高效液相色谱法测定奈韦拉平的血药浓度

浓度

【关键词】 色谱法，高压液相；奈韦拉平；血药浓度 【关键词】 色谱法，高压液相；奈韦拉平；血药浓度

奈韦拉平（nevirapine）是人体免疫缺陷病毒(HIV1)的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI). 奈韦拉平与HIV1的逆转录酶(RT)直接连接并通过使此酶的催化端断裂来阻断RNA依赖和DNA依赖的DNA聚合酶活性［1-2］. 奈韦拉平不与底物或三磷酸核苷产生竞争. 我们旨在摸索一种简便、快速、专属性高的测定奈韦拉平血浆浓度的方法.

1材料和方法

1.1材料安捷伦1100液相色谱仪（美国安捷伦公司生产）；低温高速离心机（德国SIGMA公司生产）；振荡器（美国科尔帕默仪器公司生产）；万分之一天平（上海衡平仪器仪表厂生产）. 甲醇、乙腈，色谱纯，Merck公司生产；磷酸、磷酸二氢钠、三氯乙酸、三乙胺，AR级，上海化学试剂公司生产. 受试制剂：国产奈韦拉平胶囊剂（商品名艾极），批号0309001，每粒200 mg，浙江华海药业股份有限公司生产；国产奈韦拉平片剂（商品名艾太），批号0402004，每片200 mg，浙江华海药业股份有限公司生产；参比制剂： 进口奈韦拉平片（商品名维乐命），批号304185d，每片200 mg，德国勃林格殷格翰生产；奈韦拉平标准品，批号556503002，含量99.8%，浙江华海药业股份有限公司提供.

1.2方法

1.2.1色谱条件色谱柱： Hypersil C18柱（150 mm×4.6 mm， 0.5 μm）；流动相： 乙腈: 0.01 mol/L磷酸二氢钠（含0.01 mol/L三乙胺，磷酸调pH至5.0）=18:82；流速： 1.0 mL/min；柱温： 45℃；检测波长： 240 nm；进样量： 25 μL；灵敏度： 0.01AUFS.

1.2.2定性获取空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的二维色谱图，比较所测成分的保留时间及检测波长是否一致.

1.2.3血浆样品的预处理取0.2 mL血浆样品，加入20 μL 500 mL/L三氯乙酸，漩涡振荡，4℃下离心5 min（15000 r/min），取上清液25 μL进样，作HPLC分析.

1.2.4标准曲线的制备取健康人的空白血浆0.2 mL数份，加入奈韦拉平标准品，使其浓度分别为0.1， 0.5， 1.0， 2.0， 3.5和5.0 mg/L，按血浆样

品处理项处理后作HPLC分析. 以样品峰面积（A）对药物浓度（C）进行线性回归，计算回归方程.

1.2.5回收率与精密度考察配制含奈韦拉平的标准品0.2， 2.5， 4.5 mg/L的系列血样，日内各浓度重复进样5次，日间各浓度测定1次，连续测定5 d，以所测的浓度与已知浓度相比，计算血样中奈韦拉平的相对回收率和日内、日间精密度.

1.2.6药代动力学参数计算Cmax， tmax用实测值表示，AUC0-t用梯形法计算. AUC(0-∞)=AUC(0-t)+Ct/λZ， Ct为最后一点的血药浓度，λZ为末端相消除速度常数，t1/2可按t1/2=0.693/λZ求出.

2结果

2.1色谱分离与定性从加入标准品的血浆样品的二维色谱图可知，奈韦拉平在12.165 min出峰，比较空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的色谱图，奈韦拉平的保留时间基本一致，证明定性成功（图 1）.

A：空白血浆；B：加入标准品的血浆样品；C：待测血浆样品. 图1人血浆中奈韦拉平的高效液相色谱图

2.2线性关系回归方程： C=81.45A+58.65，相关系数（r）

=0.9995(n=6)，线性范围0.1~5.0 mg/L. 相关系数的显著性检验P<0.001，说明待测成分在所选的范围内线性关系良好. 本色谱条件下的最低检测浓度为0.1 mg/L. 2.3专属性本方法专属性高，在该色谱条件下，测得奈韦拉平保留时间为12.165 min，药物峰形良好，血浆中内源性杂质不干扰奈韦拉平的测定. 2.4精密度和回收率血样中奈韦拉平的相对回收率和日内、日间精密度，其结果见表1. 血样中奈韦拉平的相对回收率为99.41%~100.53%，日内、日间精密度小于10%，符合生物样品分析的有关要求.表1人血浆中奈韦拉平的精密度和回收率

2.5血药浓度时间曲线采用二重3*3拉丁方设计，24名受试者按照随机顺序接受3种药物（奈韦拉平国产胶囊剂、片剂与进口片剂）200 mg后的平均血药浓度时间曲线见图2. 结果显示，血样中奈韦拉平实测浓度均在本试验线性范围内.

图2奈韦拉平的平均血药浓度时间曲线 3讨论

测定人血浆中奈韦拉平浓度的方法有高效液相色谱法［3-4］和离子对色谱法［5］. 我们采用高效液相色谱法，血浆内源性杂质不干扰药物的测定. 采用

磷酸盐缓冲溶液，调节pH=5，以获得较好的分离度和较短的保留时间. 该方法符合人体药代动力学研究生物样品测定的方法学要求.

本实验中，对于流动相的选择和药物的萃取进行了大量探索工作，固相萃取可得到较高和较稳定的回收率［6］，却代价昂贵，应用500 mL/L三氯乙酸作为萃取溶剂，回收率高而且稳定，以乙腈和磷酸盐溶液作为流动相［7］，药物峰受到血浆内源性杂质峰干扰，磷酸盐溶液中加入三乙胺，消除杂质峰的干扰，实验方法有较高专属性.

奈韦拉平是一种抗艾滋病新药，有较多不良反应，会引起肝毒性和耐受性［8-9］. 本次试验过程因志愿者出现不良反应而脱落4例.

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