(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105294623 A (43)申请公布日 2016.02.03
(21)申请号 201510796524.0(22)申请日 2015.11.18
(71)申请人浙江中医药大学
地址310053 浙江省杭州市滨江区滨文路
548号(72)发明人杨波 赵华军 周东恒 赵亚萍(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限
公司 33224
代理人张勋斌(51)Int.Cl.
A61P 35/00(2006.01)
C07D 307/93(2006.01)A61K 31/365(2006.01)
(54)发明名称
一种倍半萜内酯类化合物、其制备方法以及应用(57)摘要
本发明公开了一种倍半萜内酯类化合物、其制备方法以及在癌症治疗中的应用，该倍半萜内酯类化合物的结构如式(Ⅰ)所示。该倍半萜内酯类化合物的制备方法包括：A、使用提取溶剂对药材提取，得到提取液；B、将提取液浓缩，加水混悬，分别用极性由小到大的有机溶剂进行萃取，得到萃取液，萃取液浓缩，得到粗提物；C、粗提物上正相柱用洗脱剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到富含新颖倍半萜内酯化合物的提取物；D、提取物进行反相中压柱层析及制备型高效液相柱层析分离，得到所述的新颖倍半萜内酯化合物。该制备方法操作简单，生产成本低，得到的产品可用于癌症治疗药物的制备，具有良好开发前景。
权利要求书2页 说明书9页 附图7页
C N 1 0 5 2 9 4 6 2 3 A CN 105294623 A
权 利 要 求 书
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1.一种倍半萜内酯类化合物，其特征在于，结构如式(Ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(A)提取：采用提取溶剂对药材进行提取，得到提取液；
所述的药材为菊科泽兰属植物的干燥地上部分和/或全草；(B)萃取：对步骤(A)得到的提取液进行浓缩，得到的浓缩物加水混悬，然后采用萃取溶剂进行萃取得到萃取液，萃取液经过浓缩，得到粗提物；
(C)柱层析：步骤(B)得到的粗提物上正相柱用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到富含所述倍半萜内酯的提取物；
(D)中压柱层析：步骤(C)得到的提取物进行中压柱层析分离，得到如式(1)所示化合物的粗产品；
(E)制备型高效液相柱层析：步骤(D)得到的粗产品，进行制备型高效液相柱层析，得到如式(1)所示的化合物。
3.根据权利要求2所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，所述的药材为野马追的地上部分和/或全草，且所述的药材经打粉、过40目筛后再进行提取。
4.根据权利要求2所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，所述的提取溶剂为水和醇溶剂中的一种或两种。
5.根据权利要求4所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，所述的提取方法为渗漉法，提取溶剂为80～95％乙醇水溶液，提取溶剂与药材的用量比为15～20L﹕1kg。
6.根据权利要求2所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(B)中，萃取采用石油醚和乙酸乙酯分别进行，对乙酸乙酯萃取液进行浓缩得到粗提物。
7.根据权利要求2所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(C)中，所述的正相柱所用的填料为100～200目的柱层析硅胶或氧化铝。
8.根据权利要求2所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(C)中，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱剂由体积比为20～0:1的石油醚和乙酸乙酯组成，含有目标产物的洗脱液通过TLC或LC-MS进行检识。
9.根据权利要求2所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(D)和(E)中，中压柱层析及高效液相柱层析所用填料均为十八烷基键合相硅胶；
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权 利 要 求 书
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中压柱层析的流动相为40～70％的甲醇水溶液，洗脱时按极性由大到小依次进行梯度洗脱；
制备型高效液相柱层析的流动相为20～40％的乙腈水溶液。
10.一种如权利要求1所述的倍半萜内酯类化合物在制备治疗抗癌症药物中的应用。
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说 明 书
一种倍半萜内酯类化合物、其制备方法以及应用
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技术领域
本发明属于天然药物活性成分技术领域，涉及从中药中提取、制备有效成分和应用的领域，尤其是涉及一种菊科泽兰属植物中一个新颖倍半萜内酯的制备方法及其癌症治疗应用。
[0001]
背景技术
菊科(Compositae)泽兰属(Eupatorium L.)植物全世界约600余种，主要分布于
中南美洲的温带及热带地区。我国有14种，若干个变种，除新疆、西藏外全国均产。泽兰属作为药用的植物，目前应用较多的有林泽兰等八个种。该属植物具有悠久的用药历史。[0003] 野马追为菊科泽兰属植物林泽兰(Eupatorium lindleyanum DC.)的干燥地上部分，在我国分布较广，具有多年用药历史，现被我国2015版药典收载。野马追，味苦性平，归肺经，具有清热解毒，化痰止咳、平喘等功效。野马追枝叶有解表祛湿，和中化湿之效，用于劳伤咳嗽、吐血咳血以及淋浊白带、无名肿痛等治疗。[0004] 野马追已被开发成颗粒剂、糖浆剂等多种中成药广泛应用于临床。野马追糖浆是名优中成药，主要用于呼吸系统疾病的治疗，产生了显著的社会及经济效益。[0005] 野马追药材中含有丰富的结构新颖的倍半萜内酯类成分，该类成分普遍含有“α-β不饱和羰基”结构单元，为一类典型的迈克尔反应受体分子(Michael addition acceptors)。迈克尔反应受体分子具有显著生物活性，特别是对细胞信号传导通路中含有半胱氨酸残基的蛋白、酶，如STAT3、CDK、Hsp90、NF-κB等具有抑制活性，迈克尔反应受体分子已成为小分子生物药物研究的热点之一。[0006] 迄今为止，虽然从泽兰属植物中分离得到了一系列倍半萜内酯类化合物，但并没有提供一种工艺简单、科学合理，有效成分理化性质稳定、生 物活性显著的菊科泽兰属植物倍半萜内酯类化合物及其制备方法。
[0007] 在野马追糖浆等中成药制剂的应用方面，该类制剂多用于化痰、止咳、平喘等呼吸系统疾病的治疗，检测的指标成分或有效成分以黄酮、生物碱为主，野马追及其制剂在癌症治疗方面的应用鲜有报道。
[0002]
发明内容
本发明的目的是提供一种新颖倍半萜内酯、其制备方法以及应用，该倍半萜内酯
具有较好的抗癌活性，同时该制备方法工艺操作简单、科学合理，能够得到理化性质稳定，纯度较高的倍半萜内酯类化合物。[0009] 一种倍半萜内酯类化合物，结构如式(Ⅰ)所示：
[0008] [0010]
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说 明 书
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该化合物的结构目前未见有文献报道，同时MTT试验表明该化合物对两株人源乳腺癌细胞具有显著的抑制作用，给药24h后，对两株人源肿瘤细胞株的半数抑制浓度(IC50)为：2.67～3.05μmol/L。具有抗肿瘤活性。
[0012] 本发明还提供了一种所述倍半萜内酯类化合物的制备方法，包括下述步骤：[0013] (A)提取：采用提取溶剂对药材进行提取，得到提取液；
[0014] 所述的药材为菊科泽兰属植物的干燥地上部分和/或全草；[0015] (B)萃取：对步骤(A)得到的提取液进行浓缩，得到的浓缩物加水混悬，然后采用萃取溶剂进行萃取得到萃取液，萃取液经过浓缩，得到粗提物；[0016] (C)柱层析：步骤(B)得到的粗提物上正相柱，用洗脱溶剂进行洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到富含所述倍半萜内酯化合物的提取物；[0017] (D)中压柱层析：步骤(C)得到的提取物进行中压柱层析分离， 得到含有式(1)所示化合物的粗产品。所述的中压柱层析中，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶；所述中压柱层析流动相至少包括40～70％的甲醇水溶液；[0018] (E)制备型高效液相柱层析：步骤(D)得到的粗产品进行制备型高效液相柱层析，得到如式(1)所示的化合物。所述制备型高效液相柱层析中，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶；所述制备型高效液相柱层析流动相至少包括20～40％的乙腈水溶液。[0019] 步骤A中，药材的提取方法较多，包括渗漉法。渗漉法提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取能耗低，简便可行。渗漉法在常温下操作，亦不会造成热敏性有效成分的破坏。[0020] 步骤B中，萃取溶剂可以有多种选择，但至少要包括乙酸乙酯。乙酸乙酯极性大于现有技术中的石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿，能够将泽兰属植物提取物中倍半萜内酯类成分萃取完全；乙酸乙酯极性小于现有技术中的正丁醇，不但能将倍半萜内酯类成分完全萃取出来，还能够剔除一些易溶于正丁醇的极性较大的苷类杂质，从而使得泽兰属植物粗提物中倍半萜内酯类活性成分的含量更高，纯度更高。
[0011]
步骤C中，洗脱剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱剂选择性高，洗脱能力强，能够保证得到理化性能稳定、所述化合物分布集中的提取物。[0022] 所述的洗脱剂包括由体积比为20～0：1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂。[0023] 步骤D中，所述的中压柱层析为反相色谱，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶。所述中压柱层析流动相至少包括40～70％的甲醇水溶液。[0024] 步骤E中，所述的制备型高效液相柱层析亦为反相色谱，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶，流动相至少包括20～40％的乙腈水溶液。[0025] 为了取得更好的发明效果，以下作为本发明的优选：
[0021]
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说 明 书
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步骤(A)中，所述药材为野马追(Eupatorium lindleyanum DC.)的干燥全草，野马追被2015版中国药典收载，价廉易得。[0027] 所述提取溶剂为水、醇中的一种或两种，该提取溶剂使用安全、价廉、且具有较好的提取效率。进一步优选，所述提取溶剂为含乙醇质量分数为 90～95％的乙醇水溶液。该提取溶剂的性质非常适合于提取泽兰属植物干燥地上部分和/或全草，能够更加高效、完全地获取药用部位中的倍半萜内酯类活性成分，且能避免大量极性较大的非倍半萜内酯类杂质被提取出来。
[0028] 所述提取方法为溶剂提取法。进一步优选，所述提取方法为渗漉法。药材打粉，过40目筛，药粉润湿后装柱，加90～95％乙醇冷浸24h，渗漉，提取溶剂与药材的用量比为15～20L﹕1kg。该法提取效率高，提取溶剂用量少，常温下提取能耗低，且能避免热敏性活性成分的降解，渗漉设备简单，也能大量节约生产成本。[0029] 步骤(B)中，所述的萃取溶剂为石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水中的两种以上。萃取时按极性由小到大依次使用单一溶剂进行萃取。进一步优选，所述的萃取溶剂为石油醚、乙酸乙酯，萃取时按极性大小依次使用单一溶剂等体积进行萃取。根据相似相溶原理，分别通过上述萃取溶剂萃取，以使步骤A得到的药材提取液浓缩加水混悬后的溶液按照极性由小到大分离，通过薄层色谱(TLC)、LC-MS检识，泽兰属植物萃取液中的倍半萜内酯主要集中在乙酸乙酯萃取液中，其它萃取溶剂主要用于去除药材提取物中非倍半萜内酯类杂质，以得到富含倍半萜内酯的粗提物。因此，进一步优选，将乙酸乙酯萃取液浓缩，乙酸乙酯提取物上正相柱进一步纯化，其余的可以忽略，从而减少生产成本。[0030] 步骤(C)中，所述正相柱填料为100～200目的柱层析用硅胶或氧化铝。[0031] 所述的洗脱剂包括由体积比为20﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为15﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为10﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为6﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为3﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为2﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为1﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为0﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。采用石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱，该洗脱体系选择性高，洗脱能力强，通过TLC、LC-MS检识，本发明所述新颖倍半萜内酯几乎全部位于体积比为0﹕1的石油醚和乙酸 乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得泽兰属植物粗提物中新颖倍半萜内酯活性成分含量更高，分布更加集中。[0032] 步骤(D)(E)中，所述的中压色谱及制备型高效液相色谱填料均为十八烷基键合相硅胶，该填料对倍半萜内酯类化合物具有较强的选择性，分离效果好。中压柱层析，具有上样量大，分离效率高等优势。
[0033] 步骤(C)得到的富含新颖倍半萜内酯的提取物，用四氢呋喃溶解后，湿法上样，分别用45％、65％的甲醇水溶液洗脱，该流动相洗脱能力强，所述新颖倍半萜内酯几乎全部集中在65％甲醇水洗脱的部分流分中。
步骤(D)得到的富含新颖倍半萜内酯的粗产品，进行反相制备型高效液相柱层
析，用20～40％的乙腈水洗脱，进一步优选，用30％的乙腈水等度洗脱，洗脱所得部分流分蒸干，即得到所述新颖倍半萜内酯。所述新颖倍半萜内酯与另一倍半萜内酯类成分极性非
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说 明 书
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常相近，普通硅胶柱层析及反相中压柱层析，均难以将这两种物质分开。制备型高效液相色谱具有上样量大，柱效高，分离效率高等优点。实验中，首先，尝试用40％甲醇水系统为流动相制备分离，但未能将两种极性相近的倍半萜内酯有效分离，得到的所述新颖倍半萜内酯纯度较低，且分离效率亦非常低；随后，改用30％乙腈水为洗脱剂洗脱后，使得两种极性非常接近的倍半萜内酯类化合物达到了良好的分离。
[0035] 本发明还提供了一种所述的倍半萜内酯类化合物在制备治疗癌症药物中的应用。更具体地说，所述倍半萜内酯化合物对两种人源乳腺癌细胞，具有较显著的抑制作用。以MTT法，对得到的泽兰属植物中所述新颖倍半萜内酯化合物，进行了抑制人源肿瘤细胞株增殖活性研究，结果显示，本发明制备的新颖倍半萜内酯化合物对两株人源乳腺癌细胞具有较显著的抑制作用，给药24h后，半数抑制浓度IC50约为：2.67～3.05μmol/L。上述细胞株可采用市售产品，如：可采用美国模式培养物集存库ATCC(American type culture collection)的各种细胞株。
[0036] 本发明泽兰属植物中新颖倍半萜内酯化合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗癌症的药物。所述的药物可以为脂肪乳剂、注射油剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。[0037] 与现有的技术相比，本泽兰属植物中新颖倍半萜内酯化合物制备方法及其癌症治疗应用的优点在于：化合物结构新颖，生物活性强。利用系统 溶剂法及正相、反相色谱，中压、高压色谱，分离、纯化得到了一个结构新颖的倍半萜内酯化合物。使用的溶剂廉价易得，且毒性较低。本发明泽兰属植物中新颖倍半萜内酯的制备方法科学合理，操作简单，生产成本低，具有良好的应用前景。附图说明
[0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045]
图1(A)是化合物1的核磁共振氢谱。
图1(B)是化合物1的核磁共振碳谱。图1(C)是化合物1的DEPT谱。图1(D)是化合物1的H-HCSOY谱。图1(E)是化合物1的HSQC谱。图1(F)是化合物1的HMBC谱。图1(G)是化合物1的NOESY谱。图1(H)是化合物1的高分辨质谱。
具体实施方式
[0046] 以下通过具体实施例对本发明的内容作进一步详细的说明，但不应将实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段作出的各种替换手段或变更，均包含在本发明之内。[0047] 实施例1
本泽兰属植物中新颖倍半萜内酯的制备方法包括下述步骤：
[0049] A、提取：野马追药材打粉，过40目筛备用。取野马追药材粗粉2kg，加适量95％乙醇润湿后装柱，再加适量95％乙醇冷浸24h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当
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于药材质量的18倍量(总计用去95％的乙醇36L)。[0050] B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至近干，得稠浸膏84.3g，加水混悬至1L，分别用1L的石油醚、1L的乙酸乙酯，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到野马追石油醚萃取液，乙酸乙酯萃取液，通过TLC检识，野马追倍半萜内酯主要集中在乙酸乙酯萃取液中， 乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到野马追乙酸乙酯提取物57.2g。[0051] C、柱层析：取上述野马追乙酸乙酯提取物，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，分别使用多个不同的洗脱剂洗脱，各个洗脱剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为1.5L，各个洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为20﹕1，15﹕1，10﹕1，6﹕1，3﹕1，2﹕1，1﹕1，0﹕1并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经TLC、LC-MS检识，富含所述新颖倍半萜内酯的流分，主要集中在石油醚和乙酸乙酯0﹕1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到富含所述新颖倍半萜内酯的提取物9.5g。[0052] D、中压柱层析及制备型高效液相柱层析：取上述提取物约4.2g，进行中压柱层析分离，中压柱填料为十八烷基键合相硅胶，粒径为40-60μm，样品用四氢呋喃溶解后湿法上样，用45％、65％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约2L，收集65％甲醇水洗脱液对应的部分流分，减压回收溶剂，得到提取物约876mg，取该提取物约200mg，用流动相溶解后，进行反相制备型高效液相柱层析，用30％的乙腈水溶液等度洗脱，收集相应吸收峰对应流分，减压回收溶剂得到如式1所示化合物(C22H26O8)约43.8mg。[0053] 实施例2[0054] A、提取：取野马追药材2kg，加8倍量95％乙醇，85℃回流提取，每次提取时间为2h，共提取3次，合并3次提取液。总计用去95％的乙醇48L。[0055] B、萃取：将步骤A得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏92.7g，加水混悬至1L，分别用1L的石油醚、1L的乙酸乙酯萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到野马追石油醚萃取液，乙酸乙酯萃取液，通过TLC检识，野马追倍半萜内酯类成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到野马追乙酸乙酯提取物60.3g。[0056] C、柱层析：取上述野马追乙酸乙酯提取物，上100～200目的硅胶正相柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为1.5L，各个洗脱剂中石油醚和乙酸乙 酯的体积比分别为20﹕1，15﹕1，10﹕1，6﹕1，3﹕1，2﹕1，1﹕1，0﹕1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经TLC、LC-MS检识，所述新颖倍半萜内酯主要集中于石油醚和乙酸乙酯0﹕1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，即得到富含新颖倍半萜内酯的提取物11.2g。[0057] D、中压柱层析：取上述提取物约4.2g，进行中压柱层析分离，中压柱填料为十八烷基键合相硅胶，粒径为40-60μm，样品用45％甲醇水溶解后，湿法上样，用45％、65％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约2L，收集65％甲醇水洗脱液对应的部分流分，减压回收溶剂，得到提取物约816mg，取该提取物约200mg，用流动相溶解后，进行反相制备型高效液相柱层析，用30％的乙腈等度洗脱，收集相应吸收峰对应流分，减压回收溶剂得到如式1所示化合物(C22H26O8)约35.4mg。
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实施例3[0059] A、提取：野马追药材打粉，过40目筛备用。取野马追药材粗粉2kg，加适量95％乙醇润湿后装柱，再加适量95％乙醇冷浸24h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的18倍量(总计用去95％的乙醇36L)。[0060] B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至近干，得稠浸膏82.4g，加水混悬至1L，分别用1L的石油醚、1L的乙酸乙酯萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到野马追石油醚萃取液，乙酸乙酯萃取液，通过TLC检识，野马追倍半萜内酯主要集中在乙酸乙酯萃取液中，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到野马追乙酸乙酯提取物58.3g。[0061] C、柱层析：取上述野马追乙酸乙酯提取物，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的洗脱剂洗脱，各个洗脱剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为1.5L，各个洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为20﹕1，15﹕1，10﹕1，6﹕1，3﹕1，2﹕1，1﹕1，0﹕1并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经TLC、LC-MS检识，富含所述新颖倍半萜内酯的流分，主要集中在石油醚和乙酸乙酯0﹕1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到富含所述新颖倍半萜内酯的提取物8.9g。[0062] D、中压柱层析及制备型高效液相柱层析：取上述提取物约4.2g，进行中压柱层析分离，中压柱填料为十八烷基键合相硅胶，粒径为40-60μm，样品用四氢呋喃溶解后湿法上样，用45％、65％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约2L，收集65％甲醇水洗脱液对应的部分流分，减压回收溶剂，得到提取物约851mg，取该提取物约200mg，用流动相溶解后，进行反相制备型高效液相柱层析，用40％的甲醇水溶液等度洗脱，收集相应吸收峰对应流分，减压回收溶剂得到如式1所示化合物(C22H26O8)约22.3mg。[0063] 化合物1通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、二维核磁共振谱、高分辨质谱表征，具有如式(Ⅰ)所示化学结构。表征数据见表1。
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[0064] 表1：化合物的1H NMR(600MHz)、C NMR谱(150MHz)(δ，ppm，TMS，CDCl3)
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实施例2提取溶剂较实施例1多了6倍量，但所述新颖倍半萜内酯的得率较实施例1低，可见渗漉法对倍半萜内酯的提取效率较回流提取法高。回流提取法在85℃操作，若工业化大生产，其能源消耗也将增加生产成本；另外，85℃的高温也可能会引起热敏性倍半萜内酯的降解。实施例2步骤D，采用45％的甲醇溶解样品后，湿法上样，富含所述新颖倍半萜内酯的粗提物在45％甲醇水溶液中，溶解度较差，致使上样难度增大，故富含新颖环稀醚萜酯的提取物，在进行中压柱层析分离时，用四氢呋喃溶解后上样较优。[0067] 实施例3与实施例1相比较，提取、萃取、正相柱层析、中压柱层析工艺条件均完全相同。在对富含所述新颖倍半萜内酯的粗产品进行制备型高效液相柱层析时发现，若以甲醇水(比如：40％甲醇水)系统为流动相，所述新颖倍半萜内酯的目标色谱峰保留时间长，且与另一已知倍半萜内酯的色谱峰重叠在一起，虽一定程度上得到了所述新颖倍半萜内酯，但得率比实施例1降低了约1倍，在对实施例3所得到的所述新颖倍半萜内酯进行核磁共振图谱表征时发现，测试所得到的核磁共振图谱纯度均较差。可见在对所述新颖倍半萜内酯的粗产品进行制备型高效液相柱层析时，以乙腈水(如30％乙腈水)为流动相，具有目标成分得率高，纯度高等明显的优势。
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说 明 书
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实施例4
[0069] 新颖倍半萜内酯化合物体外抗肿瘤实验：[0070] 取对数生长期的人源肿瘤细胞株，消化计数后，按3×103个细胞/100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，用不同浓度的实施例1制备的所述新颖倍半萜内酯处理，每孔设三个复孔。药物与肿瘤细胞孵育24h后，加MTT，37℃继续孵育4h后，终止培养，用移液枪轻轻吸掉培养液，加入DMSO(150μL/孔)，振摇均匀后，用酶标仪在570nm处测定每个孔的光密度OD值，各平行孔的OD值取平均数，将各测试孔的OD值减去本底OD值。计算药物对肿瘤细胞的抑制率。
[0071] 抑制率＝(1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值)×100％。根据抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)，IC50用origin软件计算。实验重复3次，IC50取mean±SD。
[0072] 分别对人乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-468两株人源肿瘤细胞株进行试验，上述细胞株购自ATCC，具体结果如表2所示。表2的结果显示，所述新颖倍半萜内酯体外对两株人源乳腺癌细胞均具有显著抑制作用。[0073] 表2：新颖倍半萜内酯对人源乳腺癌细胞株的半数抑制浓度IC50值(mean±SD,n＝3)
[0074]
本发明制备得到的泽兰属植物中新颖倍半萜内酯化合物可与市售或者常用的载
体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗癌症的药物。所述药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。
[0076] 本发明制备所得泽兰属植物中倍半萜内酯化合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的倍半萜内酯化合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的药物可以通过常规途径给药，包括(但并不限于)：静脉、肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。本发明倍半萜内酯化合物可以被制成脂肪乳的形式，例如用注射用大豆油、卵磷脂、甘油和其它辅剂的水溶液，通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物如注射剂溶液宜在无菌条件下制造。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的倍半萜内酯化合物，还可以与其它抗肿瘤药物协同使用。[0077] 当本发明泽兰属植物中倍半萜内酯化合物被用做药物时，可将治疗有效剂量的倍半萜内酯化合物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。
[0075]
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改 或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
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说 明 书
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尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。
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说 明 书 附 图
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图1(A)
图1(B)
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说 明 书 附 图
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图1(C)
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说 明 书 附 图
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图1(D)
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说 明 书 附 图
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图1(E)
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说 明 书 附 图
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图1(F)
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说 明 书 附 图
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图1(G)
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说 明 书 附 图
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图1(H)
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