２０１９年 ３月NewsletterofSericulturalScience
１
家蚕狭胸(突变性状narrowbreast,nb)
∗
观察及基因的精细定位
刘品彦 刘茹凤 丛江珊 刘春
)重庆 ４２．农业农村部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室,００７１６
摘 要 狭胸(是家蚕少数几个体型突变种之一,其表型为胸部狭小,位于１narrowbreast,nb)９号染色体的３该突变为自然隐性突变.到目前为止,其突变基因还未被分离克隆,突变１．２位点,察.发现３龄时,并维持到蛹期.５龄期的nnb狭胸表型开始明显,b与野生型的体重没有明显差异,但nb体长明显的比正常表型短.５龄５d解剖观察发现nb和野生型个体前肠存在差异,nb前肠在食道处收缩,而正常个体是逐渐变大且呈漏斗状.同时,本研究还采用大造和nb为亲本构建通过筛选合适的S其结果为:利用１BCNP标记对nb突变基因进行了精细定位,０SNP个标１群体,记和９将n遗传距２个BCb突变相关基因位于标记３和８之间的区域内,１代个体进行连锁分析,.利用１离为７．物理距离约为１．８cM,７Mb３个可用于定位的标记和１７９４个BCnb突变１代个体,,基因位于标记３该区域物理跨度约为１M基因预测结果显示定位区域内含１和３８之间区域内,b有４４个基因.本研究为nb突变基因的定位及机理的阐释提供了参考信息.关键词 性状观察;定位克隆;连锁图谱;精细定位nb;
机理未知.为了分离克隆n阐释其突变机理,本研究首先对nb的突变基因,b蚕的突变性状进行观
(家蚕基因组生物学国家重点实验室,１．
家蚕.如果从１至今９０６年由日本遗传学家外山龟太郎开展蚕丝性状及形态突变的研究算起,家蚕遗传学研究历史已逾１并取得了丰硕的成果.全世界保存了大约１００年,０００种左右的突到２其中有１００５年发表最新的经典遗传图谱上共有２４６个形态和生化标记,９６个已经被定位
][]１
,在每个连锁群上具体的座位上[其它的分子图谱也在２０世纪９０年代纷纷完成２５.特别是[１]
,到了２家蚕基因组计划、为１世纪,BAC文库、EST文库、SNP连锁图谱相继实施及完成６１
家蚕是重要的经济昆虫,又是遗传学研究的良好材料.早在５人们就开始驯养０００年前,
变体,其中西南大学家蚕基因资源库保存了约有６００份突变体.２８个连锁群现已全部发现,
利用定位克隆的手段开展家蚕突变体分子遗传研究奠定了坚实的基础.从２００８年３月报道
[３２１]
.sch、mln、cts等突变种通过定位克隆的手段阐明了突变的分子机理１
狭胸(突变种属家蚕的自然突变,最早于１narrowbreast,nb)９５３年由日本学者筑紫发
１２]
、的第一个利用定位克隆阐明无翅(突变机理[到现在,已经有包括nl)sdＧ２、ow、od、btsC、f现,该突变为隐性突变,幼虫胸部狭窄,腹部肥大,近纺锥形,手触松弛.该突变位于家蚕经典、(、遗传连锁图中第１该连锁群上还有P９连锁群１９３１．２座位上,es(１９０．０)Gl１９１９．２)
)、)、)IctＧD(１９２９．１Alb(１９３７．４msn(１９４５．８５个已定位标记和４个未定位标记.该突变
∗
).资助项目:国家自然科学基金面上项目(３１８７２２９６
:作者简介:刘品彦,男,硕士研究生.EＧmail４３７３０６０８４＠q．comq
:通讯作者:刘春,研究员,博士生导师.EＧmailmlliuchun＠１６３．com
２蚕 学 通 讯 ３９卷
是少数几个关于家蚕形体的突变体,但其突变基因还未被分离克隆,其突变机理未知.为此,本研究首先对其突变性状进行了观察,并利用S为分离NP标记对突变基因进行了精细定位,和克隆突变基因奠定了基础.
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
本实验选取西南大学家蚕基因库系统编号为１常规８１１０的nb突变种及大造作为材料,
桑叶饲育.以n根据突变表型对Bb及大造作为亲本,Fb雌个体回交后,C１雄个体与n１代回１．２ 外部形态及内部器官观察
交群体进行单个样品收集,液氮速冻后提取基因组DNA进行连锁分析.
//＋进行观察拍照.取健分别选取健康而且大小适中５龄第３d和５龄第７d的nbnb,nb康而且大小适中５龄５从背部解剖,保持消化道的整体完整性,对位于胸部d家蚕大造和nb,的消化道进行形态观察拍照.１．３ 基因组的提取
基因组利用高通量的核酸自动抽提仪(日本)进行提取.操作方法按试剂盒KuroboＧPI１２００,说明书和仪器说明书进行.提取的基因组D检测NA利用家蚕看家基因rl３进行PCR扩增,p基因组质量.在抽检的样品中其出带的比例达９５％以上表明基因组DNA质量可用于后续工,,,,作.扩增条件:９５℃预变性５min９４℃变性１０sec５５℃退火１５sec７２℃延伸３０sec３０个循１．４ SNP标记引物及SNP位点鉴定,环,７２℃７min４℃保存.
本实验中使用的亲本P代及F提取,回交群体NAzol试剂(Roche公司)１代基因组利用D
[０]据Y等人２amamoto１００８年公布的家蚕SNP图谱中引物信息.利用亲本基因组DNA作为
本实验主要利用S其SNP标记对nb突变基因进行精细定位,NP标记的引物序列主要根
(,.及E反应条件:TaKaRa公司)xonucleaseI对PCR产物进行消化,３７℃２０min８０℃３０min
,,,,然后进行测序PCR反应,PCR反应条件:９６℃１min９６℃１０sec５０℃５sec６０℃４min２５个循环,４℃保温.最后使用乙醇醋酸钠沉淀法对测序样品进行纯化.使用HITACHI３７３０测序仪进行测序分析.
marker编号
１２３４５６７８９
表１ SNP标记引物
模板进行P电泳检测后进行P其测序方法如下:首先使用SCR扩增,CR产物测序,AP酶
CGTCAGAAACACATGAAAAGTTGTTAAAATGGACGCCAATGGTTTCGTTGATAGACTGGTGCGCGGGGATCCTGATTCTGTTACCGAAAGCTCACCTACACG
GAACTCAACGCAGAACGCTT
AACTCAATCGAACATACGAACG
_FPCRprimer
TGACGACTGGCTTTATTGGTTGGGTCGTTCGATAGTCAAATTCCATCAGAGGAAGCTCTAACCGACCCCATCCAGAAACCTACCAACGACCTCAGTGGATTTGC
_RPCRprimer
ATAGGATCAGTGTGTTCCACCC
CAAAGGAAACCACTATGAAATTGACGAGATTAAGCCGCAAAAATCCGATCGAGCCTATTTAACGTATGGGTAGGAGGTGAGTGAGTG
TTCAGATATTCCAGCTGCCC
家蚕狭胸(突变性状观察及基因的精细定位１期 刘品彦等:narrowbodnb)y,
续表１ SNP标记引物
３
marker编号
１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１２２２３２４２５２６２７２８２９３０３２３１３３３４３５３６３７３８３９４０４１４２
CAAATCAAACAAAGAATGGCGCAAGCAAAATCTGGCTCGTCTTTTCCTTTGATGTGTCCCCACGTTTTGAAATGCCAATCA
TTCGTGTCATTCTCCAACGA
AGGCCTATGTCCAACAGTGG
_FPCRprimer
CACATATGACGAATCAGCCGCCGGCCACGTGTTATTTAGA
AGCCGTGGACAAAAAGCTAA
_RPCRprimer
GGTACGCGTGGCTTGTAAATGCACACCATGCGCATATTACAACACGCGTCCTTCATATCC
TGCATAAGAGCGCAATATGTTCACTACAACGACTGCAAACGCAAAGCCATTATTGTGACCGCATTAGCTTTGAAACCGTGTCGAGTCCCAATAGCTTGGCTGT
CGGCAAGAAATTTTAGAGCTGCGAATTGACTCGTTCCGAATACTCCTCCTCCTTCTCCTCGTTGGCTCATCAGGGAGAGTT
GCGTCAGATGGATTTTTCGT
CGTGCTGCGTACCCAACAATATCCATCGCTTGGGCAACTTT
TGAAATAGCCTACCGGTAAAGATTAGCAGCACAGCCATAATCAGTATAACCCTTCACGTTTCGCATAAAGCGATGCGTCTATGGTGGGAACGGGTGCCTAGATTTTCAACACCTGAAACCGTAACCCAAATCTCCTGCGAGGTCACTGAGCCAGTTCCACGACCA
AACTTAACATTTAAGCAAACCCA
CCATTTTGTTCGATAACTTTTTGCCAAATTTCGCCAAGACTGCACCCGCACAGCCAACTGACAAGCGCCGTGGCGTATTGA
TGGCTGTATGGGCTAAAGTCCTCATTGTAATTGGGGTGAGCGCCTTCAGGCGAAACACTTGCACAGAAAATGAGGGAATCA
GCGGTAATCATCATAAATACAGGCGGTAGGTGCATAGCTTAATGTGAAATGGTATTTCGTATTCGGCTAATTTTGCCCGTATATTAAATTCAACTTTGTGTTTAATCATTTATGTTCCTTGCACTTACCACTACACCAGACGGACATCTGAACTCACAACCCAT
CTTGGCTAGAAAGCGGTAGTAAGTGACTGCTTTATCTCAGGTGCTTGCGAAGTAATACAAACAGAGGGTTGTTTCACTCCCCTACGCACTATTCCGTCCGTCCA
CGAATAGCCGAACGAACA
CACAGATAAGTCCCGAACCATGATCCCGGTAAGGACATATACACCGCCATTTTCGCGACACCCCTACTCGCACTT
ATAATGGCGTTACTTGTTTCA
CAGGCGTGACATCAGCAA
TGTCGGCGGCTGGTAA
TGAATGCGTGACTGCTAAACTCGTTCACTTGATGCGGTAGTTCCTATCCGGTGTCCCACCGCACGGGCAAATA
ATGATGACCCCAATTTTGTAC
１．５ 扩增产物的SNP位点查找
.在出现测序生成的后缀名为．ab１的文件.然后打开该软件菜单栏的Seuence→TrimEndq
运行s依次打开该软件菜单栏的Feuencher软件,ile→Imort→Seuences打开测序仪qpq
选取Urameters后在OtimizeGalacement栏目下,seReliner和Perfer３’GalaceＧpppgpp
.然后就可以对选取的序列进行比对,筛查SmentNP位点.１．６ 连锁分析
在构建连锁图谱时,把n正常表型的个体标记为H,亲本大造在b表型的个体标记为A,
亲本nSNP位点表型标记为B,b在SNP位点的表型标记为A,FNP位点的杂合型标记１在S
的菜单中点击TrimCheckedItems后Trim掉测序质量较差的序列.接着点击AssemblaＧyP
４蚕 学 通 讯 ３９卷
为H,后面B统计结果整理放入ECNP位点表型也根据以上方法进行标记,xcel表格.１的S
２ 实验结果及分析
２．１ nb突变体表型观察
/＋),从４眠开始正常个体和n到５nb突变种和正常个体(nbb突变种间的体型差异开始明显,
龄后期,胸部与身体的比例变小,胸部缩小,腹部膨大,导致nnb突变种表型明显,b突变种的.对其体长和体重进行测定,整体呈纺锤体形,这种明显的体型差异一直持续到蛹期(图１)表明体重基本没有差别,但是nb的体长短于正常个体.
对不同发育时期的n发现在幼虫期的３龄末期即可从外观体型上区分b表型进行观察,
２．２ 前肠形态观察
/＋和n/图１ nbbnb基因型幼虫期及蛹期的身体形态观察
因n该区域主要包含较大的消化器官.为了观察该区域的b的表型差异主要出现在胸部,消化器官是否有异常,因此,本实验对５龄５d正常食桑的正常表现及突变表型的回交个体进行解剖观察.结果表明,正常个体的前肠部分在食道区域充满了桑叶碎片,与后面的中肠连接呈现漏斗状,其形态是逐渐增大的过程.而在突变表型个体中,食道处未被桑叶碎片充盈且收),缩,后面直接与膨大的中肠相连接(图２这可能是引起nb胸部狭小的形态原因.
图２ nb和大造食道比较
家蚕狭胸(突变性状观察及基因的精细定位１期 刘品彦等:narrowbodnb)y,
５
２．３ 低密度连锁图谱的构建
nb突变基因进行了连锁定位.本研究利用大造和nb为亲本构建BC１群体用于开展定位克
隆,设计了２其中包括２我们７对引物用于初定位,１对SNP引物和６对SSR引物.经过筛选,该图谱包含４我们把n这两个标记的遗传０个交换个体.通过分析,b锁定在标记３和８之间,２．４ 高密度连锁图谱的构建
然后,我们利用初定位标记３和８从１７９４个BC７个交换个体.随１代个体中筛选得到６利用９个标记和６该图谱包含了８个标记,７个交换个体构建了高密度连锁图谱,５４个交换个通过对定位区域进行基因预测,发现该区域内含有４４个基因.结合低密度连锁图谱及高密度).连锁图谱,绘制n图４b的定位连锁示意图(.距离为７．物理距离约为１．８cM,７Mb
虽然在形态上已经看到了差异,但n为此,本实验利用定位克隆方法对b突变基因却未知,
获得了可用于定位的标记１０个.利用这些标记和９２个BC１代个体构建了低密度连锁图谱,
后,我们新设计了１经过筛选,获得了１５对用于精细定位的SNP引物,３个可用于定位标记..体.通过分析,我们把n该区域物理距离约为１图３)b锁定在标记３１和３８之间区域,Mb(
注:N表示测序失败每一行为每个个体在这些标记下的单倍型分析结果.
标记从左到右是顺序分布在染色体上的.
图３ nb高密度连锁图谱
３ 讨论
由于其突变基因未被分离克隆,其突变机理未nb突变体是家蚕少数的体型突变体之一,知.本研究为了揭示其突变机理,本研究首先对其突变形态进行了观察,发现nb在食道处与
６蚕 学 通 讯 ３９卷
正常相比存在差异;对其进行定位克隆,将其突变基因锁定在１该研究为nMb的范围内,b突变基因的分离克隆奠定了基础.
本研究的一个新的发现是n推测该形态变化是导致其表b的前肠部分与正常相比有差异,型出现胸部狭小的主要原因.由于家蚕的体型主要受外骨骼及内部器官的形态而决定,nb蚕与正常相比表现为胸部狭小,腹部膨大.对其胸部的前肠器官进行解剖观察,发现该区域在其前肠在食道处缢缩,与其紧密连接的中肠迅速膨大.正常表型个体只在咽喉部缢缩,nb中,
在食道处呈现漏斗状的膨大形状.我们推测,这样的前肠形态导致nb的梭形体型.由于前肠壁有大量的肌肉组织,是否这些肌肉组织发育异常导致其形态的变化特征还有待进一步研究.标记构建了低密度连锁图谱,把nb相关基因锁定在１．７Mb的区域内.进一步利用１７９４个位区域进行基因预测发现含有４在这些预测基因中,有４个基因.初步的基因注释分析发现,
]２２２４
,基因具有很高的相似性.肌纤维数量的功能[在cv基因具有调控果蝇成虫跳跃肌(TDT)
图４ nb定位连锁示意图
同时,本研究以大造和nb为亲本配置BC２个BC０个１代定位群体.利用９１代个体和１
把nBCb相关基因锁定在１Mb的区域内.对定１代个体和８个标记构建了高密度连锁图谱,其中一个编号为B该基因和果蝇的c１１个表皮基因,GIBMGA００１９４５含有Tsvg结构功能域,后期的研究中,该基因将作为nb的主要候选基因进行深入的研究.
参 考 文 献
[],１ MIAOXX,XUSJLIMH,etal．SimleseuencereeatＧbasedconsensuslinkaemafBombxmoripqpgpoy[]２ PROMBOONA,SHIMADAT,FUJIWARAH,etal．Linkaemafrandomamlifiedpolmorhicgpopyp[],H３ SHIJECKELDG,GOLDSMITHMR．Ageneticlinkaemaorthedomesticatedsilkworm,Bombxgpfy[]４ FUJIIH,BANNOY,DOIRAH,etal．GeneticalstocksandmutationsofBombxmori:ImortanteＧpgy[]５ YASUKOCHIY．Adensegeneticmafthesilkworm,Bombxmori,coverinllchromosomesbasedpogay[]６ TANYD,WANCL,ZHUYF,etal．Anamlifiedframentlenthpolmorhismmafthesilkwormpggyppo
[]():J．Genetics．２００１,１５７３１２７７１２８４．
[]():on１０１８molecularmarkersJ．Genetics．１９９８,１５０４１５１３１５２５．[]:KneticresourcesJ．FukuokaJnushuUniv．１９９８．py
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家蚕狭胸(突变性状观察及基因的精细定位１期 刘品彦等:narrowbodnb)y,
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７
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():technolondSericolo．２００５,７４１５１３．gyagy
[]bxmori,basedonrestrictionframentlenthpolmorhismofcDNAclonesJ．JournalofInsectBioＧggypy[],KA９ YAMAMOTOK,NARUKAWAJDONOＧOKUDAK,etal．Constructionofasinlenucleotideg
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olmorhismlinkaemaforthesilkworm,Bombxmori,basedonbacterialartificialchromosomeendpypgpy[]YAMAMO,１０TOK,NOHATAJKADONOＧOKUDAK,etal．ABACＧbasedinteratedlinkaemafggpo[]X１１IAQY,GUOYR,ZHANGZ,etal．ComleteReseuencinf４０GenomesRevealsDomesticationEＧpqgo[]S１２ATOK,MATSUNAGATM,FUTAHASHIR,etal．PositionalcloninfaBombxwinlesslocusgogy():１７９２８７５８８５．
[]():ventsandGenesinSilkworm(Bombx)J．Science．２００９,３２６５９５１４３３４３６．y]():thesilkwormBombxmori[J．GenomeBiol．２００８,９１R２１．y()[]flüellosflrevealsacrucialroleforfrinethatissecificforwinorhoenesisJ．Genetics．２００８,ggpgmpg
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():１０５２１７５２３７５２７．
],():aberrationsoftheZchromosomeinBombxmori[J．InsectBiochemMolec．２００８３８１２１０７２１０７９．y[]themidutmembranecausesresistancetoaBombxparvoＧlikevirusJ．PNatlAcadSciUSA．２００８,gy[],１５ITOK,KATSUMASYAMAMOTOK,etal．A２５bＧloninsertionalmutationintheBmVarenecausespgpg[]D,１６AIFY,QIAOL,TONGXL,etal．MutationsofanarlalklamineＧNＧacetltransferaseBmＧiAANAT,areyyy[],YAMAMO１７ITOK,KATSUMASTOK,etal．YellowＧedeterminesthecolorpatternoflarvalhead[]L１８IUC,YAMAMOTOK,CHENGTC,etal．Reressionoftrosinehdroxlaseisresonsibleforthepyyyp
]sexＧlinkedchocolatemutationofthesilkworm,Bombxmori[J．PNatlAcadSciUSA．２０１０,１０７y():２９１２９８０１２９８５．
]():andtailsotsofthesilkwormBombxmori[J．JBiolChem．２０１０,２８５８５６２４５６２９．py[],():resonsibleforsilkwormmelanismmutantJ．JBiolChem．２０１０２８５２５１９５５３１９５６０．p
],():thewaxtranslucentskinofthesilkworm,Bombxmori[J．InsectBiochemMolec．２００９３９４２８７２９３．yy[]S,１９AKUDOHT,IIZUKAT,NARUKAWAJetal．ACD３６ＧrelatedtransmembraneproteiniscoordinaＧ
():BiolChem．２０１０,２８５１０７７３９７７５１．
[]tedwithanintracellularliidＧbindinroteininselectivecarotenoidtransortforcocooncolorationJ．Jpgpp
[],２０ITOK,KIDOKOROK,KATSUMASetal．PositionalcloninfageneresonsibleforthectsmutaＧgop[]Z２１HAOY,ZHANGH,LIZ,etal．Amaorfacilitatorsuerfamilroteinparticiatesinthereddishjpypp[]D[]２２EAKI．MutationsofDrosohilamelanoasterthataffectmusclesJ．JournalofembrolondexＧygyapg[]D,２３EAKIIBELLAMYPR,BIENZM,etal．MutationsaffectintheindirectflihtmusclesofDrosohＧggp[]J,２４ARAMILLOMASLOVATOCV,BACAEM,etal．CrossveinlessandtheTGFathwaeulateyrgβp
[]():fibernumberintheDrosohilaadultumuscleJ．Develoment．２００９,１３６７１１０５１１１３．jpmpp]():ilamelanoaster[J．Journalofembrolondexerimentalmorholo．１９８２,６９１６１８１．ygyappgyg():erimentalmorholo．１９７７,４０１３５６３．ppgy
]():brownpimentationinBombxmori[J．JInsectPhsiol．２０１２,５８１１１３９７１４０５．gyy]():tionofthesilkworm,Bombxmori[J．Genome．２０１２,５５７４９３５０４．y８蚕 学 通 讯 ３９卷
Theobservationofphenoteandthefinemainypppg
ofnarrowbreastmutantofsilkworm,BombxmoriyLIUPinＧan LIURuＧfen CONGJianＧshan LIUChungygg
KeaboratorericulturalBiolondGeneticBreedinyLyofSgyag,Ministrriculture,SouthwestUniversitChonin００７１６,China)yofAgy,gqg４
ABSTRACT
(StateKeaboratorilkwormGenomeBioloyLyofSgy,
,corresondgenehasnotbeenisolatedandclonedandthemechanismisunknown．Withthep
mutantpresentsnarrowedbreastphenotecausedbecessivenaturalmutantbinleypyrysg
th
,enewhichlocatedonthe３１．２locusofthe１９linkaegrou．Howeveruonow,theggppturosetoclonethemutanteneandrevealthemechanism,themutanthenoteofnbwasppgpyp
narrowbreast(nb)isoneoftheraremutantseciesrelatinothebodhae．Thepgtysp
th
,erperiodof３instaranditbecamemoreandmoreclearlndketuntilpuaestae．BeＧyappg
,,sidesitwasnodifferenceintheweihtbetweenthenbmutantstrainandthenormaloneg
observedatfirst．ThecharacterofnbmutantstrainstartedtopresentraduallfromthelatＧgy
th
strainonthefifthdain５instaraccordinothedissectionobservation．TherewasanarＧygt
,rowreionattheesohausinthenbmutantstrainbutpresentedafunnelshaewithagpgp
one．Somedifferencesinthefrontiergutwasobservedbetweenthenormalandnbmutant
,howeverthebodenthofthenbmutantstrainisdramaticallhorterthanthenormalylgys
ducethepoulationofBC１generationforpositonalclonin．１０SNPmarkerscoulduseforpglowＧdensitlinkaemafnb．Thenblinkedreionwasnarrowedtothe１．７Mbraneonygpogg,wmainfterscreenin．Bsinhesemarkersand９２BCndividualseconstructedappgagyugt１i
radualincreaseinthenormalstrain．WeusedDazaoandnbastheparentalstrainstoproＧg
chromosome１９betweentwoSNPmarkers３and８．Thegeneticdistancebetweenthetwo
,markersis７．８cM．Withanother１３SNPmarkersand１７９４BC１individualsthenblinkedreＧ,ionwasfurthernarrowedtothe１MbranebetweentwoSNPmarkers３１and３８．ItconＧgg
tains４４predictiongenesamonthepositioninrea．ThisstudrovidesreferenceinformaＧggayptionforthepositioninfthenbandinterretationofthemechanism．gop
;p;Keords narrowbreast;phenoteobservationositionalcloninfinelinkaeywypgg
map
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