usp37---851分光光度法与光散射测定法

851分光光度法和光散射

紫外、可见光、红外、原子吸收、荧光、透射比浊法、散射比浊法和拉曼光谱测定法。

吸收分光光度法是测量一化学物质电磁辐射与分子或原子间相互作用的方法。其中常用于药物分析的技术包括紫外、可见光、红外和原子吸收光谱法。可见光区域的分光光度测量法过去称作比色法，然而，仅在涉及人类对色彩的感觉时，用“比色法”这个术语才更准确。

荧光分光光度法是对化学物质在暴露于紫外线、可见光或其它电磁辐射时所发射光线进行测量的方法。一般荧光溶液最大强度发射光的波长比激发光波长要长，通常大约20~30nm。

光散射是对由于溶液亚显微光密度不均一性导致的散射光进行测量的方法。在测量分子量在1000 到几亿相对分子量间的多分散系统的平均分子量时很有用。有两种这样的技术（透射比浊法和散射比浊法）应用于药物分析。

拉曼光谱法（非弹性光散射）是试样在强烈的单色光（通常是激光）照射下的光散射过程，从样品散射的光被用来分析频移。

用于这些测量方法的波长范围从紫外短波长一直延伸到红外波长。为了方便参考，这个光谱范围大致分为以下几个部分：紫外线（190~380nm）、可见光（380~780nm）、近红外光（780~3000nm）、红外光（2.5~40μm或4000~250cm-1）。

光谱应用范围比较

对于很多药品而言，在紫外线和可见光区域内的光谱测定比在近红外和红外光谱区域内测定的准确性和灵敏度更高。当在1cm吸收池内观察溶液时，浓度约10μg/mL的样品溶液经常在紫外可见光区域产生0.2-0.8的吸光度。而在红外和近红外区域，可能需要1-10mg/mL甚至100mg/mL的浓度才能产生足够的吸光度；在这些光谱范围内，池长度一般为0.01~3mm。

物质的紫外和可见光谱通常专属性不高，但适于做定量测定。此外，对于许多物质来说，可用作鉴别的辅助手段。

近红外光谱法在药物分析中的应用越来越多，尤其是对大量样品的快速鉴别以及水分测定。

近红外尤其适合-OH和-NH基团的测定，如乙醇中水的测定、胺类存在下的-OH测定、烃类中的醇的测定以及叔胺存在情况下伯胺和仲胺的测定。

红外光谱对除光学异构体外任意给定的化合物具有专属性，光学异构体的红外光谱完全相同。然而，某些固体化合物由于存在多晶型，会引起红外光谱差异。结构上微小的差异经常会导致光谱中的显著差异。由于在一个红外吸收图谱中有大量最大值，有时可不预先分离直接对已知各组分含量的混合物的单个组分进行定量检测。

虽然光谱强度取决于不同的分子特性，拉曼光谱和红外光谱可产生类似的数据。拉曼和红外光谱学对不同的功能基团显示不同的相对灵敏度，例如拉曼光谱对C-S和C-C多重键特别敏感，而一些芳香族化合物更容易通过拉曼光谱鉴别出来。水的红外吸收光谱很强，而拉曼光谱很弱。因此，水只有有限的红外“窗口”来检测物质的含水量，而其拉曼光谱几乎完全透明并可用于溶质的鉴别。拉曼光谱学的两个主要局限性，一是样品的最低检测

浓度一般为10-1M~10-2M，二是很多物质中的杂质能发出荧光干扰对拉曼散射信号的检测。

光反射测定法与透射测定法反映的光谱信息类似。由于反射测定法仅探测样品表面成分，从而消除了物质的光散射性质和光学厚度带来的困难。因此，在强吸光性物质上进行反射测定法经常会更简单。在红外反射测定中常用的一个技术是衰减全反射（ATR），也称为多重内反射（MIR）。在ATR技术中，红外光谱仪的光束通过适当的红外窗口物质进行传递（如KRS-5、TlBr-TlI低共熔混合物），它以这样的一个角度被切断：红外光束进入第一个（前）窗口表面，但当其碰撞到第二个（后）表面时完全反射（即光束的入射角在第二个窗口表面时超过了该材料的临界角）。通过适当材料的窗口，红外光束在穿过窗口前可形成许多内反射。如果样品放置于能完全反射红外光束的窗口上，则样品吸收了反射光，它的强度因而在每个波长（频率）处减弱。因此，与简单的反射相比，ATR技术通过红外光束在窗口数次反射可形成增强的反射光谱。ATR技术灵敏度高，但重现性差，如果不用内标物与每个供试样品紧密混合，该方法不是可靠的定量检测方法。

荧光分光光度法通常比吸收分光光度法更灵敏。在吸收测定法中，样品的透光度与空白作比较；低浓度时，两种溶液均产生高信号。相反，荧光光度法检测时，空白溶剂信号低。所以低浓度时，背景辐射对测定的干扰较小。然而很少化合物在低于10-5M浓度时能通过吸收光谱测定，在荧光分光光度法中不经常使用10-7~10-8M浓度的溶液。

理论和术语

辐射光束的能量随光束在吸收介质中行进距离的增加而减少，且随介质中的吸光性分子或离子的浓度增加而减少。这两个因素决定了总入射能量出现的比例。单色光辐射透过均一吸收介质时，其减少的能量可通过比尔定律进行定量计算，log10(1/T)=A=abc，式中

各术语定义定义如下：

吸光度（符号：A）以透光度（T）倒数取10为底的对数。（注：过去曾用光学密度、吸收率和消光系数表示。）

吸收系数（符号：a）吸光度（A）除以样品浓度（c），表述为g/L，和吸光光路长度（b，cm）的积得商。（注：不要与吸收指数、比消光系数和消光系数混淆）。

摩尔吸收系数（符号：ε）吸光度（A）除以样品浓度，表示为mol/L，和吸收光光路长度（cm）的积得商。这也是样品的吸收系数a和物质的分子量的积。

在大多数情况下，物质的吸收系数是常数，不依赖于入射光强度、吸收池内部长度和样品浓度，所以物质的浓度可通过分光光度法测定。

比尔定律没有给出温度、波长或溶剂类型的影响。因为对大多数分析工作来说，正常范围内温度波动的影响可以忽略不计。

比尔定律的偏差可由化学或仪器的变动引起。显然，以下因素引起的溶质分子之间的相互作用、离解、电离。其他偏差可能由多色辐射、狭缝宽度效应或散色光等诸多因素引起。

即使在某一固定的温度和溶剂的情况下，吸收系数也可能不是常数。然而，在定量分析中，吸光系统不一定要符合比尔定律的要求，只要样品中有一个成分吸光，则样品浓度可通过已有吸光成分的标准曲线对比确定。

虽然在严格意义上说，由于缺少池长度和样品浓度这样的量化指标，比尔定律在原子

吸收光谱中不成立，但如果用可重复吸收的灯，则基本上符合比尔定律。具体来说，透光率的负对数或吸光度与吸收系数呈正比，因此也与吸收原子数呈正比。在此基础上，标准曲线可按这样的要求建立，即能根据溶液中已知化合物的浓度来估算未知吸收值。

吸收光谱 表示吸光度或任何吸光度函数的图谱，按波长或波长函数绘制。

透光度（符号：T）透过样品的辐射能量除以样品入射能量的商（注：以前常用的术语包括透射比和透射度。）

对照品的应用

除极少数例子外，药典分光光度检查和含量测定的比对要用USP标准物质。这是为了确保在同一条件下测定供试品和对照品。这些条件包括波长设置、狭缝宽度调整、池的位置和校正以及透光水平。需要指出的是在特定波长处具有相同透光度的池，可能在其他波长处透光度相差很大。必要时，应对池进行适当的校正。

分光光度法检查和含量测定中，常出现“同法”和“相同溶液”，系指对照品（一般为USP标准物质）与供试品一样用同一条件处理和检测。通常，特定对照品溶液的配制应在规定浓度（通常约在10%范围内），吸收系数按精密称定量计算；如果以前烘干的对照品尚未使用，则吸收系数以无水物计。

在分光光度法检查和含量测定中，若出现“伴随测定”和“伴随测量”，系指供试品溶液和对照品溶液相对于特定空白溶液的吸光度，应连续测定。

仪器

分光光度计的种类较多。除了用于红外光谱检查的光度计外，大部分类型的光度计能用单色辐射能量透过样品，且能测定透过部分光的强度。傅里叶变换红外光谱仪使用的是干涉测量技术。根据强度和时间，多色辐射可借此技术透过分析对象到达检测器。紫外、可见和红外分光光度计包括光源、分光装置（如棱镜或光栅）、谱带宽度选择狭缝、样品池、辐射能量检测器以及配套的放大器和测量装置。在二极管阵列分光光度计里，从光源发射的能量通过样品，再由光栅发散到达数百个光敏二极管上，每个二极管在其短短的波长间隔依次产生与光子数量呈正比的信号；然后这些信号在快速选定的间隔中计算形成完整的光谱。傅里叶变换红外光谱仪系统利用干涉仪代替分光装置和数值计算机处理光谱数据。有些仪器是手动的，而另外一些配备了自动连续的记录仪。连接了计算机的仪器可以对光谱进行叠加、存储和对比，以及计算示差光谱（用数字吸光度差减法）。

在可见光区，可见和紫外光区；可见、紫外和近红外光区；以及红外光区使用的光谱仪器都可以买到。对分光光度计分析类型和使用仪器的选择取决于以下因素：被分析样品的组成和量，对准确度、灵敏度和选择性的要求，以及样品处理方式。

原子吸收分光光度法使用的仪器有几个独特的功能。对于测定的各种元素，每种均需选择能发射特征共振线的源。这种源通常是空心阴极灯，其负极在受激时能发射被测元素的共振线。由于被测元素吸收的辐射与被测元素相同。该设备还配备了一个抽吸装置，用来引导试验样品进入火焰中，该火焰通常由空气-乙炔、空气-氢气，难熔情况下则由一氧化二氮-乙炔来提供。实际上，火焰是一个被加热的样品室。而检测器则是读取来自样品室的信号。火焰在燃烧时产生的干扰射线会因使用具有特定频率的切碎源灯而消除掉。检测器应调成交流电频率，因此能忽略火焰产生的直流电信号。药典的目标是：仪器应该能直接提供吸光度单位。然而，根据品种正文计算公式要求的定量结果，必要时也能用直接显示透光百分率、吸收百分率或浓度的仪器。吸光百分率或透光百分率可由以下两个等式转换成吸光度（A）：

A=2- log10（100-吸收%）或A=2- log10（透光%）

根据所使用仪器的类型，读出装置可能是计量器、计数器、记录仪或打印机。单光束和双光束仪器都适合以上要求，且市面上都能买到。

步骤

吸收分光光度法

关于操作分光光度计的详细说明由制造商提供。为得到显著有效的结果，分光光度计的操作者必须意识到它的局限性及错误和差异的潜在来源。 使用手册应该密切关注下列事项如：仪器的维护、清洁、校准，处理吸收池的技术以及操作说明。下面几点需特别强调。检查仪器的校准准确性。当使用连续光源时，应当注意其波长和光度比；当使用光谱线光源时，只需检查光度比。很多辐射能量源具有充分分布于整个所选光谱范围的合适强度的光谱线。紫外和可见光校正光谱的最佳单一光源是石英-汞弧灯，其中在253.7、302.25、313.16、 334.15、365.48、404.66和435.83nm的光线可以使用。玻璃-汞弧灯在 300nm 以上同样可用。氢放电灯的486.13 nm 和 656.28 nm 光线也可以使用。波长范围还可以通过适当的玻璃滤波器校准，该滤波器在可见光和紫外区域的吸收光谱带很有用处。虽然发现含钬的玻璃更好些，但是含钕镨混合物(一个镨和钕的混合物)的标准镜片使用广泛。标准钬氧化物溶液已经替代了钬玻璃.1的使用。近红外和红外分光光度计的波长范围能通过使用由聚苯乙烯薄膜、二氧化碳、水蒸气或氨气来提供的吸收带易于检出。

对于检查光度比，可使用若干标准无机玻璃滤波器，以及已知透光度的标准溶液如重铬酸钾。

定量吸光度测定通常对装有物质的盛液池中的溶液中进行。由于溶剂和池窗都吸收光， 两者对所测吸光度的影响必须给予补偿。市场上可以买到在紫外和可见分光光度法中适用的、无需校正的吸收池。但是，在红外分光光度法，通常要校正吸收池的差异。在这些情况下，在成对的吸收池装上选定的溶剂，并在选定的波长下测定它们吸光度的差异。显示较大吸光度的吸收池可用于测试样品，测得的吸光度再减去池的差值来校正。

随着计算机化傅里叶变换红外系统的使用，因为空白溶剂和测试溶液用的是同一个吸收池，这个校正过程就没必要了。但是，必须确定该池的透射参数为常量。

供试品和对照品的比较最好是在关注化合物的吸收光谱的峰值处进行。分光光度法含量测定给出的是普遍接受的待测化合物的峰值吸收。已知不同的分光光度计会在该峰的表观波长处显示出微小差异。习惯做法是在峰值吸收波长下进行比较。如果与各论中指定波长差异超过±1nm，则需重新校正仪器。

试验准备

用紫外或可见光分光光度法测定时，样品一般溶解在溶剂中。除非各论中另有规定，测定是在室温用 1cm光程长的条件完成。包括水、醇类、氯仿、低级烃、醚类和强酸强碱的稀释液在内的很多溶剂在上述条件下都可用。应警惕不要使用在此光区中有杂质吸收的溶剂。 一般建议使用无水甲醇或乙醇，或添加了甲醇但不含苯或其他干扰杂质的变性乙醇作为溶剂。具有特殊光谱性质并保证不含杂质的溶剂，可从一些商业途径购得。某些其他分析纯有机溶剂，可能含有能在紫外区域强吸收的痕量杂质。使用新溶剂时，应检查其透明度，在配制供试品溶液、对照品溶液以及空白溶液时，应注意使用同一批溶剂。

在近红外和红外光谱区域，具有可感知厚度的溶剂不是完全透明的。四氯化碳（最多

5mm厚）在 6μm（1666cm-1）以下几乎透明。二硫化碳（厚度1mm）适合作为最多40μm(250cm-1)光线的溶剂,但是4.2 ~5.0μm (2381 cm-1 to 2000 cm-1) 和 5.5μm ~7.5μm (1819 cm-1 to 1333 cm-1) 的区域除外，因其在此区域有强吸光性。其他溶剂的透明度区域都相对狭窄。对于红外分光光度法，对适当溶剂的额外要求是其必须对吸收池的材质(一般是氯化钠)无影响。供试品的制备:将磨细的固体样品分散在矿物油中,或与预先干燥的碱性卤素盐（通常是溴化钾）混匀。与碱性卤素盐形成的混合物可直接测定,或通过模具压制混合物得到透明的圆盘或小球再测定。溴化钾的典型干燥条件是在105℃真空干燥12个小时，但是也可以在市场上采购无需干燥的级别。在碱性卤素盐和测试样品有歧化作用发生时，采用红外显微法或矿物油分散法分散更可取。若试样合适，则可制备成整齐的薄层样品用红外显微镜检测，或用矿物油分散法制备成悬浮的液体薄膜。拉曼光谱法中大多数常见溶剂即可适用， 普通的玻璃样品池（不发荧光）也可以使用。 电磁光谱的红外区域从 0.8~400μm。 800~2500 nm（0.8~2.5μm）一般认为是近红外（NIR）区域，2.5~25μm区（4000~400cm-1）一般认为是中红外区域，25~400μm区一般认为是远红外区域（FIR）。除非各论中另有规定，用3800~650cm-1（2.6~15μm）区间测定，用于确定是否符合各论中红外吸收的要求。

在各论中给定的红外线光谱的值中，字母s、m和w相应表示强、中和弱吸收；sh表示肩，bd表示一个带，v表示非常。这些值变化多达0.1μm或10cm-1，具体数值取决于所使用的特定仪器。多晶型导致了很多固态化合物的红外光谱的差异性。因此，在进行红外吸收试验时，如果供试品和对照品的红外光谱间出现差异，将等量的供试品和对照品溶解在等体积的合适溶剂中，在同等条件下用相似容器蒸发至干，取残渣再次测量。

在近红外光谱学中，现有关注大多围绕如何简化分析。样品可以粉末形式或通过反射技术进行分析，无需或只需简单的前处理。可通过计算机比较样品的谱图和已知对照物谱图来确定是否符合内部规格。 许多药品物质在此光谱区表现出低吸收率，这使入射的近红

外光可以比紫外、可见光或红外光更深地穿透样品。 近红外分光光度法可用于观察基质变化， 经适当校正可用于定量分析。

在原子吸收分光光度法中，溶剂的性质和固体的浓度必须特殊考虑。理想的溶剂要求对吸收或发射过程干扰最小且在火焰中产生中性原子。如果供试品溶液和对照品溶液间表面张力或粘度存在显著差异，溶液就会以不同的速率吸气或雾化，导致产生的信号出现显著差异。溶液中酸浓度也会影响吸收过程。因而，配制供试品溶液和对照品溶液时，应使用在这些方面相同或尽量类似的溶剂，并且应使配制的溶液容易吸收经燃烧吸收器的样品管发射的辐射，因溶液中的不溶固体会产生基质干扰，所有溶液中不溶固体含量应尽可能保持在2%以内。

计算

在检查或含量测定中，吸收分光光度法通常需要使用对照品。如在含量测定中有规定，则应提供计算公式以便计算需要的结果。公式中常含有常数项。可用下面的推算式消去一些正文含量测定项下公式中的常数项。

比尔定律关系式对对照品溶液（S）和供试品溶液（U）均有效。

（1）As = abCs （2）Au = abCu

式中， As是浓度为 Cs 的对照品溶液的吸光度，Au是浓度为 Cu 的供试品溶液的吸光度。如果Cs和Cu单位相同，并且在相同尺寸的配对池中测定吸光度，则吸光度a、池厚度b均相同，而以上两个等式可合并成下式，得出Cu：

（3）Cu = Cs（Au/As）

固体测试样品的定量分析一般规定以 mg为单位。含量测定项下会给出稀释方法，用稀释溶液测定吸光度，溶液浓度通常以μg/mL为单位。取一定量原料药或固体剂型的供试品（单位mg）作分析，因此，浓度为Cu的溶液的体积为（Vu，单位L）可由质量为Wu（单位mg）含原料药的供试品求得。[注：Cu不论用μg/mL还是mg/L为单位，数值相同]如下：

（4）Wu = VuCu

在固状物质个论中含量测定里出现的公式形式，可以通过将公式（3）中的 Cu 代入公司（4）中得到。总之，使用方程式（4），考虑到所需的单位转换得出公式（5），可计算在最终公式里的常量因子（Vu）：

（5）Wu = VuCs（Au/As）

同样的推导适用于各论中出现的液体物质使用吸收分光光度法进行定量测定的公式。对于液体剂型，计算结果通常表示为每毫升物质中原料药的含量（单位mg）。因而有必要在分母中增加供试品溶液的取样量V（单位mL）。

在可见光区域的含量测定，通常需要同时比较供试品溶液产生的吸光度与含有大约相当量的USP标准物质配制的对照溶液产生的吸光度。在某些情况下，允许不使用对照品。需常规重复进行分光光度含量测定时，可用以USP标准物质配制的标准曲线，而待测物质遵循比尔定律，待测物质浓度应在含量测定终浓度的75%~125%之间。在这种情况下，检测的吸光度值可插入到标准曲线中，并由此计算出含量结果。

这些标准曲线应经常确认，尤其当使用新的分光光度计或新批号溶剂时要确认。

在分光光度法含量测定项下规定制备和使用标准曲线是允许和可取的，当检测使用频率较少时，可不用标准曲线，而采取与供试品含量相当且处理方法相同的对照品进行比对的方法测定。