗｖｌｌｉｅ　Ａ　Ｈ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｒｅｖ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ，１９９１，３２：　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　Ｒａｔｓ［Ｊ］．　Ａｎｎ　Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ　Ｓｃｉ，２００５，３５（４）：４４Ｏ－４４８．　［５３］Ｏｎｏ　Ｍ，Ｓａｗａ　Ｙ，Ｒｙｕｇｏ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．ＢＨ４　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ｆｒｏｍ　Ｂｃｌ—ｘＬ　Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　Ｔｈｏｒｏｕｇｈ　Ａｎｔｉ—ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｉｎ　Ｒａｔ　Ｈｅａｒｔｓ［Ｊ］．　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ　Ｓｕｒｇ，２００５，２７（１）：１１７—１２１．　［５４］Ｔｈｏｕｒａｎｉ　Ｈ　Ｖ，Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｍ，Ｄｕａｒｔｅ　Ｉ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ　Ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ　Ｃｏｒｏｎａｒｙ　Ａｒｔｅｒｙ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｌａ　Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　Ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ　Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｃｏｒｏｎａｒｙ　Ａｒｔｅｒｙ　ｂｙ　Ｐａｓｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｔｈｏｒａｅ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｅ　Ｓｕｒｇ，１９９９，１　１７：３８３—３８９．　［５５］Ｎａｋｍａｕｒａ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｎ　Ｐ，Ｚｈａｏ　Ｚ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｃｏｎｄｉ—　ｔｉｎｎｉｎｇ　Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　Ｂａｘ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰＭＮ　Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ　Ｒａｔ　Ｈｅａｒｔ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｅ　Ｒｅｓ，２０００，４５：６６１—６７０．　．　［５６］Ｘｕ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｈｉｒａｉ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，２８０：８９９－９０８．　［５７］Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｎ　Ｐ，Ｚｈａｏ　Ｚ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｃｏｎｄｉ—　ｔｉｎｎｉｎｇ　Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　Ｂａｘ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰＭＮ　Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ　Ｒａｔ　Ｈｅａｒｔ（Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｒｅｓ，２０００，４５（３）：６６１－６７０．　［５８］Ｈ　ｎａ　Ｆ，Ｈａ　Ｔ，Ｍａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ＭｙＤ８８一　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐａｔｈｗａｙ　Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｔｈｅ　Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｆｒｏｍ　Ｉｓｅｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　Ｒａｔ　Ｈｅａｒｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００５，３３８（２）：１１１８—１１２５．　［５９］Ｈｕａｎｇ　Ｊ，Ｉｔｏ　Ｙ．Ｂｃｌ—ｘＬ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｔｈｅ　Ｈｅａｒｔ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００３，３１１（１）：６４－７０．　［６Ｏ］王晓霞，陈志强，龚玲玲，等．丹参注射液对大鼠心肌　．　缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡的影响［Ｊ］．临床心　血管病杂志，２００２，１８（８）：７８３－７８５．　［６１］李庆林，俞桂新，陈志武，等．金丝桃苷对大鼠心肌缺　血再灌注损伤的保护作用［Ｊ］．中国中药杂志，２００２，　３７：８２９—８３２．　【责任编辑：王坤】