细菌生物膜与导管伴生感染相关性的研究

沈阳医学院学报Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ第ｌ２卷第３期２０１０年９月　・１３３・　细菌生物膜与导管伴生感染相关性的研究　刘新　，王岚　，刘颖　，张晓科。　（１．沈阳医学院基础医学院病原生物学研究室，辽宁省环境污染与微生态学重点实验室，辽宁沈阳１１００３４；２．解放军沈阳２０２医院干诊　科；３中国医科大学附属第一医院重症监护病房）　［摘要］目的：探讨细菌生物膜在置入导管伴生感染中的作用。方法：对置入性导管于撤除导管时行导管内细菌检查及分　离培养，用结晶紫和阿利新蓝染色法对细菌生物膜进行定位及定量检测，分析导管细菌生物膜形成与导管伴生感染的关　系。结果：患者置入性导管细菌生物膜阳性率为６１．２９％（３８／６２），染色技术可用于观察导管内细菌生物膜形成情况。结　论：细菌生物膜形成是置入导管伴生感染的重要致病因素，染色技术简便快速，可作为临床快速诊断的方法。　［关键词］生物膜；导管；伴生感染　［中图分类号］Ｒ３７８　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００８—２３４４（２０１０）０３—０１３３—０３　Ｔｈｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｂｉｏｆｉｌｍ　ｗｉｔｈ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｔｈｔｅｒ　ＬＩＵ　Ｘｉｎ　，ＷＡＮＧ　Ｌａｎ　，ＬＩＵ　Ｙｉｎｇ　，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ．ｋｅ。　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｂｉｚｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１　１００３４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｄｒｅｓ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｐｅｏｐｌｅ　Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ　Ａｍｙ　２０２　Ｈｏｓｐｉｔｌ；３．ＩＣＵ，Ｔｈｅ　Ｆｉａｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｉｒａｌ　ｂｉｏｉｆｌｍ　ｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｃａｔｈｅｔｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｃａｔｈｅｔｅｒ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｒｅｍｏｖｉｎｇ　ｃａｔｈｅｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｖｉｏｌｅｔ　ａｎｄ　Ａｌｃｉａｎ　Ｂｌｕｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｂｉｏｆｆｌｍ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｂｉｏｆｆｌｍ　ｗｉｔｈ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｈｅｔｅｒ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｌ　ｂｉａｏｆｉｌｍ　ｉＮ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｃａｔｈｅｔｅｒ　ｗａｓ　６１．２９％（３８／６２）．Ｔｈｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｉｎ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｃａｔｈｅｔｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｌ　ｂｉｏｆａｉｌｍ　ｗａｓ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｃａｔｈｅｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｆａｓｔ　ｔｈａｔ　ｃａｂ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｆａｓｔ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｂｉｏｆｉｌｍ；ｃａｔｈｅｔｅｒ；ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　现代医学技术的发展，多种侵人性的医疗器　械、生物医学材料广泛应用，如传统的导尿管、　子宫节育环、中心静脉导管、新型的人工心脏瓣　膜、各种支架、角膜接触镜等，这些器械和材料　的应用，在解决了原有医疗问题的同时，许多引　１材料与方法　１．１材料２００９年７月至２０１０年６月，采集来　自沈阳市多家医院病房患者包括导尿管、呼吸机　导管及手术的引流管等标本，共６２例（临检已判　定有感染，病原菌主要包括铜绿假单胞菌、鲍曼　发了伴生感染（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）　，此种现象　在有置人性导管者表现尤为突出有研究发现，细　菌容易粘附于塑料输液管内表面，形成细菌生物　膜（ｂｉｏｆｉｌｍ），难以冲洗清除　ｊ。为了解细菌生物　膜与置人性导管伴生感染相关性，我们对医院实　施置入性导管进行检查或治疗的患者撤出导管时　进行细菌检查、分离培养及生物膜形成的研究，　现将结果报道如下。　［基金项目］辽宁省教育厅基金课题（Ｎｏ．２００９Ａ７０２）　［作者简介］刘新（１９６１一），女（汉）．教授．研究方向：医院　感染与环境微生态学．　不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、金黄色　葡萄球菌及表皮葡萄球菌），无菌操作下，将近人　体端１ａｍ导管外壁７０％酒精涂抹消毒后，纵向剪　开，接种环灭菌刮取内壁后接种于ＬＢ肉汤培养基　中增菌，３７ｑＣ过夜，然后用其肉汤分别接种于血　平板、麦康凯培养基上，可疑鲍曼不动杆菌转种　于青霉素・诺氟沙星培养基上培养。　１．２菌种鉴定　１．２．１初步鉴定过夜培养的肉汤直接涂片，革　兰染色；平板上可疑菌落触酶试验、氧化酶、甘　沈　阳　医　学　院　学　报　第１２卷　露醇试验、硝酸盐还原动力试验及明胶酶试验。　株，其中鲍曼不动杆菌４３例（３１．３９％），铜绿假　然后转种相应培养基，纯化。　１．２．２菌种鉴定及生物膜模式株筛选　经初步鉴　定的菌种，采用生物一梅里埃公司ＡＴＢ生化鉴定　分析仪，按ＩＤ　３２　ＧＮ革兰阴性杆菌鉴定试条　（Ｒｅｆ．３２　１００）、ＩＤ　３２　ＳＴＡＰＨ葡萄球菌鉴定试条　（Ｒｅｆ．３２　５００）及ＩＤ　３２　Ｃ酵母菌鉴定试条（Ｒｅｆ．　单胞菌４ｌ例（２９．９３％），大肠埃希菌２２例　（１６．０５％），葡萄球菌属ｌ４例（１０．２２％），肺炎　克雷伯菌１０例，真菌４例（４／１３７，２．９２％），其　它７例（５．１　１％），有１１例标本有多种细菌混合　感染。ＡＴＢ生化鉴定菌株：鲍曼不动杆菌、铜绿　假单胞菌的纯度达９９．９％。　２．２生物膜定性６２例临床标本中有３８例在刚　果红培养基不同程度菌落呈深红色，为产生生物　膜的菌株，阳性率为６１．２９％。另２４例菌在刚果　红培养基培养，菌落始终为无色。采用阿利新蓝　一３２　２００）说明书进行鉴定到种。将临床标本中分离　纯化的菌株在刚果红培养基培养　Ｊ，产生生物膜　的菌株菌落呈深红色，非模式株菌落为无色。　１．３生物膜形态观察　１．３．１　细菌生物膜染色快速鉴定　根据文献　配　制生物膜染液：阿利新蓝一刚果红染液：阿利新蓝　染液：阿利新蓝２ｇ，冰醋酸３ｍ］，蒸馏水９７ｍｌ；刚　果红染液：刚果红２ｇ，蒸馏水１００ｍ］。染色方法：　接种环直接刮取导管内壁粘液涂于洁净载玻片上，　滴加１０　阿利新蓝染液，混匀，静置３～５　ｍｉｎ，火　焰加热固定，直至染液挥发完全，滴加２０　刚果红　染液，均匀涂布，火焰加热干燥后，三蒸水冲洗，　吸干水分后油浸镜（ＮＩＫＯＮ一８０１）下观察。　１．３．２细菌生物膜形态结构观察将导管标本分　别浸泡于ＬＢ肉汤中，封口膜封口防止污染，Ｉｎｎｏ—　刚果红涂片染色，生物膜型细菌因胞外多糖被　染成深红色，未成膜的细菌为黄色，背景为蓝色。　２．３　细菌生物膜的定量检测　图１表明微量板上　生物膜形成，我们发现颜色最深的孔，恰恰是刚　果红培养基上呈深色菌落的模式株。枯草杆菌不　形成生物膜为阴性对照，几乎无色。　阴性对照　阳性对照　ｖａ４０温控摇床３７ｏ【＝连续震荡培养，振幅为５０Ｈｚ，　每隔４８ｈ取出ＰＢＳ冲洗，除去浮游菌，换新培养　液，鲍曼不动杆菌持续７ｄ，其他菌持续５ｄ。振荡　培养后的引流管经２．５％戊二醛４ｃ【＝下固定２４ｈ，　ｐＨ７．２的磷酸盐缓冲液冲洗３次，再以１％的锇酸　４￣Ｃ固定２ｈ，４℃双蒸水冲洗３次，梯度乙醇脱水　（以５０％、７０％、８０％、９０％、９５％两次、１００％　三次，每次脱水时间１０ｍｉｎ），醋酸异戊酯置换，　ＣＯ　临界点干燥，离子喷金镀膜，通过ＫＹＫＹ．　３２００　ＳＥＭ扫描观察引流管内壁生物膜形态结构。　１．４生物膜定量将刚果红培养基上菌落为深红　色的菌种，初步确定形成生物膜的模式株，参照　文献　。。　用微量板进行生物膜定量检测，９６孔板于　３７℃分别培养３ｄ后取出，轻轻拍出孑Ｌ内液体，然　图１　微量板上生物膜形成　（紫色孔是生物膜形成菌株，颜色越深表明形成的膜越多）　将微量板经过酶标仪测定结果见表１。　表ｌ　细菌生物膜的定量检测　后用ＰＢＳ缓冲液冲洗四次，去除浮游菌。用１％结　晶紫染色１５ｍｉｎ，三蒸水再次冲洗，待孑Ｌ板晾干　后，向每孔内加入无水乙醇一丙酮（８０：２０　ｖ／ｖ）　２００１，ｚｌ脱色，置于酶标仪（ＢｉｏＴｅｋ　ＥＬｘ８００，美国）　２．４扫描电镜观察结果　导管内表面有膜状物质　形成，膜内可见细菌聚集于交联的纤维素样物质　上测定吸光度（ＯＤ５７０　ｎｍ）值。　２结果　中（图２　Ａ），由于枯草杆菌无胞外多糖，不能形　成生物膜，为阴性对照（图２　Ｂ），培养５ｄ的膜厚　６２例导管标本，分离出细菌１３７　度可达４．９２ｐ，ｍ（图２Ｃ）。　２．１菌种鉴定第３期　刘新等．细菌生物膜与导管伴生感染相关性的研究　・１３５・　图２导管内细菌生物膜形态结构　（Ａ导管内形成的生物膜，　Ｂ无生物膜形成的对照组，　Ｃ培养５ｄ的膜厚度）　３讨论　本研究发现有感染的患者导管内均有细菌检　出，１１例患者有多种菌混合感染，病原菌以革兰　阴性杆菌为主（１　１６／１３７，８４．６７％），其中铜绿假　单胞菌、鲍曼不动杆菌是主要致病菌，这些菌均　是临床耐药严重的菌株。　铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯　菌、大肠埃希菌属于机会致病菌，可引起呼吸道、　泌尿生殖道感染及败血症等严重感染，其中以呼　吸道感染最为常见，本研究６２例导管标本中呼吸　道感染者４４例（７０．９６％），如此高感染率，急需　快速检测方法进行诊断，我们在研究中采用结晶　紫染色方法对细菌生物膜进行定量检测，阿利新　蓝染色进行生物膜定位，这些实验技术简便快速，　可选为临床快速诊断适宜的方法。扫描电镜可直　接观察生物膜的形态特征及结构，但其实验环节　多，技术复杂并要求特殊设备，更适用于研究。　患者有侵入性导管操作时，尽管医护人员非　常注意无菌技术，但这些患者的医院感染率仍然　高于其他患者，以往的报告常限于菌群种类和耐　药性分析，而关于这些病原菌如何引起感染少有　报道，特别是ＩＣＵ患者病情重，各种侵入型导管　多，这些导管因与外界相通，为细菌粘附提供了　机会。本研究发现具有较强粘附性的机会致病菌　一旦定植于导管，在导管内的气体或液体的流动　冲刷下，容易形成生物膜（３８／６２，６１．２９％）。将　导管浸入于肉汤培养液中，摇床连续振荡，模拟　导管液体流动状态，３天即可形成不易剥离的生物　膜，提示这些细菌在医用导管内定植快，易于形　成生物膜，尤其是来源于应用呼吸机通气的通气　管，鲍曼不动杆菌形成生物膜比率更高，导致ＩＣＵ　患者呼吸道感染鲍曼不动杆菌呈逐年增多趋势。　鲍曼不动杆菌在自然环境中普遍存在，具有较强　粘附性，属于条件致病菌，置入性导管高感染率　的重要原因可能与细菌导管中快速粘附、定植形　成生物膜有关　ｊ，这应引起我们足够的重视。　参考文献：　［１］Ｌｉｎｄａ　Ｍ．Ｗｅｉｇｅｌ，Ｒｏｄｎｅｙ　Ｍ．Ｄｏｎｌａｎ，Ｄｏｎｇ　Ｈｙｅｏｎ　Ｓｈｉｎ，ｅｔ　ａ１．　Ｈｉｇｈ－　ｌｅｖｅｌ　ｖａｎｃｏｎｌｙｃｉｎ－－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｉｓｏｌａｔｅｓ　ａｓ—－　ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｂｉｏｆｉｌｍ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００７，５１（１）：２３１—２３８．　［２］刘新，梁宇寰，陈冬梅，等．惰性材料表面细菌生物膜构建　的研究［Ｊ］．中国微生态学杂志，２００９，２１（２）：１２８一　ｌ３Ｏ．　［３］张丽萍，李清，古丽娜依明，等．葡萄球菌生物膜检测及与　耐药性的关系［Ｊ］．右江医学，２００８，３６（３）：２５３—２５４．　［４］王源，丛延广，刘俊康，等．细菌胞外糖染色显微镜检测技　术［Ｊ］．中华医学检验杂志，１９９８，２１（４）：１９７—１９８．　［５］Ｎｕｒａ｜Ｃ，Ｍｅｌｅｋ　Ｄ，Ｉｌｋｎｕｒ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｐｒｏｄｕｃ—　ｔｉｏｎ，ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｍａｎｎｏｓｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｕｍａｎｎｉｉ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｎ—　ｆｅｃｔ，２００８，４１：５１３—５１８．　［６］Ｎａｏｋｏ　Ｗ，Ｊｕｎｉｃｈｉｒｏ　Ｎ，Ｊａｌａｌｕｄｄｉｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ａｓｓａｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｆｏｒ　Ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ　ｅｓｃｈｅ－　ｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｔｒｏｐ　Ｍｅｄ．Ｈｙｇ，２００４，７１（５）：６８７—　６９０．　［７］岳文香，黄绍光，饶洁，等．重症监护室鲍氏不动杆菌的分　子流行病学［Ｊ］．中华传染病杂志，２００２，２０（２）：１０８—　１０９．　［收稿日期］２０１０—０８—０７