猪瘟病毒常用实验室诊断方法概述

２０１３第３期　养猪ＳＷＩＮＥ　ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　猪瘟病毒常用实验室诊断方法概述　李娇　，谢金文　．一，唐娜　．一，王金良１，２，苗立中　．一，沈志强　，　２５６６００：２．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州文章编号：１００２—１９５７（２０１３）０３—００９７—０５　（１．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州中图分类号：￥８５８．２８５．３　２５６６００）　文献标志码：Ａ　摘要：近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了新的变化，转变为隐性感染和亚临床感染，出　现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，给兽医临床诊断增加了难度。随着分　子生物学与现代免疫学技术的发展进步，猪瘟的分子生物学和血清学诊断方法不断完善。本文就　近年来猪瘟的病毒分离鉴定、ＲＴ—ＰＣＲ、环介导等温扩增、实时荧光定量ＰＣＲ、酶联免疫吸附试验、　胶体金免疫技术等实验室诊断方法的最新研究进展以及各种检测方法的优缺点进行全面论述，旨　在为实验室及养殖户寻找和建立适合自己的快速、准确的检测方法提供参考。　关键词：猪瘟病毒；诊断方法；概述　猪瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ．ＣＳＦ）是由猪瘟病毒　（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ。ＣＳＦＶ）引起的一种以稽　留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征的　高度接触性、致死性猪传染病［１】。该病具有高度传染　性，主要通过呼吸道和消化道传染，不分季节，传播　速度快，发病率和死亡率高，呈全球性流行。世界动　物卫生组织将其列为Ａ类传染病，我国农业部也将　其列为一类动物传染病，是目前严重危害我国养猪　业的疾病之一，每年都给养猪业带来巨大的经济损　失［２１。为有效防控该病，急需加强ＣＳＦＶ诊断技术的　研究工作。近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发　生了很大变化，转变为隐性感染和亚临床感染，出现　了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟’，和“带毒母猪综　合征”，其在临床症状和病理变化等方面常常不同于　典型猪瘟，给兽医临床诊断带来很大困难，根据流行　病学、临床症状和病理变化等只能做出初步诊断，确　诊需借助实验室诊断方法［３１。近年来，随着免疫学与　分子生物学技术的日臻完善，以及我国研究学者不　断进行技术改进与创新，猪瘟的实验室诊断方法有　了长足的发展与进步，本文就近年来猪瘟的不同实　验室诊断方法进行最新的全面概述，以期为实验室　及养殖户寻找和建立适合自己的快速、准确的检测　方法提供参考。　１病毒分离与鉴定　病毒分离与鉴定是ＣｓＦＶ经典、准确、可靠的诊　断方法，病猪的扁桃体、脾、肾、淋巴结、全血等病变　组织均可作为病毒分离的组织样品。基本操作方法　是将无菌采集的组织病料研磨、反复冻融、离心、取　上清液过滤除菌后，接种ＰＫ一１５、ＳＴ等单层细胞培　养。因ＣＳＦＶ在细胞上不出现明显的细胞病变，故对　细胞培养物的鉴定需借助其他检测方法如免疫荧光　抗体法、免疫酶染法、ＲＴ—ＰＣＲ等。何小兵等将采集　的组织样品处理后，用０．２２　Ｉｘｍ滤膜过滤除菌，接种　于ＰＫ一１５单层细胞，３７℃、５Ｏ　ｍＬ／Ｌ　ＣＯ，培养箱培养　４　ｄ后收集培养物，继续盲传至第１２代，并取每代　细胞培养物进行ＣＳＦＶ　Ｅ２基因的ＲＴ—ＰＣＲ检测，结　果在盲传２代之后的细胞培养物中均可检测到ＣＳＦＶ　Ｅ２基因［４１。病毒分离与鉴定方法虽然准确性高，但存　在试验周期长、操作繁琐、对操作人员和仪器设备要　求高等缺点，适合有条件的重点实验室使用，不适合　般基层实验室使用。　一２　ＲＴ—ＰＣＲ方法　ＲＴ—ＰＣＲ技术具有灵敏、特异、快速、简便等优　点，是实验室常用的分子生物学诊断技术，也是目前　ＣＳＦＶ准确、简单、快速诊断的主要方法。其中，套式　ＲＴ—ＰＣＲ方法具有更高的特异性和敏感性，多重　ＲＴ—ＰＣＲ方法可以实现ＣＳＦＶ与其他猪病原体的鉴　别诊断。　２．１常规ＲＴ—ＰＣＲ　谢金文等根据ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的ＣＳＦＶ核酸　序列设计并合成了１对能特异性扩增ＣＳＦＶ基因片　段的引物，扩增片段长５０８　ｂＤ，该方法具有良好的　特异性、敏感性、重复性和稳定性，简便、快速、高效，　为ＣＳＦＶ的快速准确诊断及进一步的ＣＳＦ流行病学　研究提供了重要的技术手段［５１。郭抗抗等根据Ｇ。ｎ—　收稿日期：２０１３一ｏ４—２５　基金项目：山东省自．主创新成果｝　重大专项计划（２００８ＺＨＺＸ１Ａ１１０３）：　Ｂａｎｋ中３６株ＣＳＦＶ强毒株和弱毒疫苗株的基因序　山东省自然科学基金（ＺＲ２Ｏ１ＯＣｏ０ｌ２）　列，分别设计了针对ＣＳＦＶ强毒株和弱毒疫苗株的　作者简介：李娇（１９８１一），女，满族，辽宁铁岭人，助理研究员，硕士．　特异性引物，建立了一种能区分ＣＳＦＶ强毒株和弱　主要从事动物传染病综合诊断技术研究．Ｅ－ｍａｉＨｉｊｉａｏ　ｚｏｎｅ＠１６３　ｃｏｍ通讯作者：沈志强，研究员，博士，研究方向为预防兽医学与生物　毒疫苗株的ＲＴ－ＰＣＲ快速鉴别检测方法，可从ＣＳＦＶ　制品学．Ｅ—ｍａｉｌ：ｂｚｓｈｅｎｚａ＠１６３．ｃｏｒｎ　强毒株和弱毒疫苗株中分别扩增出大小为１８７和　＿养猪ＳＷＩＮＥ　ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ（３）　２０ｌ３　４９２　ｂＤ的特异性片段，对ＰＲＲＳＶ（猪蓝耳病病毒）、　ＰＣＶ２、ＴＧＥＶ（猪传染性胃肠炎病毒）等猪病毒的检　测结果均为阴性，该方法对１０份疑似猪瘟临床样品　的检测结果显示，可分别检测出ＣＳＦＶ强毒和疫　苗毒［６１。该鉴别检测方法在经过反转录后只需１次　ＰＣＲ反应就可对样品中的ＣＳＦＶ强、弱毒株进行鉴　别检测。常规ＲＴ—ＰＣＲ方法简单、快速、准确，适合　般实验室建立和开展ＣＳＦＶ检测工作，在猪瘟的　净化和防控方面将具有广阔的应用前景。　一２－２套式ＲＴ—ＰＣＲ　套式ＲＴ—ＰＣＲ（ＲＴ—ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ）是ＰＣＲ的一种　利于对疾病作出快速、准确的诊断，适合大量临床病　料中多个病原体的快速检测。陈甜甜等根据Ｇｅｎ—　Ｂａｎｋ中登录的ｃＳＦｖ和ＰＲＲＳＶ疫苗株基因组序列，　分别设计针对ＣＳＦＶ和ＰＲＲＳＶ的两对引物，建立了　鉴别诊断ＣＳＦＶ和ＰＲＲＳＶ的多重ＲＴ—ＰＣＲ检测方　法，可以检测出ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ及ＣＳＦｖ与ＰＲＲＳＶ混　合病毒，而ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＰＣＶ２、ＰＰＶ、ＰＲＶ的检测结　果均为阴性，该检测方法可检出１００倍稀释的病毒　ＲＮＡ，与市售ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒同时检测２０份疑似　ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ混合感染的临床组织病料，二者检测　的灵敏度达ｌＯ０％Ｅ￣。该检测方法的建立为ＣＳＦＶ和　改良模式，是利用２对ＰＣＲ引物进行２轮ＰＣＲ扩增　反应。由于套式ＰＣＲ反应有两次ＰＣＲ扩增，从而降　低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感　性；又有两对ＰＣＲ引物与检测模板配对，增加了检　测的可靠性。朱小甫等根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的猪瘟　病毒Ｓｈｉｍｅｎ株基因序列设计并合成了２对引物，优　化并建立了ＣＳＦＶ的套式ＲＴ—ＰＣＲ检测方法，该方法　检测ＣＳＦＶ　ｃＤＮＡ含量的最低极限为ｌｘｌ旷７　ｎ咖Ｌ，检　测ＣＳＦＶ扩增出２７２　ｂｐ的目的条带，检测ＰＲＲＳＶ、　ＳＩＶ（猪流感病毒）、ＰＣＶ２、ＰＲＶ（猪伪狂犬病病毒）、　ＰＰＶ（猪细小病毒）的阳性毒和健康猪脾、肝组织及　阴性ＰＫ一１５细胞均未扩增出特异性条带，对福建省　１３３份病料进行检测的结果有６０份病料为阳性，阳　性率为４５．１％ｍ。李安等对ＧｅｎＢａｎｋ中登录的２５株　猪瘟病毒强毒株和弱毒疫苗株基因组全序列进行比　较分析，在其高度保守区设计１对通用引物，扩增片　段为６０９　ｂＤ，并在该对引物扩增区域内设计针对疫　苗弱毒的特异引物，扩增片段为２３７　ｂｐ，建立一种能　够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复　性好的套式ＲＴ—ＰＣＲ鉴别诊断方法，该方法能将我　国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒　与疫苗弱毒完全区分开来，且不与牛病毒性腹泻病　毒及其他猪源病毒发生非特异反应［８１。应用套式　ＲＴ—ＰＣＲ鉴别诊断方法可及早对猪瘟作出准确诊　断，并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中　筛选出来，减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。套　式ＲＴ—ＰＣＲ方法有２轮ＰＣＲ反应，４条ＰＣＲ反应引　物，增加了检测所需的时间及操作难度，但其具有更　高的检测特异性和敏感性，可检测出极低含量的　ＣＳＦＶ，在ＣＳＦＶ的早期诊断中具有明显的优势。　２．３　多重ＲＴ—ＰＣＲ　随着现代养猪业规模化和集约化的发展，猪群　发生多病原混合感染和继发感染越来越普遍。在猪　场发生的混合感染中，以ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ、ＰＣＶ２较为　严重和多见，能够损伤机体的免疫系统，引起免疫缺　陷，降低机体对外界环境的抵抗力，常引起继发感　染。多重ＰＣＲ不仅具有特异性强、灵敏度高、检测时　间短、成本低等优点，而且能够同时检测多种病原，　ＰＲＲＳＶ的早期诊断及流行病学调查奠定了基础。刘　志杰等参照ＧｅｎＢａｎｋ中相关的基因序列，设计了分　别用于扩增ＰＲＶ、ＰＰＶ、ＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶ、ＪＥＶ相　关保守基因片段的６对检测引物，通过对其反应条　件的优化，建立了检测ＰＲＶ、ＰＰＶ、ＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、　ＣＳＦＶ、ＪＥＶ的六重ＰＣＲ检测方法，该六重ＰＣＲ检　测方法对６种病毒的最低核酸检测量分别为ＰＲＶ　６．６　Ｐｇ、ＰＰＶ　９６　Ｐｇ、ＰＣＶ２　１２．９　Ｐｇ、ＰＲＲＳＶ　１０．５　Ｐｇ、　ＣＳＦＶ　５１　ｐ　ＪＥＶ　４６　ｐｇ，对ＳＩＶ、大肠杆菌的扩增结　果均为阴性，１０３份临床病料检测结果表明６种猪病　毒病在贵州省猪群中普遍存在且混合感染情况严　重，该六重ＰＣＲ方法实现了６种病毒的同时、同步　检测，能够对ＰＲＶ、ＰＰＶ、ＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶ、ＪＥＶ　单个或混合感染的临床病料进行快速鉴别诊断㈣。　多重ＰＣＲ检测方法能够快速、准确地对临床病料进　行检测，是一种实用、快速的检测方法，适用于基层　对临床症状比较复杂的病例进行快速确诊。　３限制性片段长度多态性分析方法　限制性片段长度多态性分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ　ｆｒａｇ—　ｍｅｎｔ　ｌｅｎ￣ｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．ＲＦＬＰ）是先将靶基因相关　片段用ＰＣＲ扩增，然后利用限制性内切酶能够特异　性地识别特定的碱基序列对扩增产物进行酶切，通　过电泳可将酶切片段分离检测，具有分辨率高、重复　性好等优点，但操作比较复杂，检测时间也较长。董　浩等根据ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的猪瘟病毒囊膜糖蛋　白Ｅ２基因高度保守区设计１对特异性引物，在其　跨膜区内部有Ｓｈｉｍｅｎ株独有的限制性内切酶Ｂ　Ⅱ　酶切位点，采取对ＲＴ—ＰＣＲ产物进行酶切的方法鉴　别Ｓｈｉｍｅｎ株和疫苗株。该方法从Ｓｈｉｍｅｎ株和疫苗　株中均能扩增出１条大小为７５０　ｂｐ的特异性片段，　疫苗株的ＲＴ—ＰＣＲ产物不能被Ｂｇｌ　ＩＩ酶切，Ｓｈｉｍｅｎ　株的ＲＴ—ＰＣＲ产物则被Ｓｇｌ　Ｉ１酶切为大小分别为　５２０和２３０　ｂＤ的２条特异性条带。该方法对ＣＳＦＶ　ＲＮＡ的最小检出量为３．９６ｘ１０　￣ｇ／ｍＬ。该方法检测　３０份临床疑似猪瘟病料，结果３份感染猪瘟病毒强　毒，２１份为猪瘟弱毒疫苗株，其余６份为阴性…１。胡　继明等根据ＣＳＦＶ　Ｓｈｉｍｅｎ株和疫苗株设计１对特　异性引物，建立ＣＳＦＶ　ＲＴ—ＰＣＲ—ＲＦＬＰ检测方法。该　２０１３第３期　李娇，等．猪瘟病毒常用实验室诊断方法概述　方法ＲＴ—ＰＣＲ扩增片段为８２５　ｂｐ，产物经ＲＦＬＰ分　析，野毒株的ＲＴ—ＰＣＲ产物能被Ａｐａ　Ｉ酶切为３２２　ｂｐ和５０３　ｂｐ　２个片段，弱毒疫苗株则不能被Ａｐａ　Ｉ　酶切。该方法检测ＲＮＡ的最低浓度为０．０２８　６　咖Ｌ，　８株流行野毒株都含ＧＧＧＣＣＣ序列（Ａｐａ　Ｉ酶切位　点），２株疫苗株相应序列为ＧＡＧＣＣＣ，不能被Ａｐａ　Ｉ酶切。该研究建立的可鉴别ＣＳＦＶ野毒株和弱毒　疫苗株的ＲＴ—ＰＣＲ—ＲＦＬＰ检测方法，为猪瘟的防控　提供有效手段　。ＲＦＬＰ方法是在ＲＴ—ＰＣＲ的基础上　进行的酶切反应，该检测方法虽然增加了检测时间，　ｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．ＦＱ－ＰＣＲ）是在ＰＣＲ　技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技　术，融汇了传统ＰＣＲ技术灵敏、快速、特异的特点及　光谱技术高敏感性和高精确定量的优点，具有特异　性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封　闭反应等优点，为猪瘟病毒的定量检测提供了新的　分子生物学诊断技术。毛立等根据猪瘟病毒５　非编　码区设计特异性引物和Ｔａｑｍａｎ探针，建立Ｔａｑｍａｎ　实时定量ＲＴ—ＰＣＲ检测猪瘟病毒的方法，灵敏度为　ｌ０拷贝，批间重复性试验的变异系数小于１％；该方　但操作简单、花费较少，无需其他仪器设备，可实现　猪瘟强毒与疫苗毒的确诊，在一般的实验室和基层　单位应用前景广阔。　４环介导等温扩增方法　环介导等温扩增（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍ—　ｐｌｉ６ｃａｔｉｏｎ。ＬＡＭＰ）方法是日本学者Ｎｏｔｏｍｉ等在２０００　年发明的一项恒温核酸扩增新技术，该技术特异性　强、灵敏度高、成本低廉、肉眼判读、无需特殊仪器设　备，特别适合在现场和基层部门应用。刘中勇等设　计了４条针对ＣＳＦＶ　６个位点的特异性引物，建立　了一种灵敏、特异、快速的ＣＳＦＶ　ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方　法，能够特异地检测出ＣＳＦＶ的存在，检测ＰＲＶ、　ＰＲＲＳＶ、ＰＣＶ２等病毒均为阴性；该方法灵敏度为　１０－５，总ＲＮＡ的检测阈值约为１　Ｐｇ；反应快速，整个　扩增反应可在１　ｈ内完成；操作简单，不需要ＰＣＲ　仪等复杂的仪器，结果可经肉眼观察及电泳检测【ｌ引。　赵明秋等通过对ＧｅｎＢａｎｋ中注册的ＣＳＦＶ序列进行　比对分析，针对ＣＳＦＶ基因中的保守区域设计合成　了１套ＲＴ—ＬＡＭＰ引物，在成功扩增出特异片段的　基础上，用ＣＳＦＶ　ＲＮＡ优化ＲＴ—ＬＡＭＰ反应体系和　条件，建立了ＣＳＦＶ的可视化ＲＴ—ＬＡＭＰ快速检测　方法，能够特异地检测出ＣＳＦＶ，检测ＰＲＲＳＶ、　ＦＭＤＶ、ＪＥＶ均为阴性，并且可检测低至０．１　ｐｇ／　Ｌ浓　度的ＣＳＦＶ　ＲＮＡＯ４１。张兴娟等参照ＧｅｎＢａｎｋ中３５株　ＣＳＦＶ全基因序列及１６株ＢＶＤＶ全基因组序列，设　计针对ＣＳＦＶ强毒株ＮＳ５Ｂ基因保守区的１套ＲＴ—　ＬＡＭＰ引物，建立了可视化检测ＣＳＦＶ野毒株的　ＲＴ—ＬＡＭＰ方法，可检测出２．５　ＴＣＩＤ∞的ＣＳＦＶ石门　株基因组ＲＮＡ，对ＣＳＦＶ—Ｃ株、ＢＶＤＶ、ＰＲＲＳＶ、　ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＲＶ、ＰＰＶ、ＰＣＶ２检测结果均为阴　性，通过对１２６份不同样品进行检测比较，该方法与　实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的符合率达　１００％，为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速　的方法，可满足基层检疫的需要㈣。ＲＴ—ＬＡＭＰ方法　快速、灵敏、特异、无需特殊的仪器，为基层实验室　ＣＳＦＶ的检测提供了简单快速的方法，特别适合基　层实验室或养殖场在临床中应用。　５实时荧光定量方法　实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎａｕａｎｔｉ—　法检测ＰＲＲＳＶ、ＢＶＤＶ的结果均为阴性；检测采集白　江苏和新疆的１９２份组织和血清样品，猪瘟病毒阳　性率为７１．９％；检测感染猪的不同脏器发现，在心、　肺、肝、。肾、脑、脾脏、淋巴结、腹水中均可检测到猪瘟　病毒，与常规ＲＴ＿ＰＣＲ方法相比，该方法敏感性更高［１句。　该方法的建立为ＣＳＦＶ的流行病学调查和定量检测　提供了有效手段。谢金文等对ＧｅｎＢａｎｋ中登录的２５　株ＣＳＦＶ强毒株和弱毒疫苗株全基因组序列进行比　较分析，设计１对共用下游引物以及分别针对ＣＳＦＶ　强毒株与弱毒疫苗株的特异性上游引物，建立了一　种能够区分ＣＳＦＶ强毒与弱毒疫苗株的荧光定量　ＲＴ—ＰＣＲ方法，该方法对其他相关病毒无特异性扩　增，最低检出量为５ｘＲＩＤ　的细胞疫苗基因组拷贝，　该方法重复性好、扩增效率高、线性范围广、检测时　间短，可对免疫猪群ＣＳＦＶ强毒感染做出快速准确　的鉴别检测㈣。姚俊对ＧｅｎＢａｎｋ中所有瘟病毒属成　员高度保守的５　端非翻译区序列比对分析后，设计　出１对ＴａｑＭａｎ　ＲＴ—ＰＣＲ引物、１条ＴａｑＭａｎ探针和　３条ＲＮＡ标准品制备引物。通过最佳引物、探针浓度　的筛选及反应条件的优化，建立了一种既能检测野　毒、又能检测疫苗毒的ＣＳＦＶ　ＴａｑＭａｎ实时荧光定量　ＲＴ—ＰＣＲ方法。该方法批内及批间重复试验变异系　数均低于２％，仅能检测出猪瘟强毒及疫苗毒株，最　低检测浓度极限为ｌｘｌ０２拷贝／　Ｌ：该方法对３份猪　瘟临床组织样品、６家企业生产的５种细胞苗及２种　脾淋苗进行定量检测的结果显示，临床病料含有的　病毒拷贝数差异不大，而疫苗产品每头份含有的病　毒拷贝数差异较大　。该检测方法具有特异、快速、　灵敏、可重复性和线性关系好的特点，不仅适合猪瘟　临床样品的早期检测，也适用于疫苗生产过程中的　质量控制及疫苗制品的效价评估。荧光定量ＰＣＲ技　术以其定量准确、灵敏度高、特异性强、重复性好、自　动化程序强等优点成为核酸检测的重要工具，为猪　瘟的诊断方法提供了新的模式，同时也为猪瘟疫苗　的效价测定与效力检验提供了新的方法，但是由于　该方法所需仪器与试剂昂贵，对操作人员技术水平　要求高，限制了其在基层的广泛应用与普及。　６酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）　ＥＬＩＳＡ诊断方法具有敏感性和特异性强、操作　１００　养猪ＳＷＩＮＥ　ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ（３）　２０１３　简单、检测快速、高通量、无辐射、价格低廉等特点，　是当前动物传染病检疫、流行病学调查等广泛采用　的免疫学诊断技术，其在ＣＳＦＶ的检测上得到了广　泛应用。刘建文等分别用原核表达的ＣＳＦＶ主要抗　原Ｅ２蛋白和ＣＳＦＶ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过细　胞融合与克隆筛选出５株稳定分泌ＣＳＦＶ抗体的杂　交瘤细胞株１Ｅ２、１Ｇ７、３Ａ２、３Ｂ７和４Ｂ６。间接免疫荧　光和Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验结果显示，５株单抗均与　ＣＳＦＶ　Ｅ２蛋白和全病毒抗原反应。将筛选的ＣＳＦＶ　特异性单抗１Ｅ２、３Ｂ７和４Ｂ６纯化后等量混合包被　酶标板（捕捉抗体），与兔抗ＣＳＦＶ　ＩｇＧ（检测抗体）联　料悬液时，１５　ｍｉｎ左右即可显示出结果，与检测标　准样品所需时间无明显差异；荧光抗体试验检测出　６份阳性，试纸条检测出５份阳性，试纸条与荧光抗　体试验的阳性符合率为８３％（５，６）阎。其研究结果表　明，胶体金试纸条可检测ＣＳＦＶ，并且可进行推广使　用。胶体金免疫层析技术具有操作简单、特异性好、　灵敏度高等特点，非常适合在基层实验室和养殖户　推广应用，对于监测ＣＳＦ的流行情况和疫苗免疫水　平及制定免疫程序均具有重要意义，将具有广阔的　应用前景。　８小结与展望　合应用，采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适　工作浓度，建立了ＣＳＦＶ抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ—　ＥＬＩＳＡ）方法。该ＡＣ—ＥＬＩＳＡ方法检测ＣＳＦＶ细胞培　养物、ＣＳＦＶ攻毒死亡猪的组织病料和临床猪瘟组　织样品的结果表明，该检测方法敏感、特异、重复性　好，与病毒分离鉴定和ＲＴ—ＰＣＲ方法符合率分别为　８６．２％和９０．３％ｔ１￣。闫换兵等采用ＥｕＳＡ技术对甘肃　天水猪群感染的病毒进行检测，最后确诊为该疫情　由ＣＳＦＶ引起，得出ＥＵＳＡ方法具有良好的特异性、　敏感性、重复性，为猪瘟的诊断提供了一种简单、特　异、敏感、快速、高通量的检测方法　。ＥＬＩＳＡ方法能　够短时间内准确、快速地直接检测大批量样品中　ＣＳＦＶ抗原，且明显优于病毒分离鉴定和免疫荧光　等方法，更适合各级兽医研究机构和生产单位应用，　可作为常规检测方法在基层推广应用。　７胶体金免疫技术　胶体金免疫技术（ＧＩＣＡ）具有简便、快速、特异、　灵敏等优点，特别适合广大基层兽医人员及大批量　检测和大面积普查等应用，是当前猪瘟检测方法中　简单、快速、敏感的免疫学检测技术之一，具有巨大　的发展潜力和广阔的应用前景。王向鹏等用柠檬酸　三钠还原法制备胶体金颗粒，标记纯化的抗ＣＳＦＶ　野毒株Ｅ２蛋白的单克隆抗体６Ｅ１０作为捕捉抗体，　优化反应条件，组装了检测ＣＳＦＶ野毒株的胶体金　免疫层析试纸条，用于检测ＣＳＦＶ野毒感染的ＰＫ一　１５细胞培养物，在检测线和质控线处均呈现红色条　带，检测健康ＰＫ一１５细胞培养物对照仅在质控线呈　现红色条带，该试纸条检出病毒培养物的最低限为　１０３５　ＴＣＩＤ∞，用不同批次的试纸条重复检测，结果无　差异，该试纸条不与ＣＳＦＶ弱毒疫苗株、ＢＶＤＶ、　ＰＲＲＳＶ、ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＲＶ、ＰＲＶ、ＰＰＶ、ＰＣＶ２反应【２　ｌ。　该试纸条以特异性强的抗ＣＳＦＶ野毒株单克隆抗体　为标记抗体，为ＣＳＦ￣强毒感染的诊断提供了准确、　特异、简便、快速的诊断方法。付连军等通过采用柠　檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，选择１５　ｎｍ胶体　金标记兔抗猪瘟病毒抗体，组装免疫层析试纸条。　采用该试纸条与荧光抗体试验对８份疑似猪瘟病毒　感染病料进行检测的结果显示，试纸条检测猪瘟病　我国猪瘟流行形势复杂，没有明显规律性，是困　扰我国养猪业健康发展的一大难题，防控任务十分　艰巨。在猪瘟的常用实验室诊断方法中，病毒的分离　与鉴定方法可靠、准确，但试验周期长、操作繁琐、对　操作人员和仪器设备要求高，适合有条件的重点实　验室使用，不适合基层一般实验室使用。ＲＴ—ＰＣＲ、　ＲＦＬＰ、ＦＱ—ＰＣＲ方法的特异性强、敏感性高、检出率　高，且在猪感染ＣＳＦＶ的早期即可检测到病毒核酸。　ＦＱ—ＰＣＲ的敏感性比ＲＴ—ＰＣＲ和ＲＦＬＰ更高，且能　对病料中病毒核酸的拷贝数进行定量检测，但ＦＯ—　ＰＣＲ对操作人员、仪器设备与试剂要求太高，一般　实验室很难具备试验条件。ｌｉｔ—ＰＣＲ和ＲＦＬＰ需要　一定的仪器设备和试剂，适合一般实验室使用。ＲＴ—　ＬＡＭＰ特异性强、灵敏性高、成本低、不需要ＰＣＲ　仪，仅需要一个恒温水浴锅即可完成核酸的扩增，特　别适合基层部门应用。ＥＬＩＳＡ方法具有敏感性和特　异性强、操作简单、检测快速、重复性好、无辐射、准　确性高的优点，适合基层进行大批量检测。ＧＩＣＡ方　法具有简便、快速、无污染、不需特殊仪器、肉眼判　读、试验结果易保存等优点，非常适合基层兽医部门　和广大养殖户应用。相信随着分子生物学和免疫学　的广泛应用及对猪瘟病毒研究的不断深入，猪瘟病　毒的诊断方法必将会不断成熟与完善。　参考文献：　ｆ１１李娇，王金良，沈志强，等．荧光定量ＰＣＲ检测方法在猪瘟诊　断上的应用研究进展ｆＪ１．养猪，２０１２（６）：９８—１０１．　【２１李娇，王艳，唐娜，等．猪瘟单克隆抗体诊断方法的研究概述　［Ｊ】．养猪，２０１１（６）：９３—９６．　『３１李娇，王金良，祖立闯，等．猪瘟病毒重组Ｅ２蛋白ＰＰＡ—ＥＬＩＳＡ　抗体检测试剂盒的研制及应用［Ｊ】＿中国兽医学报，２０１１，３１　（１Ｏ）：１３９０－１３９４．　『４１何小兵，贾怀杰，陈国华，等．猪瘟病毒ＧＳＬＺ株的分离与鉴定　ｆＪ１．中国兽医科学，２０１１，４１（２）：１３１—１３７．　ｆ５１谢金文，王金良，管宇，等．猪瘟病毒ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的研　究ｆＪ１．养猪，２０１ｌ（１）：７７—７９．　『６　郭抗抗，邓力，６１井勇，等．猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株　ＲＴ—ＰＣＲ快速鉴别检测方法的建立［Ｊ】．西北农林科技大学学　报（自然科学版），２０１０，３８（６）：１３—１８．　『７１朱小甫，张志，李晓成，等．猪瘟病毒ＲＴ—ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ检测方　法的优化和应用　西北农林科技大学学报（自然科学版），　２０１３第３期　２００７，３５（６）：１１—１４．　李娇，等．猪瘟病毒常用实验室诊断方法概述　１０１　『１５１张兴娟，孙元，刘大飞，等．猪瘟病毒野毒株ＲＴ—ＬＡＭＰ可视化　『８１李安，崔言顺，沈志强，等．新型反转录一复合套式聚合酶链式　反应（ＲＴ—ｎＰＣＰＯ鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立【Ｊ］．中　国兽医学报，２０１１，３１（１）：２１—２５．　『９　陈甜甜，程福亮，梁瑾，等．９１猪瘟和猪蓝耳病病毒多重ＲＴ—ＰＣＲ　检测方法的建立及初步应用【Ｊ１．中国生物制品学杂志，２０１３，　２６（３）：４２５－－４２９．　检测方法的建立ｆＪ］．中国预防兽医学报，２００９，３１（１１）：８６４—　８６８．　『１６１毛立，李文良，李彬，等．猪瘟病毒Ｔａｑｍａｎ实时定量ＲＴ—ＰＣＲ　检测方法的建立和临床应用［Ｊ］．江苏农业学报，２０１２，２８（４）：　７８３－７８６．　ｆ１７１谢金文，李安，肖跃强，等．采用ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ实时荧光定量　ＲＴ—ＰＣＲ方法对猪瘟强毒与疫苗弱毒的鉴别研究　．中国预　『１ｏ］刘志杰，曾智勇，汤德元，等．猪繁殖障碍病毒性疫病六重　ＰＣＲ检测方法的建立及应用叫．畜牧兽医学报，２０１２，４３（９）：　防兽医学报，２０１２，３４（１）：４５—４８．　『１８１姚俊．猪瘟病毒ＴａｑＭａｎ实时荧光定量ＰＣＲ的建立与应用［Ｊ】＿　１４２９—１４３６．　ｆｌｌ１董浩，李菲，王鑫，等．猪瘟病毒野毒株与疫苗株酶切检测方　中国动物传染病学报，２０１２，２０（６）：６８—７６．　法的建立、优化及应用　中国畜牧兽医，２０１ｌ，３８（９）：１８７一　ｆ１９１刘建文，余兴龙，张丽颖，等．单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原　ｌ８９．　ＥＬＩＳＡ方法的建立　．畜牧兽医学报，２００６，３７（５）：４７４—４７９．　【２ｏ１闰换兵．用酶联免疫吸附试验技术检疫猪瘟叨．北京农业，　『ｌ２１胡继明，杨培培，王颖，等．猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗　２０１１（３３）：１０８．　株ＲＴ—ＰＣＲ—ＲＦＬＰ鉴别检测方法的建立『Ｊ］．畜牧兽医学报，　２０１２，４３（６）：９４３—９４９．　ｆ２ｌ１王向鹏，孙元，杨增岐，等．检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层　『１３１刘中勇，曾小娜，朱道中，等．猪瘟病毒ＲＴ－ＬＡＭＰ快速检测方　析方法的建立　．中国预防兽医学报，２０１０，３２（６）：４４１—４４５．　法的建立咖．中国畜牧兽医，２０１０，３７（６）：７１—７４．　『２２１付连军，姜成，李沐森．猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应　ｆ１４１赵明秋，王伟芳，王波，等．猪瘟病毒可视化ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方　用　．畜牧兽医杂志，２０１１，３Ｏ（３）：１７—２Ｏ．　法的建立『Ｊ１．广东畜牧兽医科技，２０１　ｌ，３６（２）：２６—２８．　（编辑：姜雪）　中药青蒿素　抗疟更抗癌　—青蒿素的自述　蒿琥酯、蒿甲醚及蒿乙醚等青蒿素的衍生物。　开启新篇章：抗癌　我十分幸运，在被发现能抗疟之后，又遇到了许　多伯乐，他们之后的发现让我又开启了新的篇章：抗　癌！我的优点还不仅仅是对肿瘤细胞有杀灭作用，　更重要的是我对于正常细胞几乎无细胞毒性，还可　以通过阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤　新生血管形成、调节肿瘤相关基因的表达，以及损伤　细胞线粒体等作用机制而实现抗肿瘤作用。他们研　究发现，我独特的作用机制使青蒿琥酯对肿瘤细胞　具有很好的靶向性，合用其他抗肿瘤药物后可以产　生协同作用；将我与转铁蛋白共价结合的复合体，增　强了我对肿瘤细胞的细胞毒性和选择性，是抗肿瘤　药物治疗中一种非常有前景的药物；况且，我与传统　化疗药相比，还具有来源广泛、价格低廉、抗癌谱广　且毒副作用小等优点。　目前，我与我的兄弟姐妹的抗肿瘤活性已成为　研究的热点，有希望被开发成为新型植物抗癌药，广　泛应用于临床。毒理学研究表明，虽然我们也具有　定毒性，但基本都是可逆的。其中，我、蒿甲醚及青　蒿琥酯在动物生殖毒性试验中均显示有胚胎毒性作　用，基于这一点我还有望成为抗早孕药物；不过，我　在动物实验时已证明具有神经毒性，虽然临床治疗　中还没发现对人有神经毒性，可在大剂量重复给药　的情况下，应密切关注患者可能出现的神经毒副反　应，保证更安全地用药。　（摘自《快乐养生９２０１３年第３期刘娟／文）　一我叫青蒿素，是一种新型的抗疟天然药物。或　许大家对我不是很熟悉，但是我的母亲大人可是大　家所熟悉的青蒿，又名黄花蒿，最早记载于马王堆汉　墓出土的《五十二病方》，是民间常用的药物，有截　虐、消暑退热、治疗感冒、除虚寒、健胃、止血、杀虫等　功效。虽然人们知道我的母亲有诸多功效，但是不　知道其实我才是最大的“功臣”。直到近年，我终于遇　到了我人生的伯乐一中国科学家屠呦呦，是她发现　了我的才能，并想方设法让我完好无损地从母亲身　体里“分娩”出来。咱俩因此收获都不小，我挽救了更　多人性命，屠呦呦也因此获得了有诺贝尔奖风向标　之美誉的拉斯克奖。　初露锋芒：抗疟　有人或许会质疑，有抗疟疗效的中药西药多　得去了，你有啥好稀奇的？但是我要告诉大家，我　不仅具有显著的抗疟疗效，抗疟机理与其他抗疟　药也有不同。其他药物会干扰叶酸代谢，给人体带　来一定的副作用。但是我不会，本着救人又不伤人　这个目的，我有个新办法：通过干扰疟原虫的表　膜一线粒体功能，从而导致虫体结构全部瓦解。正　是由于我具有高效、快速、低毒、安全等显著优势，　才得到大家的认可，成为世界卫生组织推荐的抗　疟药品，特别是对脑型疟疾和抗氯喹性疟疾有很　好疗效。　现在我的同类成分已被开发成各种药物，主要　包括直接从植物黄花蒿中分离提取的具有过氧化基　团的倍半萜内脂类化合物青蒿素及双氢青蒿素、青