环境工程微生物实验指导书

环境工程微生物

实 验 指 导 书

《环境工程微生物》教研组 编

环境与资源学院环境工程实验教学中心

二 00 四年三月

实验一 细菌革兰氏染色法

一、目的要求

1. 学习并初步掌握革兰氏染色技术；

2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理

革兰氏染色法是 1884年由丹麦病理学家 C.Gram创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G ）和革兰氏阴性菌（G ）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为 G 菌和 G - 菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G -菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的 Hucker 氏改良的革兰氏辩色法。 三、实验材料

1．菌种：培养12-16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养 24小时的大肠 杆菌（Escherichia coli）。

2．染色液和试剂：结晶紫染液、卢哥氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液、番红染液等。

3．其他器材：显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯、废液缸、洗瓶。 四、实验方法与步骤

（一）制片 取菌液按常规技术进行涂菌、干燥、固定。 （二）染色

1．初染：在制片上滴加适量（以盖满细菌涂面）结晶紫染液，染 l min后，用水洗去染料。

2．媒染：滴加卢哥氏碘液 l min 后,水洗。

3．脱色：将玻片倾斜，在白色背景衬托下，用滴管滴加95％乙醇脱色，摇 动玻片直至流出的乙醇无紫色时（根据涂片之厚薄需时 30s-60s） ，立即水洗。 4．复染：滴加番染液约 3-5min，水洗。

6．晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。

7．镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性，绘图。

8．混合涂片染色：按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的做混合器涂片，染色、镜检，进行比较，绘图。

9．检测未知菌：用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。 10．显微镜的保养。 注意：

1．涂片尽可能均匀，切忌过厚，否则易出现脱色不完全而引起的假阳性。 2．革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色

时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。 3．染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

4．选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E. coli培养 24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 五、实验报告

记录革兰氏染色法步骤、未知菌的检测结果，并进行结果分析。 六、思考题

1．用红蓝笔绘出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的革兰氏染色视野图。

2．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株，以证明你的染色结果的正确性？

3．你的染色结果是否正确？若不正确，请说明原因。 4．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。

5．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

实验二 水体中粪便污染指示菌的检测－多管发酵法

一、目的要求

1. 学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。 2. 了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。 二、实验原理

水中的病菌如伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、钩端螺旋体等主要来自人和动物的粪便及污染物。因此，粪便管理在控制和消灭消化道传染病有重要意义。由于肠道病原菌在水中数量较少，故直接检查水中的病原菌是比较困难。大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。 即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源的污染程度，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。目前我国规定生活饮用水的标准为1mL水中细菌总数不超过 100个；每升水中大肠菌群数不超过 3个。超过此数，表示水源可能受粪便等污染严重，水中可能有病原菌存在。大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，能发酵乳糖，在乳糖培养基中经 37℃，24小时培养，能产酸产气，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number） ，简称MPN表示。 三、实验材料及仪器

1．实验仪器设备：高压蒸气灭菌器、恒温培养箱、冰箱、生物显微镜、载玻片、酒精灯、镍铬丝接种棒、培养皿（直径Φ90mm） 、试管（5×150mm） ，吸管（1、5、10mL） 、烧杯（200、500、2000mL） 、锥形瓶（500、1000mL） 、采样瓶。 2．培养基及染色剂的制备 （1）乳糖蛋白胨培养液 将 10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和 5g氯化钠加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH为 7.2～7.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。

（2）三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液

按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。 （3）品红亚硫酸钠培养基：

① 贮备培养基的制备：于 2000mL烧杯中，先将 20—30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及 10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到 1000mL，调节溶液 pH至 7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加 10g乳糖，混匀，定量分装于 250或 500mL锥形瓶内，臵于高压灭菌器中，在 121℃灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。

② 固体平板的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，臵于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，臵于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再臵于沸水浴中煮沸10min（灭菌） 。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液， 滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再退至淡红色为止（不宜加多） 。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡） 。立即将此培养基适量（约 15mL）倾入已灭菌的培养皿内，待冷却凝固后获得固体平板，臵于 4℃冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 （4）伊红美蓝培养基

① 贮备培养基的制备：于 2000mL烧杯中，先将 20～30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。再加入 2g磷酸二氢钾及 10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至 1000mL，调节溶液 pH值至 7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入 10g乳糖，混匀后定量分装于 250或 500mL锥形瓶内，于 121℃高压灭菌 15min，贮于冷暗处备用。

② 培养皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的 2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于 13mL水中） ，加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡） ，立即将此培养基适量倾入已灭菌的空培养皿内，待冷却凝固后，臵于冰箱内备用。 （5）革兰氏染色剂 ① 结晶紫染色液：将 20mL结晶紫乙醇饱和溶液（称取 4～8g结晶紫溶于 100mL 95%乙醇中）和 80mL1%草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放臵过久会产生沉淀，不能再用。

② 助染剂：将 1g碘与2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至 300mL。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于 30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。

③ 脱色剂：95%乙醇。

④ 复染剂： 将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中， 待完全溶解后， 加90mL蒸馏水。

四、实验方法与步骤： 1. 生活饮用水 （1）初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管） ，以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。 在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中 （内有倒管） ，以无

菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后臵于 37℃恒温箱内培养 24h。 （2）平板分离：上述各发酵管经培养 24h后，将产酸、产气及只产酸

的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，臵于 37℃恒温箱内培养 24h，挑选符合下列特征的菌落。

①伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。

②品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。 （3）取有上述特征的群落进行革兰氏染色

①用已培养 18～24h的培养物涂片，涂层要薄。

②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水 洗去。

③滴加助染剂，1min后用水洗去。

④滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约 20～30s） ，用水洗去。 ⑤滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳 性菌，呈红色者为阴性菌。

（4）复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管） ，每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落 1～3个，然后臵于 37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论） ，即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查后附表 1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。 2. 水源水

（1）于各装有 5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的 5个试管中（内有倒管） ，分别加入 10mL 水样；于各装有 10mL 乳糖蛋白胨培养液的 5个试管中（内有倒管） ，分别加入 1mL 水样；再于各装有 10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管） ，分别加入 1mL1:10稀释的水样。共计 15管，三个稀释度。将各管充分混匀，臵于37℃恒温箱内培养 24h。

（2）平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。 （3）根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表 2“最可能数 （MPN）表”，即求得每 100mL 水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故 MPN值再乘以10，即为 1L水样中的总大肠菌群数。例如，某水样接种 10mL的 5管均为阳性；接种 1mL的 5管中有 2管为阳性；接种 1:10的水样 1mL 的 5管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知 100mL水样中的总大肠菌群数为49个，故 1L水样中的总大肠菌群数为49×10=490个。 对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1:10、1:100、1:1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。 如果接种的水样量不是 10mL、1mL和 0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得 MPN指数，再经下面公式换算成每 100mL的 MPN值。 ） 

10（ml）MPN值MPN指数

接种量最大的一管

五、实验报告

1. 将实验结果填入下表中 样品管（ml） 100 10 1.0 0.1 0.01 发酵结果 使用水 水源水 注：阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。 2. 查表 1、表 2 获得每升水样中大肠菌群数是多少？ 六、思考题

1. 大肠菌群的定义是什么？

2. EMB 培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？

实验三 活性污泥法污水处理过程中微生物生长情况

简单分析

一、目的要求

1. 综合前面所学基础实验操作，完成对污水中微生物的分析工作。 2. 了解污水处理不同阶段微生物情况。 3. 强化微生物基础操作能力。 二、基本原理

污水生物处理主要是指利用微生物的新陈代谢作用， 分解转化污水中的污染物， 达到净化水质的目的。 生物处理是目前污水处理最有效、 最经济的方法之一。 活性污泥法是以活性污泥为主体的废水生物处理的主要方法。 活性污泥法是向废水中连续通入空气， 经一定时间后因好氧性微生物繁殖而形成的污泥状絮凝物。 其上栖息着以菌胶团为主的微生物群， 具有很强的吸附与氧化有机物的能力。活性污泥法处理前、后与处理过程中的微生物存在数量和种类的明显差异。 三、实验材料

1. 仪器：试管 30 支，培养皿 60 个，1mL 移液管 30 支，5mL 移液管 3 支，100mL 锥形瓶各 2 个，250mL 锥形瓶各 1 个，400mL 烧杯 1 只，吸耳球 1 个，剪刀1把，酒精灯1个，火柴1盒，接种环各1个，记号笔1支，试管架2个，血球计数板 6 个，显微镜 1 台。漏斗、量筒、天平、高压蒸汽消毒器、电炉等分别共用。

2. 药品：牛肉膏，蛋白胨，琼脂粉，氯化钠，革兰氏染液一套。 四、实验方法与步骤 （一） 实验准备环节

1. 配制固体基础培养基（200mL） 、0.85％生理盐水（每配 200mL） ；分装固体培养基—6 支试管（每支 5mL）做斜面，剩余装入锥形瓶中。

2. 做试管、锥形瓶的棉塞，并对试管、锥形瓶、培养皿、移液管进行包扎。 3. 在高压消毒过程中，开启操作台紫外灯消毒 30min 左右。 4. 用无菌锥形瓶分别取进水前、处理中、出水水样。 （二） 细菌计数 1. 将水样梯度稀释。

将所取进水前、处理中、出水三种水样分别梯度稀释到 10-7、10-9、10-5，备用。 注意：在每次梯度稀释中都要使得试管中样品震荡均匀，保证实验的准确性。利 用旋涡混合器震荡要半 min 左右，直接手动震荡要保证震荡 80 次左右。 2. 取适当稀释管进行平板涂布法计数。

平板涂布法：将灭菌后的固体培养基倒制平板，待平板冷却后，用 1mL 移液管取 0.5mL 菌液滴加到平板表面，并用刮刀涂匀；对于进水、处理中和出水三种 水样的稀释液，分别取进水的（10-5、1 0-6、1 0-7）管稀释液、处理中水样的10-7、10-8、10-9）管稀释液和出水水样的（10-2、10-3、10-4）管稀释液进行平板涂布。

注意：在进行菌液涂布时，一定要用玻璃刮刀把菌液均匀涂布到平板表面， 另外要待玻璃刮刀基本冷却后再进行涂布，以免过热将细菌杀死。 3. 取适当稀释管进行平板倾倒法计数； 平板倾倒法：取稀释后水样 0.5mL 加入无菌培养皿中，将冷却至 45℃左右的固体培养基倒入培养皿中，轻轻摇匀，放臵平面上待凝固。对于进水、处理中和出水三种水样的稀释液，分别取进水的（10-5、10-6、10-7）管稀释液、处理中水样的（10-7、10-8、10-9）管稀释液和出水水样的（10-2、10-3、10-4）管稀释液进行平板涂布。

注意：在倾倒培养基时，温度要保持在 45℃左右，如果难以把握，可以在实验前将融化后的固体培养基放入 45℃干燥箱中保证一段时间而保证其维持衡定所取温度。倾倒后要迅速轻摇培养皿，使得菌液与培养基混合菌液，避免由于菌体分散不充分而影响实际结果。

4. 取适当稀释管用血球计数板直接进行细菌计数。

取稀释后水样滴加到盖玻片的边缘， 让菌液自动渗入， 多余菌液用滤纸吸去，1min 后，镜检菌体数量；对于进水、处理中和出水三种水样的稀释液，分别取进水的（10-5、10-6、10-7）管稀释液、处理中水样的（10-7、10-8、10-9）管稀释液和出水水样的（10-2、10-3、10-4）管稀释液进行平板涂布。

注意：实验计数时，应该严格遵循“数上（下）不数下（上） ，数左（右） 不数右（左） ”的原则进行，以减少误差，同时应该尽量多数小方格，取平均值。

（三）划线分纯

1. 用接种环分别蘸取三种水样，在准备号的固体培养基平板上进行平板划线。 2. 然后将划线好的固体平板放入培养箱中，倒臵培养 24h，取出观察。

3. 根据微生物菌落特征分别选取分散开的不同菌落进行再次划线后继续培养，直到获得多个不同的微生物菌株。

4. 在已准备好的固体斜面上接种所得已分纯菌株，培养 24h 后取出，4℃下保存。

（四）形态观察

取出前一天培养的平板，对细菌生长情况进行观察。

1. 菌体形态：分别挑取具有不同特征的菌落，按照已掌握染色方法进行革 兰氏染色，镜检观察。

2. 菌落形态：在培养皿内观察不同菌落形态，初步分析自己分离微生物的 种类，并和其他同学的实验结果进行对比，大致判断污水处理不同阶段微生物的差异。

五、实验报告

1. 将细菌计数结果填入下表中 计数方法 编号 进水 氧化沟 出水 10-5 10-6 10-7 10-7 10-8 10-9 10-2 10-3 10-4 平均涂布1# 法 2# 平均 菌体浓度（cfu/ml） 倾倒法 1# 2# 平均 菌体浓度（cfu/ml） 显微镜直1# 接计数法 2# 平均 菌体浓度（cfu/ml） 2. 将菌落观察结果填入下表中 培养编号 进水 氧化沟 出水 方式 颜色 形状 大小 颜色 形状 大小 颜色 形状 大小 平均1# 涂布2# 法 倾倒1# 法 2# 平板1# 划线 2# 3# 3、描绘划线分纯结果 4、将分纯菌体的镜检结果填入下表中 编号 革兰氏属性 大小 形态 备注 1# 2# 3# 4# 5# 6# 六、思考题 1. 污水处理过程中的常见菌大致有那些？你分离出了哪些菌？ 2. 结合自己实验，判断污水处理过程中有没有哪些菌在不同阶段都存在？如果 存在，有哪些？

实验四 活性污泥微生物的镜检分析

一、目的要求

1. 了解活性污泥或生物膜中微生物及微型动物的数量及生长状况 2. 初步判断污水处理的运行状况是否正常。 二、基本原理

活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体。污泥中微生物的生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。因此，我们在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质以外，还可借助于显微镜观察微生物的状态来判断废水处理的运行状况，以便及早发现异常情况，及时采取适当的对策，保证稳定运行．提高处理效果。为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。 三、实验材料

1. 显微镜、载玻片、盖玻片、微型动物计数板 2. 活性污泥(或生物膜)样品。 四、方法与步骤 (一)压片标本的制备

1. 取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后．取沉淀的活性污泥一小滴放在载玻片上；如混合液中污泥较多．则应稀释后进行观察)。

2. 盖上盖玻片，即制成活性污泥压片标本。在加盖玻片时，要先使盖玻片的一边接触水滴，然后轻轻放下，否则会形成气泡、影响观察。 3. 在制作生物膜标本时．可用镊子从填料上刮取一小块生物膜．用蒸馏水稀释，制成菌液。以下步骤与活性污泥标本的制备方法相同。

(二)显微镜观察

1．低倍镜观察，要注意观察污泥絮粒的大小，污泥结构的松紧程度，菌胶团和丝状菌的比例及其生长状况，并加以记录和作必要的描述。观察微型动物的种类、活动状况，对主要种类进行计数。污泥絮粒大小对污泥初始沉降速率影响较大，絮粒大的污泥沉降快，污泥絮粒大小按平均直径可分成三等： 大粒污泥：絮粒平均直径﹥500μm； 中粒污泥：絮粒平均直径在 150～500μm之间；细小污泥：絮粒平均直径﹤150μm。 污泥絮粒性状是指污泥絮粒的形状、结构、紧密度及污泥中丝状菌的数量。镜检时可把近似圆形的絮粒称为圆形絮粒； 与圆形截然不同的称为不规则形状絮粒。絮粒中网状空隙与絮粒外面悬液相连的称为开放结构；无开放空隙的称为封闭结构。絮粒中菌胶团细菌排列致密，絮粒边缘与外部悬液界限清晰的称为紧密的絮粒。絮粒边缘界线不清的称为琉松的絮粒。实践证明，圆形、封闭、紧密的絮粒相互间易于凝聚，浓缩、沉降性能良好；反之则沉降性能差。活性污泥中丝状菌数量是影响污泥沉降性能最重要的因素， 当污泥中丝状菌占优势时，可从絮粒中向外伸展，阻碍了絮粒间的浓缩，使污泥SV 值和 SVI 值升高，造成活性污泥膨胀。根据活性污泥中丝状菌与菌胶团细菌的比例，可将丝状菌分成五个等级： 〇 级：污泥中几乎无丝状菌存在

± 级：污泥中存在少量丝状菌；

＋ 级：存在中等数量的丝状菌，总量少于菌胶团细菌 ＋＋ 级：存在大量丝状菌，总量与菌胶团细菌大致相等；

＋＋＋级：污泥絮粒以丝状菌为骨架，数量超过菌胶团而占优势。 2．高倍镜观察 用高倍镜观察，可进一步看清微型动物的结构特征。观察时注意微型动物的外形和内部结构，如钟虫体内是否存在食物胞，纤毛环的摆动情况等。观察菌胶团时，应注意胶质的厚薄和色泽、新生菌胶团出现的比例。观察丝状菌时，注意丝状菌

生长、细胞的排列、形态和运动特征，以判断丝状菌的种类，并进行记录。 3．油镜观察

鉴别丝状菌的种类时，需要使用油镜。这时可将活性污泥样品先制成涂片后再染色，应注意观察丝状菌是否存在假分支和衣鞘，菌体在衣鞘内的空缺情况，菌体内有无贮藏物质的积累和贮藏物质的种类等， 还可借助鉴别染色技术观察丝 状菌对该染色的反应。 (三)微型动物的计数

1．取活性污泥法曝气池混合液盛于烧杯内，用玻棒轻轻搅匀，如混合液较浓，可稀释成 1:1的液体后观察。

2． 取洗净的滴管 1支（滴管每滴水的体积应预先测定，一般可选一滴水的 体积为 0.05mL 的滴管） ，吸取搅匀的混合液，加一滴到计数板的中央方格内。然后加上一块洁净的大号盖玻片，使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。

3．用低倍镜进行计数。注意所滴加的液体不一定布满整个 100 格小方格。计数时，只要把充有污泥混合液的小方格挨着次序依次计数即可。观察时，同时注意各种微型动物的活动能力、状态等。若是群体，则需将群体上的个体分别计数。 4．计算

设在一滴水中测得钟虫 20 只，样品按 1:10 稀释，则每毫升混合液中含钟虫数应为：20只×20×10＝4000只。 五、实验报告 将观察结果填入下表中 指 标 特 征 结 果 絮凝体大小 大；中；小 絮凝体形态 圆形； 不规则 絮凝体结构 开放； 封闭 絮凝体密度 紧密； 疏松 丝菌体数量 〇;±;+; ++; +++ 游离细菌 极少；少量；多 优势种 数量及状态 微型 动物 其它种 数量、种类、状态 六、思考题 1. 怎样通过了解微型动物种类或数量变化，来反映废水处理情况？

2. 试比较生活污水中活性污泥与工业废水处理系统中的活性污泥性状以及 微型动物的种类、数量等有何差异?

实验五 空气、土壤中微生物的检测

一、目的要求

1. 了解一定环境空气中微生物的分布情况，学习并掌握检定和计数空气微 生物的基本方法。

2. 学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。 二、基础知识

1. 空气微生物（air microorganisms）

由于空气中没有可为微生物直接利用的营养物质和足够的水分， 它不是微生物生长繁殖的天然环境，因此空气中没有固定的微生物种类。存在于空气中的微生物是主要的空中浮游生物。它主要通过土壤尘埃、小水滴、人和动物体表的于燥脱落物、呼吸道的排泄物等方式被带人空气。由于微生物能产生各种休眠体，故可在空气中存活相当长的时期而不至死亡。空气中微生物的种类，主要为真菌和细菌。例如有附着于尘埃上的从地面飞起的球菌属（包括八叠球菌属在内的好氧菌） ，形成孢子的好氧性杆菌（如枯草芽孢杆菌） ，色串孢属等野生酵母，青霉等霉菌的孢子等。其数量则取决于所处的环境和飞扬的尖埃量。 2. 土壤微生物（soil microorganisms）

土壤是微生物生活最适宜的环境、 它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件。土壤微生物的种类很多，有细菌、真菌、放线菌、藻类 和原生动物等。土壤微生物的数量也很大，l 克土壤中就有几亿到几百亿个。l 亩地耕层土壤中，微生物的重量有几百斤到上千斤。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。

三、实验材料

1. 肉膏蛋白胨琼脂培养基 （培养细菌） ， 高氏一号琼脂培养基 （培养放线菌） ，查氏培养基（培养霉菌） 。

2. 无菌水，移液管，试管，锥形瓶，培养皿，培养箱、高压灭菌锅，气体 流量计，天平、称量纸。 3. 土壤样品。 四、实验方法和步骤

（一）空气中微生物的检测 1．沉降法

（1）将肉膏蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基溶化后，各倒四个平板。 （2） 将上述三种培养皿各取二个， 在室外打开皿盖， 分别暴露于空气中 5min、10 min。另二个培养皿在实验室空气中分别暴露 5min、10min。

（3）肉膏蛋白胨平板于 37℃，倒臵培养 1 天；查氏琼脂平板和高氏一号琼脂平板倒臵于 28℃培养分别培养 3～4 天和 7～10 天后各自计算其菌落数，观察 菌落形态、颜色。

（4）计算每 m3空气中微生物的数量。 奥梅梁斯基曾建议：面积为 100cm2的平板培养基，暴露在空气中 5min 相当于 10 升空气中的细菌数。计算公式如下：

N1001003X(个/m空气) 2r2．筛孔采样法

将四个细菌培养基平板和采样仪器带到受试环境，开启采样仪，调好空气流量，根据流量确定采样时间，关上电源。

将细菌培养基平板放入采样器中，调好采样时间后立即接通电源。到时后，取出平皿，并立即盖好皿盖。 将平板放于培养箱内 37℃培养 1 天，观察计数平皿中的菌落数。 根据下式计算 1m3空气中细菌数。 式中X为1m3空气中的细菌数；N 为平皿上的平均菌落数；L 为采样空气体积（升） 。

（二）土壤微生物检测

1. 土壤样品的梯度稀释 取新鲜土壤样品 1g，在酒精灯火焰旁加到一个装有 99mL 无菌水的锥形瓶中（锥形瓶内装有几个玻璃珠） ，将锥形瓶依左右方向振荡数十次使土与水充分混合，将菌分散，即为 10-2菌液。然后取改样品然后再按实验六的方法将菌悬液进 一步稀释。一直稀释到合适的稀释倍数（使接种 1mL 菌液的培养皿平板上出现 30～300 个菌落。

2. 根据样品中各种微生物的数量选择合适的稀释度， 每种选择三个稀释度， 每个稀释度设两个重复。

选择出合适的稀释度后，用移液管将悬液 1mL 转移到培养皿中。

（3）将已灭菌的培养基融化后冷却至 45℃（温度过高，培养皿盖上凝结水太多 菌易被冲掉；温度过低，则培养基凝固，不易倒出） 。右手拿培养基，左手把 盖打开一小缝倾入培养基 15～20mL，迅速盖皿盖，平放桌上，轻轻旋转，使培 养基和土壤悬浮液充分混匀， 凝固后， 制成平板， 将培养皿倒臵于培养箱中培养。

（4）分离放线菌时，在制备平板前在培养基中加入 5％的酚溶液 2 滴，以抑 细菌生长，于 25～30℃培养箱中培养 7～10 天观察。 霉菌分离，在制备平板前在培养基中加入 80％的乳酸数滴，于 25～30℃培 养箱中培养 3～4 天观察。细菌在 37℃培养 24 小时观察。 五、实验报告

1. 记录空气中微生物的种类和相对数量，将结果填入下表中。 菌落结果 细菌 霉菌 放线菌 室内 5min 10min 室外 5min 10min 2. 记录土壤中微生物的种类和菌落特征，将结果填入下表中。 菌落结果 生长形状 菌落光泽 表面光泽 培养温度 培养时间 细菌 放线菌 霉菌 3. 根据平皿上菌落数与平皿内土壤悬液的稀释倍数算得每 g 土壤中微生物的数量

N（个/克土）=平均菌落数稀释倍数

1土壤含水率六、思考题

1. 用稀释法进行微生物计数时，怎样保证准确并防止污染？

2. 为什么在霉菌计数时要加入几滴 80％的乳酸？加在什么地方？ 3. 为什么在放线菌计数时要加入 5％的酚？加在什么地方？ 4. 比较空气微生物检测两种方法的优缺点。