3D打印β磷酸三钙支架复合淫羊藿苷微粒修复兔股骨头坏死

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research

www.CRTER.org

3D打印β-磷酸三钙支架复合淫羊藿苷微粒修复兔股骨头坏死 彭晨健，杜 斌，孙光权，刘 锌，薛 鹏，曹良权(南京中医药大学附属医院，江苏省南京市 210029) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1673 ORCID: 0000-0002-1314-3997(彭晨健)

文章快速阅读：

·研究原著·

3D打印β-磷酸三钙支架复合淫羊藿苷微粒修复兔股骨头坏死死骨清理术后骨缺损  micro-CT平扫 植入自体骨  苏木精-伊红染色 激素型 均行髓芯 Massion染色 植入3D打印β-兔股骨减压+死  TRAP染色 磷酸三钙支架 头坏死骨清理术  血管内皮生长因 模型 植入淫羊藿苷复子免疫组织化学 合3D打印β-磷染色 新西兰大白兔 酸三钙支架 结论： 3D打印的淫羊藿苷-β-磷酸三钙支架植入股骨头坏死兔体内，可为死骨清理后骨缺损提供支撑， 促进骨及血管形成。 文题释义：

β-磷酸三钙：具有良好的生物相容性，植入人体后能在体内降解，并在降解过程中使周围内环境富含Ca、P，其弹性模量与松质骨相近，力学强度良好，目前已被证明其是一种良好的骨修复材料。

淫羊藿苷：淫羊藿为中医传统补益扶正药，具有补肾、强筋骨、壮腰膝、益心力的作用。淫羊藿苷是在淫羊藿的茎叶中提取的，具有良好的促进骨修复及血管形成的能力，促进成骨的同时可抑制破骨细胞分化，减少骨吸收。

彭晨健，男，1993年生，湖北省襄阳市人，汉族，硕士，主要从事骨科关节与运动医学方向研究。

通讯作者：杜斌，教授，主任医师，博士生导师，南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏省南京市 210029

文献标识码:A

稿件接受：2018-12-26

摘要

背景：前期研究制备了3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架。

目的：观察3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架在兔股骨头坏死模型中的修复作用。

方法：取新西兰大白兔(南京青龙山实验动物中心提供)，制作激素型股骨头坏死模型，将造模成功的27只兔进行髓芯减压及清理死骨，随机分3组，分别植入自体骨(自体骨组)、β-磷酸三钙支架(磷酸三钙组)及3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架(复合支架组)。植入后第4，8，12周，进行股骨头micro-CT扫描及病理组织观察。

结果与结论：①micro-CT显示，植入第4周，3组植入物周围及内部均有骨小梁生成；自体骨组植入后第8周植骨区有大量骨小梁，植入后第12周骨小梁结构致密；磷酸三钙组、复合支架组支架与骨界面整合良好，复合支架组植入第4周时支架附近有一定量的骨小梁生成，至第8周时支架上有骨小梁长入，磷酸三钙组植入第4周时仅可见微量薄弱骨小梁，第8周时才可见支架周围广泛骨小梁生成，第12周时骨小梁仍较其他两组稀疏；②植入第12周苏木精-伊红染色显示，自体骨、复合支架组成骨细胞分化成熟，软骨基质较少，新生骨组织与植入物整合良好，磷酸三钙组仍存在较多的软骨基质，新生骨与植入物尚未完成整合；③植入第12周Masson染色显示，复合支架组成骨细胞增殖低于自体骨组(P < 0.05)，但高于磷酸三钙组(P < 0.05)；④植入第12周TRAP染色显示，复合支架组破骨细胞数少于磷酸三钙组(P < 0.05)，与自体骨组比较无差异(P > 0.05)；⑤植入第12周免疫组织化学染色显示，复合支架组血管内皮生长因子阳性率高于磷酸三钙组(P < 0.05)，但低于自体骨组(P < 0.05)；⑥结果表明，3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架植入股骨头坏死模型兔体内，可促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞活性，同时促进新生血管生成，具有促进兔股骨头坏死修复的作用。 关键词：

股骨头坏死；骨替代材料；骨修复；3D打印骨组织工程支架；淫羊藿苷；淫羊藿苷-β-磷酸三钙支架 主题词：

股骨头坏死；中草药；磷酸钙类；组织工程 中图分类号：R459.9；R318.08 基金资助：

江苏省卫计委中医药管理局项目(YB2015025)--控释型淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合材料对兔股骨头坏死模型骨修复影响的实验研究，项目负责人：杜斌

Peng Chenjian, Master, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Corresponding author: Du Bin, Professor, Chief physician, Doctoral

supervisor, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

2162

文章编号:2095-4344(2019)14-02162-07

Peng CJ, Du B, Sun GQ, Liu X, Xue P, Cao LQ. Three-dimensional printing beta-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin particles for repairing

osteonecrosis of the femoral head in rabbits. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(14):2162-2168. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1673

Three-dimensional printing beta-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin particles for repairing osteonecrosis of the femoral head in rabbits

Peng Chenjian, Du Bin, Sun Guangquan, Liu Xin, Xue Peng, Cao Liangquan (Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China)

Abstract

BACKGROUND: Preliminary study has prepared three-dimensional printing β-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin.

OBJECTIVE: To investigate the role of three-dimensional printing β-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin in the repair of rabbit models of osteonecrosis of the femoral head.

METHODS: New Zealand white rabbits (provided by Qinglongshan Laboratory Animal Center of Nanjing) were selected to establish the steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. The 27 model rabbits underwent core decompression and debridement, were randomly divided into three groups, and then implanted with autologous bone, β-tricalcium phosphate scaffold, three-dimensional printing β-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin (composite scaffold group), respectively. The micro-CT scanning and pathological observation were performed at 4, 8, and 12 weeks after implantation.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Micro-CT showed that at 4 weeks after implantation, trabecular bone was observed around and in

implants in each group. In the autologous bone group, there were a large number of trabecular bones in the grafting area at 8 weeks, and the trabecular bone structure was dense at 12 weeks after implantation. In the tricalcium phosphate and composite scaffold groups, the scaffolds were well integrated with the bone interface. At 4 weeks after implantation, there was a certain amount of trabecular bone surrounding the scaffold, and trabecular grew into the scaffold until 8 weeks in the composite scaffold group. At 4 weeks after implantation, few thin trabecular bone was visible, and extensive trabecular bone formation was observed around the scaffold at 8 weeks in the tricalcium phosphate group. (2) Hematoxylin-eosin staining results showed that there were many mature osteoblasts, and few cartilage matrix, newly born bones integrated well to the implants at 12 weeks in the autologous bone and tricalcium phosphate groups. In the composite scaffold group, there were many cartilage matrixes, and newly born bones integrated poorly to the implants. (3) Masson staining showed that at 12 weeks after implantation, the osteogenic capacity in the composite scaffold group was lower than that in the autologous bone group (P < 0.05), but higher than that in the tricalcium phosphate group (P < 0.05). (4) TRAP staining results at 12 weeks after implantation revealed that the amount of osteoclast in composite scaffold group was less than that in the tricalcium phosphate group (P < 0.05), and was not significantly different from the

autologous bone group (P > 0.05). (5) Immunohistochemical staining at 12 weeks after implantation revealed that the positive rate of vascular endothelial growth factor in the composite scaffold group was higher than that in the tricalcium phosphate group (P < 0.05), and lower than that in the autologous bone group (P < 0.05). (6) In summary, three-dimensional printing β-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin implanted into the rabbit model of osteonecrosis of the femoral head can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts, inhibit the viability of osteoclasts, promote the angiogenesis, and contribute to the repair of osteonecrosis of the femoral head in rabbits. Subject headings: Femur Head Necrosis; Drugs, Chinese Herbal; Calcium Phosphates; Tissue Engineering

Funding: the Administration of Chinese Medicine of Health and Family Planning Commission of Jiangsu Province, No. YB2015025 (to DB)

0 引言 Introduction

股骨头骨坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是一种难治性进展性骨科疾病，随着病情进展及股骨头内力学环境的改变，最终导致股骨头塌陷，全髋关节置换是改善其功能的唯一有效的方法[1-2]。因此对于尚未出现明显塌陷的患者，进行髓芯减压死骨清理打压植骨，可在一定程度上恢复股骨头内的力学环境并为骨修复提供载体，延缓或避免髋关节置换[3]。

髓芯减压死骨清理联合骨移植是保髋手术主要方法之一，髓芯减压死骨清理可降低股骨头内压力，改善局部血运；在死骨清理完成后，根据患者的坏死范围需要进行不同程度的植骨[4-6]。在移植骨材料中，β-磷酸三钙具有良好的生物相容性，植入人体后能在体内降解，并在降解过程中使周围内环境富含Ca、P，其弹性模量与松质骨相近，力学强度良好，目前已被证明是一种良好的骨修复材料[7-8]。但与自体骨相比，β-磷酸三钙支架缺乏骨诱导因子，因此其诱导骨生成的能力较差[9]。淫羊藿苷为中医传统补益药淫羊藿的提取物，已被证明具有良好的促进骨修复及血管形成能力[10-11]。

研究采用前期制备的3D打印β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架作为兔股骨头坏死模型骨组织修复工程材料[12]，与

P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org

自体骨和β-磷酸三钙支架进行比较，以观察其治疗股骨头坏死的疗效，为组织工程技术治疗骨坏死提供理论与实验依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年7月至2018年3月在江苏省中医院动物实验中心完成。

1.3 材料 聚丙烯酸钠(北京绿源伯德生物科技有限公司)；β-磷酸三钙(中国昆山华侨科技新材料公司)；羟甲基丙烯纤维素(上海榕柏生物技术有限公司)；淫羊藿苷微粒(中国上海纯优生物科技公司)；聚乳酸/二甲基甲酰胺溶液(中国济南岱罡生物工程公司)；明胶(上海榕柏生物技术有限公司)。

实验动物：CV级雄性新西兰大白兔40只，体质量2.6-3.0 kg，兔龄3.0-3.5个月，均同批采购于南京青龙山实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2012-0046。实验过程中对动物处置按照2006年科技部的《关于善待实验动物的指导性意见》进行[13]。

实验用主要试剂及仪器：马血清(500 mL，Gibco，美国)；地塞米松磷酸钠注射液(1 mL：5 mg，湖北药业有限

2163

彭晨健，杜斌，孙光权，刘锌，薛鹏，曹良权. 3D打印β-磷酸三钙支架复合淫羊藿苷微粒修复兔股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究，2019，23(14):2162-2168. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1673

公司)；青霉素G、庆大霉素(山东鲁抗药业有限公司)；核磁共振3.0 (Siemens，德国)；苏木精-伊红染液(武汉谷歌生物科技公司)；Masson三色染液(北京雷根生物有限公司)；DAB(碧云天生物有限公司)；Anti-VEGF抗[VG-1] (ab1316，艾博抗(上海)有限公司)；脱水机(JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司)；石蜡包埋机(JB-P5，上海徕卡仪器有限公司)；石蜡超薄切片机(RM2016，武汉俊杰电子有限公司)；冻台(JB-L5，武汉俊杰电子有限公司)；组织摊片机(KD-P，浙江省金华市科迪仪器有限公司)；烤箱(DHG-9140A，上海慧泰仪器制造有限公司)；生物正置光学显微镜(Nikon Eclipse CI，日本尼康有限公司)；成像系统(Nikon DS-U3，日本尼康有限公司)；恒温培育箱(DNP-9022，上海精宏设备公司)；Image-pro plus 6.0(IPP，Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA)。 1.4 实验方法

1.4.1 造模 按照课题组前期研究的造模方法造模[14]，采用高剂量马血清20 mL/kg静注联合地塞米松10 mg/kg肌注的方法诱导股骨头坏死模型，期间予以青霉素80×104 U及庆大霉素8×104 U肌肉注射预防感染，泮托拉唑40 mg静脉注射护胃。具体步骤：①连续3周，每周经耳缘静脉注射一次马血清(20 mL/kg)；②最后一次马血清注射完后当日开始肌注地塞米松10 mg/kg，1次/d，左右臀肌交替注射 4 d。

注射结束后，采用MRI检查评判造模结果。对所有兔进行3.0T髋关节MRI检查，将MRI显示头内或头颈交界区出现T1低信号，T2高信号，压脂像高信号作为判断标准来诊断兔子是否出现股骨头坏死，见图1。实验已通过江苏省中医院动物实验中心伦理委员会批准。

1.4.2 3D打印β-磷酸三钙支架及淫羊藿苷微粒的准备 通过观察测量兔股骨头大小，使用Solidwords2015建模软件建模，以去离子水、聚丙烯酸钠、β-磷酸三钙、羟甲基丙烯纤维素等材料配制打印浆料，应用3D打印机制备成型间距为0.6 mm、规格为3.5 mm×3.5 mm×3.5 mm的支架，按照课题前期研究的方法进行支架制备[12]。支架介绍，见表1。

表 1 复合淫羊藿苷/聚乳酸缓释微粒的多孔β-磷酸三钙支架材料 Table 1

Three-dimensional printing β-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin particles

指标 复合淫羊藿苷/聚乳酸缓释微粒的多孔β-磷酸三钙支架材料 吸水率(%) 25.09±0.96 孔隙率 (%) 66.93±2.84 抗压强度 (MPa) 2.98±0.78 包封率(%) 78.87±2.31 载药率 (%) 6.04±1.00

淫羊藿苷微粒采取超声乳化溶剂透析法制备。在0 ℃及超声条件下，将聚乳酸/二甲基甲酰胺溶液加到淫羊藿苷/

2164

二甲基甲酰胺溶液中，超声10 min。在相同条件下将聚乙烯醇溶液(10 g/L)缓慢滴入混合溶液以进行乳化操作，超声15 min后得到淫羊藿苷聚乳酸复乳，再透析12 h，去除二甲基甲酰胺。10 000 r/min离心28 min，弃上清液后PBS清洗2次，即得到淫羊藿苷/聚乳酸微球混悬液。最后将所得混悬液离心并收集沉淀。

将支架放入试管，加入5 mL淫羊藿苷/聚乳酸混悬液并轻微震荡混匀，4 000 r/min离心15 min后弃上清。管中加入5 mL 10%明胶溶液，2 000 r/min离心10 min，得到复合淫羊藿苷/聚乳酸缓释微粒的多孔β-磷酸三钙支架。 1.4.3 实验分组与治疗 造模成功后，选取27只模型兔行髓芯减压死骨清理+骨移植，按植入物的不同随机分为3组，自体骨组、磷酸三钙组及复合支架组，每组9只，使用苦味酸标记区选取左下肢为手术区域。

所有手术均由同一术者主刀完成。造模兔术区备皮麻醉后，予80×104 U青霉素臀肌注射预防感染，取侧卧位，常规消毒、铺巾，在兔股骨头大转子前侧做一长约4 cm切口，逐层钝性分离，拉钩牵开肌肉后进入关节囊，手术刀切开关节囊，尽量不破坏股骨头血供；暴露大转子后，轻微外展外旋股骨即可暴露股骨头颈交界处，使用1 mm细克氏针定位，进针点为头颈交界区，方向对准股骨头负重区，首先进针2 mm作为标志，以该标志确定磨钻打磨中心及方

向，为防止将股骨头打裂，打磨深度最深约6 mm；打磨完成后，磷酸三钙组及复合支架组将β-磷酸三钙支架、复合入淫羊藿苷/聚乳酸缓释微粒的多孔β-磷酸三钙支架分别植入该孔隙，自体骨组还需取自体髂骨，步骤为在髂嵴处做一1.5 cm横行切口，暴露髂骨，去除髂骨表面皮质骨后，使用咬骨钳取少量髂骨，将自体髂骨植入股骨头内。活动股骨，确保各组植入物卡压牢靠，逐层缝合皮下组织及皮

肤，无菌敷料盖住伤口。术后常规使用青霉素80×104 U及庆大霉素8×104 U臀肌注射，预防感染，每日换药1次，持续3 d，观察兔生命体征，在术后12周内所有兔均存活。具体手术操作见图2。

在术后第4，8，12周时，每组随机取出3只兔，耳缘静脉空气注射处死，取股骨头标本。 1.5 主要观察指标

兔股骨头micro-CT平扫：标本取材完毕后行micro-CT扫描(Siemens，德国，型号Inveon)，导出数据并进行软件处理测量相应参数，分别记录区域内骨小梁体积/总体积数值、骨小梁厚度、骨小梁数目和骨小梁间隙。

组织学观察：病理组织标本经处理后，分别进行苏木精-伊红染色、Masson染色、TRAP染色和血管内皮生长因子免疫组织化学检测。染色组织切片使用显微镜镜检并采集图像，应用Image-Pro Plus 6.0软件计数分析。 1.6 统计学分析 实验数据均使用SPSS 23.0软件进行统计处理，计量资料用x_

±s表示，计数资料采用卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

Peng CJ, Du B, Sun GQ, Liu X, Xue P, Cao LQ. Three-dimensional printing beta-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin particles for repairing

osteonecrosis of the femoral head in rabbits. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(14):2162-2168. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1673

2 结果 Results

2.1 实验动物数量分析 造模期间死亡2只兔，均为腹泻死亡。造模结束后，对兔子进行MRI影像学评价，头内或头颈交界区出现T1低信号，T2高信号，压脂像高信号作为判断标准来诊断兔子是否出现股骨头坏死。选用40只兔进行造模，共31只兔子造模成功，造模成功率为77.5%，选取1只行股骨头苏木精-伊红染色，显示骨小梁结构紊乱、断裂，伴有纤维结构增生。随机选取27只造模成功兔作为实验对象。

2.2 micro-CT影像学分析 自术后第4周起，3组植入物周围及内部均有骨小梁生成。自体骨组4周后植骨区边缘即可见点状高密度影，为自体骨与周围骨组织的爬行替代产生的新生骨，术后8周植骨区有大量骨小梁，术后12周骨小梁结构致密，提示强度良好。磷酸三钙组、复合支架组支架与骨界面整合良好，且随术后时间延长，支架周围骨小梁逐渐增多，排列有序；复合支架组在第4周时即可见支架附近有一定量的骨小梁生成，至第8周时可见支架上有骨小梁长入；磷酸三钙组在术后第4周时仅可见微量薄弱骨小梁，第8周时才可见支架周围广泛骨小梁生成，12周时骨小梁仍较其余两组稀疏，见图3。除磷酸三钙组术后第8周有1只发生股骨头塌陷外，其他支架始终显示其形态学结构稳定，表明支架力学强度良好，同时具有较好的骨传导性和生物相容性。

通过测定以下4种植入物-宿主骨区域骨小梁参数判断骨修复情况：①新生骨量：即植入物与骨交界区骨小梁体积占总体积的百分比。随着时间的推移，3组新生骨量有所增加。复合支架组术后不同时间点的新生骨总量多于磷酸三钙组(P=0.002，0.009，0.006)，但仍少于自体骨组(P=0.007，0.011，0.027)；②新生骨小梁厚度：随着术后时间延长，3组新生骨小梁厚度均有所增加。术后第4，8周时，自体骨组新生骨小梁厚度较复合支架组高(P < 0.05)，但第12周时两组间无差异。复合支架组术后不同时间点的新生骨小梁厚度均显著高于磷酸三钙组；③新生骨小梁数目：复合支架组术后不同时间点的新生骨小梁显著多于磷酸三钙组(P < 0.05)、少于自体骨组(P < 0.05)。④新生骨小梁间隙：术后第4周时，磷酸三钙组新生骨小梁间隙较自体骨组、复合支架组大(P < 0.05)，自体骨组术后第8，12周的新生骨小梁间隙小于复合支架组(P < 0.05)，磷酸三钙组术后第4，8，12周的新生骨小梁间隙均显著大于复合支架组(P < 0.05)，见图4。 2.3 组织学观察结果

2.3.1 苏木精-伊红染色 术后第4周时，自体骨组交界区骨陷窝内有较多细胞核较大的成熟成骨细胞，骨小梁排列较规则；磷酸三钙、复合支架组骨小梁排列不规则，细胞较为幼稚，复合支架组可见较多软骨基质及蓝染细胞，提示软骨化骨过程较为活跃，而磷酸三钙组显示较多的纤维组织增生。术后第8周时，自体骨组、复合支架组存在较多

P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org

软骨细胞，空骨陷窝较少，有较多成熟骨小梁；磷酸三钙组新生骨小梁及软骨基质较少，空骨陷窝较4周时减少。术后第12周时，自体骨组、复合支架组细胞分化成熟，细胞核规则，软骨基质减少，新生骨组织与植入物整合良好，局部骨小梁致密有序；磷酸三钙组骨小梁排列较为有序，仍存一定软骨基质，新生骨与植入物尚未完成整合。 2.3.2 Masson染色 术后4周时，自体骨组骨表面成骨细胞明显可见，软骨细胞及软骨基质较多；复合支架组骨组织表面可见少量成骨细胞，并见大量幼稚软骨细胞；磷酸三钙组成骨细胞更少，未见软骨样基质及软骨细胞。术后第8周时，自体骨组植骨区与自体骨界限模糊，大量骨小梁生成，染色变红；复合支架组骨表面成骨细胞稍增多，支架与骨组织间隙填充大量由蓝绿色向红色过渡的新生骨小梁；磷酸三钙组也可见骨小梁生成，但局部炎性反应较重，骨小梁间隙较大。术后第12周时，自体骨组基本已经完成爬行替代；复合支架组交界区界限稍模糊；磷酸三钙组新生骨及成骨细胞较前几周增生活跃，但交界区仍存在明显界限。在第4，8周时，复合支架组、自体骨组成骨细胞数比较无明显差异(P > 0.05)，但都显著高于磷酸三钙组(P=0.009，0.006)；术后第12周时，复合支架组成骨细胞增殖弱于自体骨组(P=0.023)，但仍高于磷酸三钙组(P=0.011)，见图5。

2.3.3 TRAP染色 随着时间的推移，3组破骨细胞数目减少，复合支架组术后不同时间点的破骨细胞数均明显少于磷酸三钙组(P=0.001，0.006，0.035)，与自体骨组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

2.3.4 血管内皮生长因子免疫组织化学染色 复合支架组术后第4，8，12周的血管内皮生长因子阳性率均显著大于磷酸三钙组(P=0.003，0.009，0.019)，但均低于自体骨组，见图7。

3 讨论 Discussion

研究证实通过3D打印制备的β-磷酸三钙支架及β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架，对兔股骨头坏死均具有一定的治疗价值，某些方面支架的疗效接近自体骨植骨。由于自体骨具有很多局限性，如供区并发症、数量有限、手术时间延长等[15]，因此植骨替代材料一直是研究的热点。以往有很多类型的内植物材料被用于股骨头坏死减压及死骨清理后的填充植骨，例如钽金属块和钛网架等[16-17]。但所有的内植物形态是均一的，并不能根据临床坏死区清理范围而改变支架的形状，这就经常造成内植物在植入后发生不匹配，进而产生应力集中，造成骨修复不均和支撑失败[18]。以往的支架仅提供单一的骨传导作用，并无骨诱导能力。为了解决以上问题，作者运用3D打印技术制作了β-磷酸三钙骨组织支架。β-磷酸三钙的弹性模量与松质骨相当，不容易产生应力集中，且可被降解，具有良好的生物相容性。在生物力学测试中发现，该多孔支架具有类似股骨头内松

2165

彭晨健，杜斌，孙光权，刘锌，薛鹏，曹良权. 3D打印β-磷酸三钙支架复合淫羊藿苷微粒修复兔股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究，2019，23(14):2162-2168. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1673

图注：图中A示股骨头信号均匀，髋关节无明显积液；B示骨髓水肿严重， 信号异常，髋关节积液较多，见箭头示；C示股骨头信号不均，呈股骨头坏死特征性“双线征”，见箭头示。

图1 兔股骨头坏死MRI表现

Figure 1 MRI performance of rabbit osteonecrosis of the femoral

head

复合支架组 磷酸三钙组 自体骨组 4周 8周 12周

A B C

D

E F

图注：图中A为克氏针定位，B为磨钻孔隙，C为植入支架，D为植

入髂骨，E为支架，F为自体骨。 图2 兔造模手术操作

Figure 2 Modeling process in rabbits

成骨细胞数目(个) 60 40 20 0

自体骨组 磷酸三钙组 复合支架组

P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05

4周 8周 12周

图注：术后第12周，复合支架组骨结合强度稍差于自体骨组，但优

于磷酸三钙组。

图3 术后不同时间点各组兔股骨头标本micro-CT扫描影像图

Figure 3 Micro-CT scanning images of rabbit femoral head samples in each group at different time points after surgery

图5 术后不同时间点各组兔股骨头标本成骨细胞计数

Figure 5 Count of osteoblasts in the rabbit femoral head samples in each group at different time points after surgery

骨小梁体积/总体积(%) 0.5 0.4 0.3

P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05

自体骨组

骨小梁厚度(μm) 磷酸三钙组 复合支架组

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0

4周 8周 12周

自体骨组

骨小梁间隙(μm) P < 0.05 P < 0.05 P < 0.05 P < 0.05 P < 0.05

磷酸三钙组 复合支架组

0.6 0.4 0.2 0

4周 8周 12周

4周 8周 12周

0.8

P < 0.05

P < 0.05 P < 0.05

P < 0.05 P < 0.05

4周 8周 12周

自体骨组 磷酸三钙组 复合支架组

P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05

自体骨组 磷酸三钙组 复合支架组

0.2 0.1 0 4

骨小梁数目(1/mm) 3

2

P < 0.05 1 0

图4 术后不同时间点各组兔股骨头标本植入物-宿主骨区域骨小梁参数

Figure 4 Trabecular parameters in the implant-host bone area of rabbit femoral head samples in each group at different time points after

surgery

2166

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

Peng CJ, Du B, Sun GQ, Liu X, Xue P, Cao LQ. Three-dimensional printing beta-tricalcium phosphate scaffold loaded with icariin particles for repairing

osteonecrosis of the femoral head in rabbits. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(14):2162-2168. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1673

25

自体骨组

P < 0.05

磷酸三钙组 20

P < 0.05

复合支架组

)个

(目15

数 P < 0.05

胞细10 骨破 5

0

4周 8周 12周

图6 Figure 6

术后不同时间点各组兔股骨头标本破骨细胞数目分析 Count of osteoclasts in the rabbit femoral head samples

in each group at different time points after surgery

质骨的即刻抗压能力。为了能使支架具有一定的骨诱导能力，在支架内部设计了很多立方体结构孔隙，以用来负载活性因子。支架相互连通的孔隙结构，可能有利于成骨相关细胞的黏附与增殖、血管长入、营养物质及代谢产物的输送。

此次研究中选择了淫羊藿苷作为骨诱导因子进行负载。淫羊藿苷是中国传统中药淫羊藿的主要有效成分，属黄酮苷类化合物。文献报道淫羊藿苷具有双向调节成骨及破骨过程的作用[10-11]。淫羊藿苷可能通过BMP-2/Smad、cAMP-PKA及Wnt/β-catenin等多条通路促进骨形成[19-21]，同时干预MAPK信号通路及OPG/RANKL/RANK等多种信号通路抑制破骨细胞分化，减少骨吸收[22]。此次研究中，复合支架相比于单纯β-磷酸三钙支架具备更好的骨修复能力。通过对比分析苏木精-伊红染色、Masson染色和TRAP染色结果发现，淫羊藿苷不仅起到了促进了骨间充质干细胞向成骨细胞的分化，还体现了诱导成骨细胞增殖的作用，同时显著降低了破骨细胞的活性。micro-CT检查发现，术后第4周时，β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架周围即可见有一定量的骨小梁生成，至第8周时可见支架上有骨小梁长入；磷酸三钙支架周围在第4周时仅可见微量薄弱骨小梁，8周时骨小梁尚未长入支架内部空间；术后第12周时，β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架的骨整合仅略差于自体骨，优于β-磷酸三钙支架，说明β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架中淫羊藿苷起到了促进骨小梁生成和长入的作用。

此次研究中，β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架除了在力学上可提供坚定的即刻支撑和远期支撑外，还能有效诱导血管新生。由于股骨头坏死患者血供普遍较差，手术减压后短期内的再灌注是血管新生的黄金时期，若支架植入体内后不能及时与周围组织建立有效的血液循环，骨修复过程可能会中断，造成边缘骨修复而内部骨吸收。普通β-磷酸三钙支架植入后仅依靠周围组织血管自然长入，速度慢，所需时间较长，可能在尚未建立充分的循环之前内部结构已被降解，导致塌陷。文献报道，淫羊藿苷可上调包括血

P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org

150

P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05 P < 0.05

P < 0.05

P < 0.05

自体骨组 )磷酸三钙组 %100

(A复合支架组

ERA /DOI50 0

4周 8周 12周

图7 术后不同时间点各组兔股骨头标本血管内皮生长因子阳性率

Figure 7 Positive rate of vascular endothelial growth factor in the rabbit femoral head samples in each group at different time points after surgery

管内皮生长因子、乏氧因子、血管激素蛋白酶和白细胞介素等基因表达来促进血管内皮细胞增殖及血管形成[23]。此次研究免疫组织化学结果显示，复合支架组血管内皮生长因子表达显著高于磷酸三钙组，提示淫羊藿苷可显著促进血管新生。β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架的多孔网架结构，为血管长入和攀附提供了有利条件。

综合以上结果，可得出将3D打印的β-磷酸三钙复合淫羊藿苷支架植入股骨头坏死兔体内，在提供支撑的同时，可通过淫羊藿苷促进成骨细胞增殖分化，同时抑制破骨细胞增殖，并通过上调血管内皮生长因子促进新血管生成，可作为修复股骨头坏死病灶清除后骨缺损的创新型骨替代材料。

作者贡献：杜斌进行实验设计，实验实施为刘锌、曹良权、薛鹏、彭晨健，实验评估为孙光权、刘锌，彭晨健成文，杜斌、孙光权审校。

经费支持：该文章接受了“江苏省卫计委中医药管理局项目(YB2015025)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验已通过江苏省中医院动物实验中心伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：该文统计学方法已经南京中医药大学附属医院生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

2167

彭晨健，杜斌，孙光权，刘锌，薛鹏，曹良权. 3D打印β-磷酸三钙支架复合淫羊藿苷微粒修复兔股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究，2019，23(14):2162-2168. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1673

4 参考文献 References

[1] Ye YH,Chen K,Jin KK,et al.Progress on surgical treatment for

femoral head-preservering in the precollapse stage of femoral head necrosis.Zhongguo Gu Shang. 2017;30(3):287-292. [2] Utsunomiya T,Motomura G,Ikemura S,et al.Effects of sclerotic

changes on stress concentration in early-stage osteonecrosis: A patient-specific, 3D finite element analysis. J Orthop Res. 2018;36(12):3169-3177.

[3] Issa K,Pivec R,Kapadia BH,et al.Osteonecrosis of the femoral

head: the total hipreplacement solution.Bone Joint J. 2013; 95-B(11 Suppl A):46-50.

[4] 朱旭日,杜斌,孙光权,等.髓芯减压打压植骨腓骨支撑术与头颈部

开窗打压植骨术治疗早中期股骨头坏死疗效比较[J].中国骨与关节损伤杂志,2015,30(4):343-345.

[5] 杜斌,孙鲁宁,袁滨,等.微创死骨清除打压植骨腓骨支撑配合中药

补肾活血汤治疗早中期股骨头坏死的临床报道[J].中华关节外科杂志(电子版),2013,7(3):404-407.

[6] Korompilias AV,Beris AE,Lykissas MG,et al. Femoral head

osteonecrosis: why choose free vascularized fibula grafting. Microsurgery.2011;31(3):223-228.

[7] 党莹,李月,李瑞玉,等.骨组织工程支架材料在骨缺损修复及3D打

印技术中的应用[J].中国组织工程研究, 2017,21(14):2266-2273. [8] Šponer P,Kučera T,Brtková J,et al.Comparative Study on the

Application of Mesenchymal Stromal Cells Combined with Tricalcium Phosphate Scaffold into Femoral Bone Defects. Cell Transplant. 2018;27(10):1459-1468.

[9] Bonazza V,Hajistilly C,Pate lD,et al.Growth Factors Release

From Concentrated Growth Factors: Effect of β-Tricalcium Phosphate Addition. J Craniofac Surg.2018;29(8):2291-2295. [10] Wu JZ,Liu PC,Liu R. Icariin Restores Bone Structure and

Strength in a Rat Model of Chronic High-Dose Alcohol-Induced Osteopenia. Cell Physiol Biochem.2018;46(4):1727-1736. [11] Jing X,Yin W,Tian H,et al. Icariin doped bioactive glasses

seeded with rat adipose-derived stem cells to promote bone repair via enhanced osteogenic and angiogenic activities.Life Sci. 2018;202:52-60.

[12] 薛鹏,杜斌,孙光权,等.可控释淫羊藿苷-β-磷酸三钙复合支架的制

备[J].中国组织工程研究,2018,22(6):865-870.

[13] The Ministry of Science and Technology of the People’s

Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals.2006-09-30.中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见.2006-09-30.

2168

[14] 曹良权,杜斌,孙光权,等.不同剂量糖皮质激素联合马血清构建激

素诱导型股骨头缺血性坏死兔模型[J].中国组织工程研究, 2017, 21(8):1229-1235.

[15] Li D,Xie X,Kang P,et al.Percutaneously drilling through femoral

head and neck fenestration combining with compacted autograft for early femoral head necrosis: A retrospective study. J Orthop Sci. 2017;22(6):1060-1065.

[16] Zhu W,Zhao Y,Ma Q,et al.3D-printed porous titanium changed

femoral head repair growth patterns: osteogenesis and vascularisation in porous titanium. J Mater Sci Mater Med. 2017;28(4):62.

[17] Hu R,Lei P,Li B,et al.Real-time computerised tomography

assisted porous tantalum implant in ARCO stage I-II non-traumatic osteonecrosis of the femoral head: minimum five-year follow up. Int Orthop. 2018;42(7):1535-1544. [18] Cheng Q,Tang JL,Gu JJ,et al.Total hip arthroplasty following

failure of tantalum rod implantation for osteonecrosis of the femoral head with 5- to 10-year follow-up. BMC Musculoskelet Disord. 2018;19(1):289.

[19] Hsieh TP,Sheu SY,Sun JS,et al.Icariin isolated from Epimedium

pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2, SMAD4, andCbfa1expression. Phytomedicine. 2010;17(6): 414-423.

[20] Shi W,Gao Y,Wang Y,et al.The flavonol glycoside icariin

promotes bone formation in growing rats by activating the cAMP signaling pathway in primary cilia of osteoblasts. J Biol Chem. 2017;292(51):20883-20896.

[21] Liu Y,Huang L,Hao B,et al.Use of an Osteoblast Overload

Damage Model to Probe the Effect of Icariin on the Proliferation, Differentiation and Mineralization of MC3T3-E1 Cells through the Wnt/β-Catenin Signalling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2017;41(4):1605-1615.

[22] Ma XN,Ge BF,Chen KM,et al.Mechanisms of icariin in

regulating bone formation of osteoblasts and bone resorption of osteoclasts.Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2013; 35(4):432-438.

[23] Chung BH,Kim JD,Kim CK,et al. Icariin stimulates

angiogenesis by activating the MEK/ERK- and PI3K/Akt/ eNOS-dependent signal pathways in human endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2008;376(2):404-408.

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH