*CN102269749A*
(10)申请公布号 CN 102269749 A(43)申请公布日 2011.12.07
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110165281.2(22)申请日 2011.06.17
(71)申请人上海雷允上科技发展有限公司
地址201401 上海市奉贤区航谊路320号申请人上海市中药研究所(72)发明人顾慧芬 庄意丽 张梦玲(74)专利代理机构上海光华专利事务所 31219
代理人许亦琳 余明伟(51)Int.Cl.
G01N 30/88(2006.01)G01N 30/06(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 10 页
(54)发明名称
一种猴头菌片中腺苷含量的检测方法(57)摘要
本发明属于中药领域，涉及一种HPLC测定猴头菌片中腺苷含量的方法。本发明用高效液相色谱法测定猴头菌片中腺苷含量的方法，以安捷伦ZORBAXSB-C18(5??m，4.6×250mm)为色谱柱，流动相为体积比(6:94)-(10:90)的甲醇和0.01%检测波长为UV-λ260nm，流速为乙酸水溶液，
1.0mL/min，柱温为25℃，且外标法定量。结果显示：腺苷在0.032~0.48??g范围内呈现出良好的线性关系；本测试方法的平均回收率为98.4％，相对标准偏差RSD为1.5％。本发明的高效液相色谱法测定猴头菌片中腺苷含量的方法简便、快速，测定结果准确可靠，可用于猴头菌片的辅助质量控制。CN 102269749 ACN 102269749 ACN 102269757 A
权 利 要 求 书
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1.一种猴头菌片中腺苷含量的检测方法，为采用高效液相色谱法HPLC定量检测猴头菌片中腺苷的含量，包括如下步骤：
(1)猴头菌片样品溶液的制备；(2)腺苷对照品溶液的制备；
(3)采用HPLC分别对猴头菌片样品溶液和腺苷对照品溶液进行测试，其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件：
a、流动相采用体积比为(6∶94)-(10∶90)的甲醇和0.01％乙酸水溶液；b、所用紫外检测器的检测波长为260nm；
(4)根据步骤(3)中获得的猴头菌片HPLC色谱图和腺苷对照品HPLC色谱图中腺苷的峰面积，按照外标法计算猴头菌片中腺苷的含量。
2.如权利要求1所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(3)的a中，所述流动相为体积比为(8∶92)-(9∶91)的甲醇和0.01％乙酸水溶液。
3.如权利要求1所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，HPLC色谱柱采用C18色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒度为5μm。
4.如权利要求1所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.0mL/min；色谱柱的柱温为25℃；进样量为10μL。
5.如权利要求1所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述猴头菌片样品溶液的制备，包括如下步骤：精密称取猴头菌片样品并溶于15％甲醇水溶液中，依次经超声提取、放冷后，称定重量，并用15％甲醇水溶液补足减失的重量，再将获得的溶液离心、过滤，取续滤液，用微孔滤膜滤过后得到所述猴头菌片样品溶液。
6.如权利要求5所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，所述猴头菌片样品溶液的浓度为10-40mg/mL。
7.如权利要求5所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，所述微孔滤膜的规格为0.45μm。
8.如权利要求1所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述腺苷标准品溶液的制备，包括如下步骤：精密称取恒重的腺苷对照品，置于量瓶中，加15％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得到腺苷对照品溶液。
9.如权利要求8所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法，其特征在于，所述腺苷对照品溶液中腺苷的质量浓度为3.2-48μg/ml。
10.如权利要求1-9任一所述的猴头菌片中腺苷含量的检测方法用于猴头菌片质量的检测标准中或用于猴头菌片的辅助质量控制中。
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说 明 书
一种猴头菌片中腺苷含量的检测方法
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技术领域
[0001]
本发明属于中药领域，具体涉及一种HPLC测定猴头菌片中腺苷含量的方法。
背景技术
猴头菌片是采用与猴头菌(Hericium ermaceus(Bull.)Pers)有效成分相一致的猴头菌菌丝体提取物制成的制剂。猴头菌片具有益气补血、扶正培本、养胃护胃的作用，临床上常用于治疗胃溃疡、十二指肠溃疡及慢性胃炎等，对多种消化道疾病均有较好的疗效。[0003] 猴头菌片的药效是各组成成分复杂的综合作用，其所含的多糖、多肽类、氨基酸等物质，具有免疫调理、抗肿瘤、保护胃肠道等作用。猴头菌丝体中含有较高含量的腺苷。腺苷具有广阔的生理活性，包括镇静、扩血管、抗缺氧及较弱的抗炎、降胆固醇等作用。[0004] 现用标准主要是以多糖为质量标准，在猴头菌片生产过程中由于辅料的加入干扰多糖含量的准确性，所以研究腺苷含量指标作为一个复合的分析指标具有较大意义。
[0002]
发明内容
本发明的目的在于提供一种HPLC(高效液相色谱法)测定猴头菌片中腺苷含量的方法，以克服现有技术中的不足。[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案来实现：[0007] 一种猴头菌片中腺苷含量的检测方法，为采用高效液相色谱法HPLC定量检测猴头菌片中腺苷的含量，包括如下步骤：[0008] (1)猴头菌片样品溶液的制备；[0009] (2)腺苷对照品溶液的制备；
[0010] (3)采用HPLC分别对猴头菌片样品溶液和腺苷对照品溶液进行测试，其中，采用HPLC进行测试包括如下色谱条件：[0011] a、流动相采用体积比为(6∶94)-(10∶90)的甲醇和0.01％乙酸水溶液(体积百分含量)；[0012] b、所用紫外检测器的检测波长为260nm；
[0013] (4)根据步骤(3)中获得的猴头菌片HPLC色谱图和腺苷对照品HPLC色谱图中腺苷的峰面积，按照外标法计算猴头菌片中腺苷的含量。[0014] 较佳的，步骤(3)的a中，所述流动相为体积比为(8∶92)-(9∶91)的甲醇和0.01％乙酸水溶液。[0015] 较佳的，HPLC色谱柱采用C18色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒度为5μm。
[0016] 较佳的，所述流动相的流速为1.0mL/min；色谱柱的柱温为25℃；进样量优选为10μL。
[0017] 较佳的，步骤(1)中，所述猴头菌片样品溶液的制备，包括如下步骤：精密称取猴头菌片样品并溶于15％甲醇水溶液中，依次经超声提取、放冷后，称定重量，并用15％甲醇
[0005]
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水溶液补足减失的重量，再将获得的溶液离心、过滤，取续滤液，用微孔滤膜滤过后得到所述猴头菌片样品溶液。[0018] 较佳的，所述猴头菌片样品溶液的浓度为10-40mg/mL。[0019] 优选的，所述猴头菌片样品溶液的浓度为20mg/mL。[0020] 较佳的，所述超声提取时间如30min；放冷至室温；所述离心时，离心的转数可以为3000转/分钟，离心时间5min；微孔滤膜的规格为0.45μm。[0021] 较佳的，步骤(2)中，所述腺苷对照品溶液的制备，包括如下步骤：精密称取恒重的腺苷对照品，置于量瓶中，加15％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得到腺苷对照品溶液。
[0022] 较佳的，所述腺苷对照品溶液中腺苷的质量浓度为3.2-48μg/ml。[0023] 优选的，所述腺苷对照品溶液中腺苷的质量浓度为16μg/ml。
[0024] 本发明用高效液相色谱法测定猴头菌片中腺苷含量的方法，以Agilent ZORBAXSB-C18(5μm，4.6mm×250mm)为色谱柱，流动相采用体积比为(6∶94)-(10∶90)的甲醇和0.01％乙酸水溶液，检测波长为UV-λ260nm，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，并采用外标法定量测定。结果显示：腺苷在0.032～0.48μg范围内呈现出良好的线性关系，且r＝0.99999；本测试方法的平均回收率为984％(n＝9)，相对标准偏差RSD为1.5％。本发明的高效液相色谱法测定猴头菌片中腺苷含量的方法简便、快速，测定结果准确可靠，可用于猴头菌片的辅助质量控制。而现有文献报道HPLC法测定腺苷含量方法很多，但用于本品测定，分离效果均不理想。附图说明
[0025] 图1实施例1中腺苷对照品的HPLC图谱[0026] 图2实施例1中猴头菌片样品的HPLC图谱[0027] 图3实施例1中阴性空白样品的HPLC图谱[0028] 图4实施例2中腺苷标准品的HPLC色谱图，流动相为6％(甲醇)-94％(0.01乙酸水溶液)
[0029] 图5实施例2中猴头菌片样品的HPLC色谱图，流动相为6％(甲醇)-94％(0.01乙酸水溶液)
[0030] 图6实施例2中腺苷标准品的HPLC色谱图，流动相为8％(甲醇)-92％(0.01乙酸水溶液)
[0031] 图7实施例2中猴头菌片样品的HPLC色谱图，流动相为8％(甲醇)-92％(0.01乙酸水溶液)
[0032] 图8实施例2中腺苷标准品的HPLC色谱图，流动相为9％(甲醇)-91％(0.01乙酸水溶液)
[0033] 图9实施例2中猴头菌片样品的HPLC色谱图，流动相为9％(甲醇)-91％(0.01乙酸水溶液)
[0034] 图10实施例2中腺苷标准品的HPLC色谱图，流动相为12％(甲醇)-88％(0.01乙酸水溶液)
[0035] 图11实施例2中猴头菌片样品的HPLC色谱图，流动相为12％(甲醇)-88％(0.01
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乙酸水溶液)
具体实施方式
[0036] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
[0038] 1仪器与试药
[0039] Agilent-1100高效液相色谱仪系统，配全自动进样器，CQ-6超声波清洗器(上海沪超超声波仪器有限公司)。甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；腺苷对照品(批号：110879-200202供含量测定用中国药品生物制品检定所)；猴头菌片(由上海雷允上药业有限公司提供，规格：0.26g/片，批号：08050102，08080101，08120101，09030701，09030701，09100102，10040802，10050302，10030501)。[0040] 2色谱条件[0041] 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：甲醇-0.01％乙酸(9∶91)；检测波长为：260nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；外标法定量。
[0042] 3方法与结果
[0043] 3.1供试品溶液的制备
[0044] 3.1.1猴头菌片样品溶液的制备[0045] 精密称取猴头菌片样品0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入15％甲醇水溶液(体积百分含量)25ml，称定重量，置超声波清洗器超声提取30min，放冷，称定重量，用15％甲醇水溶液补足减失的重量，3000转离心5min，过滤，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
[0046] 3.1.2阴性空白样品溶液的制备
[0047] 称取不含猴头菌菌丝体的阴性空白样品溶液，按照供试品溶液的制备方法制成阴性空白样品溶液。
[0048] 3.1.3腺苷对照品溶液的制备
[0049] 精密称取恒重的腺苷对照品10mg，置于25ml量瓶中，加15％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml置于25ml量瓶中，加15％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得16μg/ml的腺苷对照品溶液。
[0037]
3.2系统适用性试验[0051] 取腺苷对照品溶液、阴性空白溶液和猴头菌片样品溶液，分别在上述色谱条件下进样10μL，测绘HPLC图谱，结果见图1-图3，其中图1为腺苷对照品的HPLC图谱，图2为猴头菌片样品的HPLC图谱，图3为阴性空白样品的HPLC图谱。由图1-3可知，在对照品溶液和供猴头菌片样品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性空白样品在腺苷出峰时间区域没有干扰峰出现，故对腺苷的测定无干扰作用。[0052] 3.3线性关系的考察
[0053] 精密称取恒重的腺苷对照品10mg，置于25ml量瓶中，加15％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml置于25ml量瓶中，加15％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，
[0050]
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摇匀，即得16μg/mL的对照品溶液。将质量浓度为0.016mg/ml的腺苷标准品溶液采用HPLC分别进样2μL，5μL，8μL，10μL，15μL，30μL，以腺苷标准品进样量(μL)为横坐标(x)，以测定的腺苷峰面积积分值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。[0054] 回归方程为：y＝10.324x-1.2447，r＝0.999965。说明腺苷在0.032～0.48μg范围内呈现出良好的线性关系。[0055] 3.4精密度试验
[0056] 精密吸取腺苷对照品溶液5ul，在同一实验条件下，重复进样6次，测定腺苷峰面积积分值，结果腺苷的峰面积和保留时间(t)值基本不变，其标准偏差RSD值为1.7％。说明仪器性能良好。
[0057] 3.5重复性试验
[0058] 取同一批号猴头菌片样品6份，按上述“3.1.1猴头菌片样品溶液的制备”，制备成供试液，平行测定6次，结果RSD为0.85％(n＝6)，说明方法重现性良好。[0059] 3.6稳定性试验
[0060] 取同一批号猴头菌片供试样品1份，按上述“3.1.1猴头菌片样品溶液的制备”，制备成供试液，在常温下放置24h，每间隔2h测定1次，连续共测定7次，最后在24h时测定第8次，结果供试品平均峰面积变化不大，相对标准偏差RSD为1.2％，表明样品溶液中的腺苷，在24h内稳定性良好。[0061] 3.7回收率试验
[0062] 取已知含量的供试样品9份，分别加入一定量的腺苷对照品，混匀，按“3.1.1猴头菌片样品溶液的制备方法”，制备成供试液，在腺苷的线性范围内分别制成低、中、高3种不同浓度的溶液(每一种浓度3份)。分别进样，测定腺苷的回收率。结果见表1。[0063] 表1回收率测定结果
[0064]
3.8样品的含量测定
[0066] 精密称取猴头菌片供试样品0.5g，同“3.1.1猴头菌片样品溶液的制备方法”，制备成供试品溶液。另精密称取干燥至恒重的腺苷对照品适量，同3.1.3项操作制备对照品
[0065]
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溶液，按上述色谱条件进样10μL，记录腺苷峰面积，按外标法计算含量。结果见表2。[0067] 表2样品含量测定结果
[0068]
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
[0069]
批号 08050102 08080101 08120101 09030701 09030701 09100102 10040802 10050302 10030501
腺苷含量(mg/g) 0.1657 0.1867 0.1480 0.1854 0.1854 0.1496 0.2092 0.1481 0.1902
4讨论
[0071] 猴头菌片的药效是各组成成分复杂的综合作用，其含有多糖、氨基酸等物质，还含有较高含量的腺苷。现有文献报道HPLC法测定腺苷含量方法很多，但用于本品测定，分离效果均不理想。本研究根据腺苷为水溶性物质，且较稳定的性质，采用适当的提取分离方法，用高效液相色谱法测定猴头菌片中腺苷的含量，获得了满意的结果。
[0072] 研究猴头菌片腺苷含量指标与多糖一起成为产品复合式的质量分析指标，对提高产品质量指标及产品质量稳定性具有较大意义，为猴头菌片质量的提高及标准的完善提供依据。
[0073] 实施例2
[0070]
采用HPLC对猴头菌片样品和腺苷标准品中的腺苷含量进行对比测试，流动相中
甲醇和0.01％乙酸水溶液的体积比分别为6∶94、8∶92、9∶91、12∶88，其他实验条件与实施例1相同。
[0075] 经HPLC测试得到HPLC色图谱4-11，图4为腺苷标准品色谱图，且流动相为6％(甲醇)-94％(0.01乙酸水溶液)；图5为猴头菌片样品色谱图，且流动相为6％(甲醇)-94％(0.01乙酸水溶液)；图6为腺苷标准品色谱图，且流动相为8％(甲醇)-92％(0.01乙酸水溶液)；图7为猴头菌片样品色谱图，且流动相为8％(甲醇)-92％(0.01乙酸水溶液)；图8为腺苷标准品色谱图，且流动相为9％(甲醇)-91％(0.01乙酸水溶液)；图9为猴头菌片样品色谱图，且流动相为9％(甲醇)-91％(0.01乙酸水溶液)；图10为腺苷标准品色谱图，且流动相为12％(甲醇)-88％(0.01乙酸水溶液)；图11为猴头菌片
[0074]
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样品色谱图，且流动相为12％(甲醇)-88％(0.01乙酸水溶液)。[0076] 结果显示：实施例2采用流动相中甲醇和0.01％乙酸水溶液的体积比分别为6∶94、8∶92、9∶91时，其腺苷的保留时间、峰型以及腺苷与其他组分的分离度均很好，尤其甲醇和0.01％乙酸水溶液的体积比为8∶92时最佳；而甲醇和0.01％乙酸水溶液的体积比为12∶88时，其保留时间、峰型以及腺苷与其他组分的分离度均不好，因此采用HPLC对猴头菌片中腺苷含量的测试中，流动相中甲醇和0.01％乙酸水溶液的体积比控制在(6∶94)-(10∶90)，小于或大于此体积比均得不到理想的保留时间和峰型，且分离效果不理想，测试的准确性受到影响。
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