(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104069507 A(43)申请公布日 2014.10.01
(21)申请号 201410259028.7(22)申请日 2014.06.11
(71)申请人广州吉家庄生物科技有限公司
地址510663 广东省广州市高新技术产业开
发区科学城科研路10号中德研发楼（F2）216房(72)发明人张宏斌 武婕 隆湘蕾
(74)专利代理机构广州市越秀区哲力专利商标
事务所(普通合伙) 44288
代理人汤喜友(51)Int.Cl.
C08G 63/91(2006.01)C08G 63/664(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 37/02(2006.01)
A61K 48/00(2006.01)A61K 47/34(2006.01)C08J 3/075(2006.01)C08G 81/00(2006.01)
(54)发明名称
一种高强度超分子水凝胶及其制备方法和应用(57)摘要
本发明涉及一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1）聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成；2）共聚物/核酸复合物溶液的制备；3）将步骤2）获得的共聚物/核酸复合物溶液与α-环糊精溶液混合制得高强度超分子水凝胶。本发明还涉及由上述方法制得的高强度超分子水凝胶及其应用。本发明的水凝胶的形成过程不存在化学交联反应，有效地避免了化学交联反应副产物对核酸活性的影响，具有高效的基因传递效果，制备方法方便快捷，可以室温下成型，利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性。该凝胶同时改善了目前同类凝胶材料降解较快的缺点，可长时间释放核酸2个周以上，实现了长时间持续转染的目的。
权利要求书2页 说明书10页 附图2页权利要求书2页 说明书10页 附图2页
CN 104069507 A CN 104069507 A
权 利 要 求 书
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1.一种高强度超分子水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成；2）将浓度为0.5～2.0 μg/mL的核酸溶液与质量百分比浓度为6～20%的聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物溶液混合均匀，室温条件下静置，得到共聚物/核酸复合物溶液；
3）向步骤2）所得的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为10～20%的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料。
2.如权利要求1所述的高强度超分子水凝胶的制备方法，其特征在于所述核酸溶液的浓度为1.0μg/mL。
3.如权利要求1所述的高强度超分子水凝胶的制备方法，其特征在于步骤1）中聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成方法为：
a、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的合成将干燥的聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡加入到反应装置中，利用油泵在室温条件下抽真空20-40分钟；然后将反应装置密闭，油浴或电加热至100—130摄氏度，反应12-24小时；反应结束后，将产物冷却至室温，用二氯甲烷/石油醚重结晶，40-60摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物；
b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物溶解于干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯；
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成
将聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，于40～60 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成，即聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物。
4.如权利要求3所述的超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇单甲醚，所述聚乙二醇单甲醚的重均分子量为1000、1900、5000或10000。
5.如权利要求3所述的高强度超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤a中干燥的聚乙二醇类聚合物由如下方法获得：将聚乙二醇类聚合物置于真空干燥箱中40-80摄氏度真空干燥12小时；
所述步骤a中干燥的己内酯由如下方法获得：将己内酯单体减压蒸馏；所述聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡三者的质量比为500：100—500：1；所述二氯甲烷与石油醚的体积比为3-6:1。
6.如权利要求3所述的高强度超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤b中所述二氯甲烷与吡啶的体积比为3—5:1；所述干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液通过如下方法获得：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中，室温条件下搅拌24小时后蒸馏，其中每500ml二氯甲烷或吡啶溶液中加入的氢化钙为1-2克；
所述聚乙二醇类聚合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1～3；
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权 利 要 求 书
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所述氯化氢溶液的摩尔浓度为1—3mol/L；
所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入2～5克；所述避光反应的时间为24～48小时；所述旋转蒸发操作时的温度为40～50℃。
7.如权利要求3所述的高强度超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤c中聚乙烯亚胺的重均分子量为1200、1800、2500、10000或25000；所述聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.3～2：1；每100ml去离子水含有8～16g聚乙烯亚胺；反应时间为72—96h；
透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为3000～30000。8.如权利要求1所述的高强度超分子水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤2）所述核酸的加入量按照与共聚物的质量比值为1：20～100加入，所述共聚物溶液是将聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为15～30min后获得；
步骤3）所述的α-环糊精溶液是将α-环糊精溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为1～24h后获得。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述方法制备的高强度超分子水凝胶。
10.权利要求9所述的高强度超分子水凝胶在制备可注射药物载体或可注射基因载体中的应用。
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说 明 书
一种高强度超分子水凝胶及其制备方法和应用
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[0001]
技术领域
本发明涉及一种生物医用材料领域，具体涉及一种可用做基因载体的高强度超分子水凝胶及其制备方法和应用。
[0002]
背景技术
基因治疗是指将外源基因导入细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病
以达到治疗目的，是目前用于癌症以及先天性免疫系统疾病治疗的一种有效方法。该技术实施的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，进而使基因能够在细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达。水凝胶作为一类可用作药物或基因载体的生物医用材料，具有负载率高、可保护大分子药物免受生物体的降解或清除、以及对药物分子的可持续释放等特性，近年来已被广泛用于基因的负载和控释研究。例如，Hu等首先将DNA与PEI复合得到纳米复合物，然后再将该纳米复合物负载于葡聚糖基水凝胶基质中。由于凝胶基质的控释作用，该材料具有持续转染的效果，且在血清中仍保持了良好的基因传递能力（Journal of Materials Chemistry 2009, 19: 3189-3197）。然而，这些水凝胶基因载体的形成通常离不开高温、化学交联剂或光引发剂的使用，不利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性。
[0004] 以α-环糊精为主体、通过主客体相互作用形成的超分子水凝胶，因其制备方便、不设计化学交联剂和引发剂、生物相容性好等优势，在基因载体领域有望得到广泛的应用。中国发明专利（专利号为：ZL200910213939.5）公开了一种新型超分子水凝胶基因载体，以Pluronic F-68为引发剂合成得到线性聚乙二醇—聚赖氨酸嵌段聚合物，然后再与α-环糊精组装得到水凝胶载体材料。但是该凝胶材料的基因转染效率很低，其最高实施例不超过20%，实际应用价值不大；且材料的设计较繁琐，合成步骤较多。中国发明专利（公开号：CN102634043A）利用聚乙二醇修饰阳离子聚合物，然后将所得共聚物与α-环糊精组装得到一类水凝胶载体材料。虽然该材料的基因转染效率得到了提高，但其降解太快，难以满足长时间持续释放基因药物的目的。[0005] 综上所述，如何在温和条件下方便地构建一类高强度、高效水凝胶基因载体材料用于持续的基因治疗，便成为当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。
[0003]
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种高强度超分子水凝胶的制备方法，本发明还提供由该方法制得的高强度超分子水凝胶及其应用。[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1）聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成；
[0006]
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说 明 书
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2）将浓度为0.5～2.0 μg/mL（微克每毫升）的核酸溶液与质量百分比浓度为6～20%的聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物溶液混合均匀，室温条件下静置，得到共聚物/核酸复合物溶液；
3）向步骤2）所得的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为10～20%的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料。[0008] 本发明中，优选的方案为所述核酸溶液的浓度为1.0μg/mL。[0009] 本发明中，优选的方案为步骤1）中聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成方法为：
a、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的合成将干燥的聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡加入到反应装置中，利用油泵在室温条件下抽真空20-40分钟；然后将反应装置密闭，油浴或电加热至100—130摄氏度，反应12-24小时；反应结束后，将产物冷却至室温，用二氯甲烷/石油醚重结晶，40-60摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物；
b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化（即聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯的合成）
将干燥的聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物溶解于干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯；
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成
将聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，于40～60 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成，即聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物。[0010] 本发明中，优选的方案为所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇单甲醚，所述聚乙二醇单甲醚的重均分子量为1000、1900、5000或10000。[0011] 本发明中，优选的方案为：所述步骤a中干燥的聚乙二醇类聚合物由如下方法获得：将聚乙二醇类聚合物置于真空干燥箱中40-80摄氏度真空干燥12小时；所述步骤a中干燥的己内酯由如下方法获得：将己内酯单体减压蒸馏；辛酸亚锡直接使用；所述聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡三者的质量比为500：100—500：1；所述二氯甲烷与石油醚的体积比为3-6:1。[0012] 本发明中，优选的方案为：所述步骤b中所述二氯甲烷与吡啶的体积比为3—5:1；所述干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液通过如下方法获得：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中，室温条件下搅拌24小时后蒸馏，其中每500ml二氯甲烷或吡啶溶液中加入的氢化钙为1-2克；所述聚乙二醇类聚合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1～3；所述氯化氢溶液的摩尔浓度为1—3mol/L；所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入2～5克；所述避光反应的时间为24～48小时；所述旋转蒸发操作时的温度为40～50℃。
[0013] 本发明中，优选的方案为：所述步骤c中聚乙烯亚胺的重均分子量为1200、1800、2500、10000或25000；所述聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为
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0.3～2：1；每100ml去离子水含有8～16g聚乙烯亚胺；反应时间为72—96h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为3000～30000。[0014] 本发明中，优选的方案为：步骤2）所述核酸的加入量按照与共聚物的质量比值为1：20～100加入，所述共聚物溶液是将聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为15～30min后获得；步骤3）所述的α-环糊精溶液是将α-环糊精溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为1～24h后获得。[0015] 本发明还提供一种由上述方法制备的高强度超分子水凝胶。上述高强度超分子水凝胶在制备可注射药物载体或可注射基因载体中的应用。[0016] 本发明中，阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）具有优良的基因传递效果，聚乙二醇、聚己内酯和环糊精皆具有良好的生物相容性，是少数被美国FDA批准可作为药品和食品添加剂的合成化合物之一；本发明首先利用聚乙二醇引发己内酯单体聚合得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物，该嵌段聚合物进一步与阳离子聚合物偶联得到共聚物，此共聚物通过聚乙烯亚胺链段与核酸的静电相互作用，在溶剂中形成稳定的纳米复合物；然后再通过共聚物中聚乙二醇链段与α-环糊精的主客体组装相互作用进一步得到了原位包埋基因的超分子结构水凝胶；水凝胶形成的主要作用力为环糊精组装之后的结晶作用；聚乙二醇的引入不仅可降低阳离子聚合物的细胞毒性，还可与环糊精组装形成凝胶，具有双重作用；聚己内酯链段的引入不仅增加了材料的可降解性，还可以显著提高凝胶材料的力学强度，延长其基因释放时间。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点是：
1、凝胶材料的制备方法简便快捷，可以室温下成型，对浓度及温度要求较低，利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性；
2、水凝胶的形成过程不存在化学交联反应，有效地避免了化学交联剂、引发剂及反应副产物对核酸活性的影响；
3、水凝胶的强度和凝胶化时间可通过聚合物浓度、环糊精浓度来调控；4、聚合物在体系中起着基因载体和凝胶基质的双重作用，可简化凝胶配方，节省成本；
5、本发明的水凝胶为物理凝胶，其随着生物体中液体介质的不断冲刷溶蚀，会逐渐松散至完全溶解，对核酸的释放率高；
6、聚己内酯链段的引入可增强凝胶材料的力学强度，从而实现长时间持续释放基因的目的；
7、聚己内酯链段的引入可增加材料的可降解性；8、本发明的水凝胶具有高效的基因传递效果，转染效率比现有的同类凝胶材料有明显的提高；
9、本发明的水凝胶的成分简单、生物兼容性好、转染效果明显，具备良好的剪切变稀的特性，应用方便快捷，可作为生物医学工程材料，广泛应用于制备可注射药物载体或可注射基因载体中。
[0018]
下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
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图1为聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物的核磁氢谱图；
图2为超分子水凝胶A、B、C的动态频率扫描曲线；图3为超分子水凝胶A、B、C的基因体外释放曲线；
图4为超分子水凝胶A转染大鼠成纤维细胞后的细胞的荧光照片图；图5为超分子水凝胶D、E、F的动态频率扫描曲线；图6为超分子水凝胶D、E、F的基因体外释放曲线。
具体实施方式[0020] 实施例1
一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1、聚乙二醇的干燥：将聚乙二醇在60℃条件下真空干燥24h。[0021] 2、己内酯单体的干燥：将己内酯单体在90℃条件下减压蒸馏。[0022] 3、二氯甲烷和吡啶的干燥：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中（每500ml溶液加入1－2克氢化钙），室温条件下搅拌24小时后蒸馏。[0023] 4、聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成（对应权利要求书中的“步骤1）”）；
a、聚乙二醇－聚己内酯嵌段聚合物的合成：将15克干燥的聚乙二醇（重均分子量1900）与10克己内酯单体、0.05克辛酸亚锡同时加入到反应装置中，利用油泵在室温条件下抽真空40分钟。然后将反应装置密闭，油浴或电加热至110摄氏度，反应12小时。反应结束后，将产物冷却至室温，用体积比为4/1的二氯甲烷/石油醚重结晶，40摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物。[0024] b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化（聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯的合成）：
将10克聚乙二醇—聚己内酯溶解于100毫升二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，二氯甲烷与吡啶的体积比为5:1；然后加入摩尔数为聚乙二醇2倍的对甲基苯磺酰氯，30摄氏度条件下避光反应48小时；反应结束后，反应液用等体积的2mol/L氯化氢溶液进行萃取，有机层用3克碳酸氢钠进行中和、过滤；然后于50摄氏度条件下旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯。[0025] c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成（即聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物的合成）：
将上述聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺（重均分子量25000）溶解于去离子水中，聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.5:1；该混合液于50 ℃条件下进行反应72小时；反应结束后将混合物冷却至室温，用截留重均分子量为8000的透析袋将产物在纯水中透析3天，得到聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物。[0026] 5、共聚物/核酸复合物溶液的制备（对应权利要求书中的“步骤2）”）：
将0.5微克每毫升的核酸溶液与质量百分比浓度为8%（w/w）的聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶液混合，质量比为1:80；混合均匀，静置15分钟，得到共聚物/核酸复合物溶液。[0027] 6、超分子水凝胶的形成（对应权利要求书中的“步骤3）”）：
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往上述共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为14%的α-环糊精溶液，搅拌混合，静置12小时，得到可作为基因载体材料的超分子水凝胶A。[0028] 实施例2
一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1、聚乙二醇的干燥：将聚乙二醇在60℃条件下真空干燥24h。[0029] 2、己内酯单体的干燥：将己内酯单体在90℃条件下减压蒸馏。[0030] 3、二氯甲烷和吡啶的干燥：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中（每500ml溶液加入1－2克氢化钙），室温条件下搅拌24小时后蒸馏。[0031] 4、聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成（对应权利要求书中的“步骤1）”）；
a、聚乙二醇－聚己内酯嵌段聚合物的合成：将15克干燥的聚乙二醇（重均分子量1900）与5克己内酯单体、0.05克辛酸亚锡同时加入到反应装置中，利用油泵在室温条件下抽真空40分钟。然后将反应装置密闭，油浴或电加热至110摄氏度，反应12小时。反应结束后，将产物冷却至室温，用体积比为4/1的二氯甲烷/石油醚重结晶，40摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物。[0032] b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化（聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯的合成）：
将10克聚乙二醇—聚己内酯溶解于100毫升二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，二氯甲烷与吡啶的体积比为5:1；然后加入摩尔数为聚乙二醇2倍的对甲基苯磺酰氯，30摄氏度条件下避光反应48小时；反应结束后，反应液用等体积的3mol/L氯化氢溶液进行萃取，有机层用3克碳酸氢钠进行中和、过滤；然后于50摄氏度条件下旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯。[0033] c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成（即聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物的合成）：
将上述聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺（重均分子量25000）溶解于去离子水中，聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.5:1；该混合液于50 ℃条件下进行反应72小时；反应结束后将混合物冷却至室温，用截留重均分子量为8000的透析袋将产物在纯水中透析3天，得到聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物。[0034] 5、共聚物/核酸复合物溶液的制备（对应权利要求书中的“步骤2）”）：
将0.5微克每毫升的核酸溶液与质量百分比浓度为8%（w/w）的聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶液混合，质量比为1:80；混合均匀，静置15分钟，得到共聚物/核酸复合物溶液。[0035] 6、超分子水凝胶的形成（对应权利要求书中的“步骤3）”）：
往上述共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为14%的α-环糊精溶液，搅拌混合，静置12小时，得到可作为基因载体材料的超分子水凝胶B。[0036] 实施例3
一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1、聚乙二醇的干燥：将聚乙二醇在60℃条件下真空干燥24h。[0037] 2、己内酯单体的干燥：将己内酯单体在90℃条件下减压蒸馏。
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说 明 书
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3、二氯甲烷和吡啶的干燥：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中（每500ml溶液加入1－2克氢化钙），室温条件下搅拌24小时后蒸馏。[0039] 4、聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成（对应权利要求书中的“步骤1）”）；
a、聚乙二醇－聚己内酯嵌段聚合物的合成：将15克干燥的聚乙二醇（重均分子量5000）与10克己内酯单体、0.05克辛酸亚锡同时加入到反应装置中，利用油泵在室温条件下抽真空40分钟。然后将反应装置密闭，油浴或电加热至110摄氏度，反应16小时。反应结束后，将产物冷却至室温，用体积比为4/1的二氯甲烷/石油醚重结晶，40摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物。[0040] b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化（聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯的合成）：
将10克聚乙二醇—聚己内酯溶解于100毫升二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，二氯甲烷与吡啶的体积比为5:1；然后加入摩尔数为聚乙二醇2倍的对甲基苯磺酰氯，30摄氏度条件下避光反应48小时；反应结束后，反应液用等体积的2mol/L氯化氢溶液进行萃取，有机层用3克碳酸氢钠进行中和、过滤；然后于50摄氏度条件下旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯。
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成（即聚乙二醇—聚己内酯—
聚乙烯亚胺共聚物的合成）：
将上述聚乙二醇—聚己内酯—对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺（重均分子量25000）溶解于去离子水中，聚乙二醇-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.5:1；该混合液于50 ℃条件下进行反应72小时；反应结束后将混合物冷却至室温，用截留重均分子量为8000的透析袋将产物在纯水中透析3天，得到聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物。[0042] 5、共聚物/核酸复合物溶液的制备（对应权利要求书中的“步骤2）”）：
将0.5微克每毫升的核酸溶液与质量百分比浓度为8%（w/w）的聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶液混合，质量比为1:80；混合均匀，静置15分钟，得到共聚物/核酸复合物溶液。[0043] 6、超分子水凝胶的形成（对应权利要求书中的“步骤3）”）：
往上述共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为14%的α-环糊精溶液，搅拌混合，静置12小时，得到可作为基因载体材料的超分子水凝胶C。[0044] 实施例4
一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1）聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成；2）将浓度为1.0μg/mL的核酸溶液与质量百分比浓度为6%的聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物溶液混合均匀，室温条件下静置，得到共聚物/核酸复合物溶液；
3）向步骤2）所得的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为10%的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料。
[0041] [0045]
其中步骤1）中聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成方法为：
a、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的合成将干燥的聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡加入到反应装置中，利用油泵在室
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温条件下抽真空20分钟；然后将反应装置密闭，油浴或电加热至100摄氏度，反应12小时；反应结束后，将产物冷却至室温，用二氯甲烷/石油醚重结晶，40摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物；
b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物溶解于干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯；
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成
将聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，于40 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成，即聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物。[0046] 其中所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇单甲醚，所述聚乙二醇单甲醚的重均分子量为1000。
[0047] 其中所述步骤a中干燥的聚乙二醇类聚合物由如下方法获得：将聚乙二醇类聚合物置于真空干燥箱中40摄氏度真空干燥12小时；所述步骤a中干燥的己内酯由如下方法获得：将己内酯单体减压蒸馏；所述聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡三者的质量比为500：100：1；所述二氯甲烷与石油醚的体积比为3:1。
[0048] 其中所述步骤b中所述二氯甲烷与吡啶的体积比为3:1；所述干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液通过如下方法获得：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中，室温条件下搅拌24小时后蒸馏，其中每500ml二氯甲烷或吡啶溶液中加入的氢化钙为1克；所述聚乙二醇类聚合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1；所述氯化氢溶液的摩尔浓度为1mol/L；所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入2克；所述避光反应的时间为24小时；所述旋转蒸发操作时的温度为40℃。
[0049] 其中所述步骤c中聚乙烯亚胺的重均分子量为1200；所述聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为0.3：1；每100ml去离子水含有8g聚乙烯亚胺；反应时间为72h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为3000。[0050] 其中步骤2）所述核酸的加入量按照与共聚物的质量比值为1：20加入，所述共聚物溶液是将聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为15min后获得。
实施例5
一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1）聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成；2）将浓度为2.0 μg/mL的核酸溶液与质量百分比浓度为20%的聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物溶液混合均匀，室温条件下静置，得到共聚物/核酸复合物溶液；
3）向步骤2）所得的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为20%的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料。[0052] 其中步骤1）中聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成方法为：
a、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的合成
[0051]
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将干燥的聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡加入到反应装置中，利用油泵在室温条件下抽真空40分钟；然后将反应装置密闭，油浴或电加热至130摄氏度，反应24小时；反应结束后，将产物冷却至室温，用二氯甲烷/石油醚重结晶， 60摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物；
b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物溶解于干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯；
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成
将聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，于60 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成，即聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物。[0053] 其中所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇单甲醚，所述聚乙二醇单甲醚的重均分子量为10000。
其中所述步骤a中干燥的聚乙二醇类聚合物由如下方法获得：将聚乙二醇类聚合
物置于真空干燥箱中80摄氏度真空干燥12小时；所述步骤a中干燥的己内酯由如下方法获得：将己内酯单体减压蒸馏；所述聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡三者的质量比为500：500：1；所述二氯甲烷与石油醚的体积比为6:1。
[0055] 其中所述步骤b中所述二氯甲烷与吡啶的体积比为5:1；所述干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液通过如下方法获得：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中，室温条件下搅拌24小时后蒸馏，其中每500ml二氯甲烷或吡啶溶液中加入的氢化钙为2克；所述聚乙二醇类聚合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1: 3；所述氯化氢溶液的摩尔浓度为3mol/L；所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入5克；所述避光反应的时间为48小时；所述旋转蒸发操作时的温度为50℃。
[0056] 其中所述步骤c中聚乙烯亚胺的重均分子量为25000；所述聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为2：1；每100ml去离子水含有16g聚乙烯亚胺；反应时间为96h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为30000。[0057] 其中步骤2）所述核酸的加入量按照与共聚物的质量比值为1： 100加入，所述共聚物溶液是将聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为30min后获得。[0058] 实施例6
一种高强度超分子水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1）聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成；2）将浓度为1.5μg/mL的核酸溶液与质量百分比浓度为15%的聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物溶液混合均匀，室温条件下静置，得到共聚物/核酸复合物溶液；
3）向步骤2）所得的共聚物/核酸复合物溶液中加入等体积质量浓度为16%的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料。
[0054] [0059]
其中步骤1）中聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物的合成方法为：
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a、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的合成
将干燥的聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡加入到反应装置中，利用油泵在室温条件下抽真空25分钟；然后将反应装置密闭，油浴或电加热至120摄氏度，反应20小时；反应结束后，将产物冷却至室温，用二氯甲烷/石油醚重结晶，55摄氏度真空干燥，得到聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物；
b、聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物的活化
将干燥的聚乙二醇—聚己内酯嵌段聚合物溶解于干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应，反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤，旋转蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯；
c、聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成
将聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，于45 ℃条件下进行反应，反应结束后将混合物冷却至室温，在纯水中透析3天，得到聚乙烯亚胺接枝聚乙二醇—聚己内酯共聚物的合成，即聚乙二醇—聚己内酯—聚阳离子共聚物。[0060] 其中所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇单甲醚，所述聚乙二醇单甲醚的重均分子量为5000。
其中所述步骤a中干燥的聚乙二醇类聚合物由如下方法获得：将聚乙二醇类聚合
物置于真空干燥箱中65摄氏度真空干燥12小时；所述步骤a中干燥的己内酯由如下方法获得：将己内酯单体减压蒸馏；所述聚乙二醇类聚合物、己内酯单体、辛酸亚锡三者的质量比为500：300：1；所述二氯甲烷与石油醚的体积比为4:1。
[0062] 其中所述步骤b中所述二氯甲烷与吡啶的体积比为4:1；所述干燥的二氯甲烷与吡啶的混合溶液通过如下方法获得：将氢化钙粉加入到二氯甲烷或吡啶溶液中，室温条件下搅拌24小时后蒸馏，其中每500ml二氯甲烷或吡啶溶液中加入的氢化钙为1.5克；所述聚乙二醇类聚合物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:2；所述氯化氢溶液的摩尔浓度为2mol/L；所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入4克；所述避光反应的时间为36小时；所述旋转蒸发操作时的温度为45℃。
[0063] 其中所述步骤c中聚乙烯亚胺的重均分子量为10000；所述聚乙二醇—聚己内酯-对甲苯磺酸酯与聚乙烯亚胺的质量比为1.5：1；每100ml去离子水含有10g聚乙烯亚胺；反应时间为80h；透析操作中使用的透析袋的截留重均分子量为20000。[0064] 其中步骤2）所述核酸的加入量按照与共聚物的质量比值为1：50加入，所述共聚物溶液是将聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中，静置时间为20min后获得。[0065] 实施例7
将实施例1制到的聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物溶于重水中，进行氢谱核磁表征，结果如图1所示，化学位移出现在4.67处的峰为重水的质子峰；3.25和2.5处的峰对应的是聚乙烯亚胺上的质子峰；3.65处的质子峰为聚乙二醇链段上的质子峰；1.2、1.55、1.65和1.8处的峰对应的是聚己内酯的质子峰。图1的核磁结果证实聚乙二醇—聚己内酯—聚乙烯亚胺共聚物被成功合成。
[0061] [0066]
实施例8
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将实施例1-3所得的凝胶样品A、B和C进行动态频率扫描测试，设定温度为25摄氏度，振幅为0.1%，频率为1.0Hz。结果如图2所示，同等浓度条件下，凝胶的弹性模量依赖于聚己内酯的含量，聚己内酯的相对含量越高，凝胶的强度越大。[0067] 实施例9
将实施例1-3所得的凝胶样品A、B和C进行体外基因释放实验，将1mL凝胶样品置于37摄氏度的5mL 蒸馏水中，每隔一定的时间，取出上层1mL释放液，并补加1mL新鲜的蒸馏水。通过紫外—可见分光光度计测定释放出的基因的浓度，得到基因的体外释放曲线，如图3所示。基因的体外释放速率依赖于凝胶强度，凝胶的强度越强，基因的释放越慢。A、B和C三个样品的基因释放时间都可持续2个周以上，表明凝胶材料具有较好的稳定性，基因释放持续时间相比同类型的凝胶大大延长。[0068] 实施例10
将实施例1得到的超分子水凝胶A在磷酸盐缓冲溶液/PBS环境下进行体外释放实验，收集凝胶材料释放48、96小时时间段的释放产物，释放出的共聚物/pEGFP复合物定量后用于对大鼠成纤维细胞的转染实验，转染后的细胞的荧光照片如图4所示。凝胶样品在第48和96小时的释放产物均表现出良好的转染效果。
实施例11
取实施例4-6制得的凝胶样品，分别编为D、E和F，然后将D、E和F进行动态频率扫描测试，设定温度为25摄氏度，振幅为0.1%，频率为1.0Hz。结果如图5所示，同等浓度条件下，凝胶的弹性模量依赖于聚己内酯的含量，聚己内酯的相对含量越高，凝胶的强度越大。[0070] 实施例12
取实施例4-6制得的凝胶样品，分别编为D、E和F，然后将D、E和F进行体外基因释放实验，将1mL凝胶样品置于37摄氏度的5mL 蒸馏水中，每隔一定的时间，取出上层1mL释放液，并补加1mL新鲜的蒸馏水。通过紫外—可见分光光度计测定释放出的基因的浓度，得到基因的体外释放曲线，如图6所示。基因的体外释放速率依赖于凝胶强度，凝胶的强度越强，基因的释放越慢。A、B和C三个样品的基因释放时间都可持续2个周以上，表明凝胶材料具有较好的稳定性，基因释放持续时间相比同类型的凝胶大大延长。[0071] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
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说 明 书 附 图
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