细菌OM27_clade在制备用于耐重金属辣椒品种分类的工具中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112680540 A(43)申请公布日 2021.04.20

(21)申请号 202110071527.3(22)申请日 2021.01.19

(71)申请人 贵州省蚕业研究所（贵州省辣椒研

究所）

地址 550006 贵州省贵阳市花溪区金欣社

区贵州省农科院蚕业研究所(72)发明人 邢丹　肖玖军　王岩　牟玉梅　

张芳　周鹏　(74)专利代理机构 北京预立生科知识产权代理

有限公司 11736

代理人 李红伟　孟祥斌(51)Int.Cl.

C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)

权利要求书1页 说明书11页 附图3页

(54)发明名称

细菌OM27_clade在制备用于耐重金属辣椒品种分类的工具中的应用(57)摘要

本发明公开了细菌OM27_clade在制备用于耐重金属辣椒品种分类的工具中的应用。在具体实施例中，本发明通过提取不同聚类分组的耐重金属辣椒的土壤DNA并测序，验证在不同聚类分组中OM27_clade的相对丰度差异，证明OM27_clade可应用于耐重金属辣椒品种分类。本发明提供了一种耐重金属辣椒品种分类的方法。

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权　利　要　求　书

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1.一种用于耐重金属辣椒品种分类的工具，其特征在于，所述的工具包括检测OM27_clade的产品，优选的，所述的重金属包括铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋，更优选的，所述的重金属为镉。

2.根据权利要求1所述工具，其特征在于，所述的产品包括能检测OM27_clade含量或丰度的试剂，优选的，所述的产品包括试剂盒、芯片或高通量测序平台。

3.根据权利要求2所述的工具，其特征在于，所述的试剂包括引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

4.权利要求1‑3任一项所述的工具在耐重金属辣椒品种分类中的应用。5.一种耐重金属辣椒品种分类的方法，其特征在于，所述的方法包括检测OM27_clade的含量或丰度，优选的，所述的重金属包括铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋，更优选的，所述的重金属为镉。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的OM27_clade的含量或丰度的检测方

16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或几种。法包括宏基因组测序、

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法为：(1)提取辣椒土壤的DNA；(2)以辣椒土壤的DNA为模板，进行16S测序；(3)分析测序结果，确定OM27_clade的含量或丰度；(4)根据OM27_clade的含量或丰度判断辣椒耐镉能力。

8.OM27_clade在制备提高辣椒耐重金属能力的物质中的应用，其特征在于，所述的重金属包括铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋，更优选的，所述的重金属为镉。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的物质包括促进OM27_clade含量或丰度增加的试剂，优选的，所述的物质包含OM27_clade。

10.微生物在筛选提高辣椒耐重金属能力的物质中的应用，其特征在于，所述的微生物为OM27_clade，优选的，所述的重金属包括铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋，更优选的，所述的重金属为镉。

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细菌OM27_clade在制备用于耐重金属辣椒品种分类的工具中

的应用

技术领域

[0001]本发明涉及生物技术和农业领域，具体涉及细菌OM27_clade在制备用于耐重金属辣椒品种分类的工具中的应用。

背景技术

[0002]我国土壤重金属污染形势严峻。近年来，我国土壤重金属污染事件频发，不仅对耕地与农产品质量构成严重威胁，还直接损害了民众身体健康，影响社会稳定。导致土壤环境

镉(Cd)、铅(Pb)、准金属砷(As)等生物毒性显著的元素，产生污染的重金属主要有汞(Hg)、

也包括有一定毒性的锌(Zn)、铜(Cu)、钴(Co)等常见元素。重金属在土壤中不能为微生物分解，因而会在土壤中不断积累，影响土壤性质，甚至可以转化为毒性更大的烷基化合物，被植物和其他生物吸收、富集，进而通过食物链在人、畜体内蓄积，直接影响植物、动物甚至人类健康。

[0003]辣椒是人们喜爱的蔬菜和调味品。我国在世界上拥有最大的辣椒种植和消费量，我国辣椒种植面积居蔬菜作物第二位，仅次于白菜。在四川、重庆、贵州、云南、湖南、江西、甘肃等地区，辣椒已成为当地的重要经济来源和主要支柱产业。辣椒生产加工的行业发展迅速，辣椒制品的种类日益增多，辣椒制品的交易额逐渐增长，部分产品还成为了我国重要的出口创汇产品。辣椒品种优化及安全高效生产在我国及区域性农业经济发展中发挥着重要的作用。有研究表明，重金属镉和汞是辣椒制品的主要污染元素并有超标现象出现。目前减少辣椒中重金属含量最经济、最有效的方法，就是通过选育重金属低积累辣椒品种来降低辣椒可食部位的重金属含量。

发明内容

[0004]本发明的目的是提供一种用于耐重金属辣椒品种分类的工具，为耐重金属辣椒品种的分类提供一种方法。

[0005]本发明一方面提供了一种用于耐重金属辣椒品种分类的工具，所述的工具包括检测OM27_clade的产品。

[0006]重金属为相对密度在4.5g/cm3以上的金属，本发明中所述的重金属包括但不限于铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋。[0007]进一步，所述的重金属为镉。[0008]进一步，所述的产品包括能检测OM27_clade含量或丰度的试剂。[0009]进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片或高通量测序平台。[0010]本发明所述的试剂盒可包括可密封的容器，所述可密封的容器被配置为接收生物样品。试剂盒可包括多核苷酸引物。所述的多核苷酸引物可被配置用于扩增来自OM27_clade的16SrRNA多核苷酸序列以形成扩增的16S rRNA多核苷酸序列。试剂盒可包括用于检测扩增的16S rRNA序列的检测试剂。试剂盒可包括使用说明书。

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所述的试剂盒还可包括用识别微生物特异性蛋白质的抗体包被的试纸条、洗涤溶

液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。这样的试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述的试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。[0012]术语“16S”、“16S核糖体亚基”和“16S核糖体RNA(rRNA)”可在本文中互换使用，并且可指指构成原核生物核糖体的30S小亚单位的rRNA，其一方面碱基序列的大部分被高度保留，另一方面部分区域显示出高的碱基序列多样性。特别是在同种之间几乎不存在多样性而异种间显示出多样性，因此通过比较16S rRNA的序列，能够有效鉴定原核生物。[0013]术语“芯片”可指具有附着有吸附剂的、一般为平面的表面的固体基底。生物芯片的表面可包含多个可寻址的位置，其中每个位置可结合有吸附剂。生物芯片可适合于接合探针接口，并因此用作探针。蛋白质生物芯片适用于捕获多肽，并可包含在可寻址位置处附着有层析或生物特异性吸附剂的表面。微阵列芯片一般用于DNA和RNA基因表达检测。[0014]在本发明中，作为能检测OM27_clade的试剂，可以使用能够特异性检测出特异性存在于样本内的OM27_clade的诸如蛋白、核酸、脂质、糖脂质、糖蛋白或糖(单糖类、二糖类、低聚糖类等)等之类的有机生物分子的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体、抗体等。[0015]术语“引物”指能够形成与模板链互补的碱基对(bas e pair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。[0016]术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。[0017]在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

[0018]本发明另一方面提供了上述的工具在耐重金属辣椒品种分类中的应用。[0019]本发明另一方面提供了一种耐重金属辣椒品种分类的方法，所述的方法包括检测OM27_clade的含量或丰度。[0020]术语“丰度”是指生物样品中目标微生物的数量的量度。“丰度”也被称为“负载”。一般通过分子方法，典型地通过例如荧光原位杂交(FISH)、定量聚合酶链反应(qPCR)或PCR/焦磷酸测序测定所述的目标微生物的16S rRNA基因拷贝数，进行细菌定量。生物样品内目标核酸序列丰度的定量可能是绝对的或相对的。“相对定量”通常是基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株的16S rRNA基因，比如使用通用引物并且将目标核酸序列的丰度表达为总细菌16S rRNA基因拷贝的百分比或通过大肠杆菌16S rRNA基因拷贝归一化而测定的细菌。“绝对定量”通过与DNA标准进行比较或通过DNA浓度归一化来给出目标分子

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的确切数目。[0021]进一步，所述的重金属包括铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋。[0022]进一步，所述的重金属为镉。[0023]进一步，所述的OM27_clade的含量或丰度的检测方法包括宏基因组测序、16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或几种。[0024]术语“宏基因组”涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。[0025]术语“测序”是指测定核酸分子(例如，DNA或RNA核酸分子)中的核苷酸碱基——A、T、C、G和U——的顺序的测序方法。[0026]在本发明的具体实施例中，所述的OM27_clade的含量或丰度的检测方法为16S测序。

[0027]进一步，所述的方法为：[0028](1)提取辣椒土壤的DNA；[0029]进行16S测序；(2)以辣椒土壤的DNA为模板，[0030](3)分析测序结果，确定OM27_clade的含量或丰度；[0031](4)根据OM27_clade的含量或丰度判断辣椒耐镉能力。

[0032]本发明另一方面提供了OM27_clade在制备提高辣椒耐重金属能力的物质中的应用。

[0033]进一步，所述的重金属包括铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋。[0034]进一步，所述的重金属为镉。[0035]进一步，所述的物质包括但不限于：泥炭、褐煤、风化煤、石灰、石膏、蛭石、膨润土、沸石、珍珠岩、海泡石、多糖类物料、纤维素物料、木质素物料、树脂胶物质、聚丙烯酸类物料、醋酸乙烯马来酸类物料、聚乙烯醇类物料、微生物制剂。[0036]进一步，所述的物质包括促进OM27_clade含量或丰度增加的试剂。[0037]进一步，所述的物质包含OM27_clade。

[0038]本发明另一方面提供了微生物在筛选提高辣椒耐重金属能力的物质中的应用，所述的微生物为OM27_clade。[0039]进一步，所述的重金属包括铜、铅、锌、锡、镍、钴、锑、汞、镉或铋。[0040]进一步，所述的重金属为镉。附图说明

[0041]图1是聚类分组样品谱系图

[0042]图2是聚类分组样品典则判别函数图

[0043]图3是聚类分组样品真菌群落相似性分析图

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图4是聚类分组样品细菌群落相似性分析图

图5是聚类分组样品的OM27_clade相对丰度散点图

具体实施方式

[0046]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。[0047]一、实验材料：[0048](1)辣椒[0049]表1、辣椒品种信息表编号品种名称辣椒类型编号品种名称辣椒类型

HZ1GJH2‑2①线椒HZ25h104‑2线椒HZ2H20线椒HZ27h034线椒HZ4SZ4‑4线椒HZ29YBJ‑16‑34朝天椒HZ5京球子椒朝天椒HZ44XD‑13朝天椒HZ6三棵树线椒HZ45XJ‑2‑1线椒HZ7铁壳辣椒线椒HZ46GJH‑1线椒HZ10F264(下)‑2线椒HZ48S27朝天椒HZ11YBJ‑16‑12线椒HZ51h104‑2线椒HZ12XJ‑16‑1朝天椒HZ52y175‑1线椒HZ17F351朝天椒HZ56H29T线椒HZ18S16朝天椒HZ60h097线椒HZ19F287‑2‑2朝天椒HZ62簇生大长指朝天椒HZ21y220♂变1‑1线椒HZ63大方线椒线椒HZ22H4‑1线椒HZ64h129线椒HZ23SZ4‑3②‑1朝天椒HZ66h119线椒HZ24XJ‑3线椒   [0051]注：品种编号都是科研人员自己定义，有些是地方品种名。[0052](2)土壤

[0053]采自贵州省赫章县耕地Cd污染土壤，为避免引起土壤二次污染，用不锈钢铲随机采集表层0‑20cm的混合土壤样品，并用干净的编织袋盛装。采回的土壤经自然风干，过5mm不锈钢筛并去除杂物，把土壤搅拌混匀备用。[0054]土壤成分含量如下：[0055]pH为7.39；有机质为78.33g/kg；全氮为3.70g/kg；全磷为2.84g/kg；全钾为1.23g/kg；碱解氮为173.77mg/kg；有效磷为146.18mg/kg；速效钾为159.75mg/kg；土壤总Cd为1.653g/kg。[0056](3)电感耦合等离子体质谱仪ICP‑MS(Thermofisher iCAP Qc)

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(4)微波消解仪

[0058]二、实验前准备[0059](1)辣椒种植[0060]A、辣椒育苗：本次研究共有31份辣椒材料进行个镉胁迫筛选，每个品种挑选饱满度一致的辣椒种子，通过漂浮育苗法培育辣椒幼苗，待其长出5‑6片真叶时，进行炼苗备用。[0061]B、移栽土处理：每盆装土量4.5kg，同时添加20g/盆水溶肥，将这些盆栽置于大棚内，一周后备用。[0062]C、移栽管理：挑选健壮、长势一致的辣椒幼苗移栽到Cd浓度盆栽土壤中，每盆1株。常规管理，干旱时浇灌无污染的自来水，缺肥时，施以水溶肥，且以不渗漏出托盘为宜。辣椒生长期间用自来水浇灌，待辣椒果实红熟。[0063](2)样本采集与处理[0064]辣椒成熟后，采摘果实清洗、烘干、研磨后备用。同时，以辣椒茎基部为中心画圆(半径为5cm)，用不锈钢勺子挖取圆圈内土壤，挖取深度10cm，将这部分土壤分为两份，一份用以测试土壤Cd含量(这部分土壤需要风干、剔杂物后，研磨过100目尼龙网筛)，一份用以分析微生物多样性(这部分土壤需要用灭菌后离心管收存，然后‑80℃保存)。[0065]三、实验方法[0066](1)检测Cd含量[0067]土壤Cd总量：称取经风干、除杂、研磨过100目尼龙筛的土壤样品0.1g(精确至0.0001g，下同)，加入微波消解管中，并加入6mL HNO3+2mLHCL+2mL HF进行微波消解，定容过滤后用电感耦合等离子体质谱仪ICP‑MS(Thermofisher iCAP Qc)测定土壤Cd总量。[0068]辣椒果实Cd含量：称0.2g样品于微波消解管中，加5mLHNO3过夜，加2mL 30％的H2O2后水冲罐壁，置微波消解仪中消解，消解结束后赶酸近至干，冷却、转移、定容至25mL容量瓶，过滤后用ICP‑MS测定Cd含量。[0069](2)通过聚类分析方法进行耐镉辣椒分类[0070]结合上一步得到的数据，通过公式计算辣椒Cd富集系数：[0071]富集系数＝辣椒不同部位Cd含量/土壤中Cd总量[0072]聚类分析方法：在SPSS软件中，选择“分析”→“分类”功能→“系统聚类”进入设置选项卡，将富集系数作为变量进行聚类分析。其中聚类方法为组间联接，度量标准中区间为平方Euclidean距离。[0073](3)微生物多样性分析[0074]A、DNA抽提

[0075]使用试剂盒完成基因组DNA抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

[0076]B、PCR扩增

[0077]按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。[0078]为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件：1)尽可能使用低循环数扩增；2)保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。[0079]PCR采用TransGen AP221‑02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；

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9700型；

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PCR仪：ABI

全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合

后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。[0082]C、荧光定量

[0083]参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM‑ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。[0084]D、Miseq文库构建

[0085]1)通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端；[0086]2)使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物；[0087]3)Tris‑HCl缓冲液洗脱，2％琼脂糖电泳检测；[0088]4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。[0089]试剂：TruSeqTM DNA Sample Prep Kit[0090]E、Miseq测序

[0091]1)DNA片段的接头序列与芯片上包埋的碱基序列互补，固定在芯片上；[0092]2)以DNA片段为模板，芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成，在芯片上合成目标待测DNA片段；[0093]3)变性、退火后，芯片上DNA片段的另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；[0094]4)PCR扩增，产生DNA簇；

[0095]5)DNA扩增子线性化成为单链。

[0096]6)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；

[0097]7)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；

[0098]8)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；[0099]9)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。[0100]F、数据处理

[0101]Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU进行多种多样性指数分析，基于OTU聚类分析结果，对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，对多样本的群落组成和系统发育信息进行多元分析和差异显著性检验等一系列深入的统计学和可视化分析。[0102]G、物种注释与评估[0103]OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系、属、种、分组等)设置的同一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作(cluster)。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。根据不同的相

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似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。

[0104]软件平台：Uparse(vsesion 7.1http://drive5.com/uparse/)[0105]OTU聚类步骤如下：

[0106]对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)；

[0107]去除没有重复的单序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)；

[0108]按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。

[0109]将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97％以上的序列，生成OTU表格。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：Domain(域)，kingdom(界)，Phylum(门)，Class(纲)，Order(目)，Family(科)，Genus(属)，Species(种)统计各样本的群落物种组成。[0110]比对数据库如下:

[0111]16s细菌和古菌核糖体数据库(没有指定的情况下默认使用silva数据库)：[0112]Silva(Release119 http://www.arb‑silva.de)；[0113]RDP(Release 11.1http://rdp.cme.msu.edu/)；[0114]Greengene(Release 13.5http://greengenes.secondgenome.com/)；[0115]ITS真菌：[0116]Unite(Release 6.0http://unite.ut.ee/index.php)的真菌数据库。[0117]功能基因：[0118]FGR，RDP整理来源于GeneBank的(Release7.3 http://fungene.cme.msu.edu/)的功能基因数据库。[0119]软件及算法：[0120]RDP Classifier(version 2.2http://sourceforge.net/projects/rdp‑classifier/)，置信度阈值为0.7。[0121]根据分类学分析结果，得知一个或多个样本在各分类水平上的分类学比对情况。在结果中，包含了两个信息：

[0122]1)样本中含有何种微生物；[0123]2)样本中各微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。[0124]物种差异分析根据得到的群落丰度数据，运用相关的分析方法进行分析，检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析模块的内容包括：组间差异显著性检验、Lefse多级物种差异判别分析。

[0125]组间显著性差异检验根据得到的群落丰度数据，运用严格的统计学方法，对不同组(或样本)微生物群落之间的物种进行假设检验，评估物种丰度差异的显著性水平，获得组(或样本)间显著性差异物种。该分析选择门、纲、目、科、属、种、OTU等不同分类水平。[0126]组间差异显著性检验的内容包括：

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1)卡方检验(chi‑square test)2)费舍尔检验(Fisher’exact test)3)T检验(Student’s t‑test(equal variance))4)Welch T检验(Welch’s t‑test(unknow variance))5)Wilcox秩和检验(Mann‑Whitney U test orWilcoxon rank‑sum tes)6)Kruskal_wallis秩和检验(Kruskal_Wallis H test)7)单因素Anova分析(one‑wayANOVA)四、实验结果

(1)31份不同品种辣椒材料的土壤与果实Cd含量及果实Cd富集系数(如表2所示)表2、辣椒材料的土壤与果实Cd含量及果实Cd富集系数

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(2)通过聚类分析进行辣椒分类结果：

[0141]根据SPSS输出结果将辣椒果实富集系数分为3类，代表高、中、低3种富集类型材料。图1中左侧数字代表辣椒品种编号，为简化去除HZ字母，1号和2号前“P”为品种拼音首字

距离为5时得垂直线划分，将材料分为3类：母。根据实验需求，以图中上方横坐标，

[0142]第一类，G1‑高HZ1、HZ4、HZ10、HZ24、HZ66[0143]第二类，G2‑低HZ2、HZ6、HZ17、HZ18、HZ19、HZ22、HZ25、HZ27、HZ44、HZ45、HZ46、HZ48、HZ51、HZ52、HZ56、HZ63[0144]第三类，G3‑中HZ5、HZ7、HZ11、HZ12、HZ21、HZ23、HZ29、HZ60、HZ62、HZ64[0145](3)辣椒聚类分组的合理性分析：[0146]表3辣椒聚类结果的方差分析结果

 F显著性土壤Cd含量5.7940.008果实Cd含量10.1780.000果实富集系数107.9110.000

[0148]从表中看出，根据果实富集系数分类，土壤和果实Cd含量、果实Cd富集系数都达到显著水平。如图2所示，聚类分类的3组样品均可明显区分出来。综上所述，根据果实富集系数进行聚类分析划分不同材料Cd富集特性是合理的。[0149](4)聚类分组样品的土壤微生物分类分析结果：利用ANOSIM(即相似性分析)来检验组间(两组或多组)的差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。其中：真菌分类结果如图3和表4所示，细菌分类结果如图4和表5所示。[0150]表4、聚类分组样品的土壤真菌分类分析统计表

[0151][0147]

[0140]

[0152][0153]

方法统计量

ANOSIM0.165表5、聚类分组样品的土壤细菌分类分析统计表

显著性

0.044

方法统计量显著性ANOSIM0.20660.015

[0154]从上述结果可以看到，通过利用相似性分析对依托聚类分组的真菌和细菌群落检验，组间差异大于组内，因此分组有意义，也表明不同Cd积累特性辣椒品种对组间差异有影响。[0155](5)分析聚类分组样品中OM27_clade相对丰度值的组间差异[0156]聚类分组样品中OM27_clade相对丰度值如图5所示，G2组OM27_clade相对丰度值高于G1G3组，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示OM27_clade可用于耐重金属辣椒品种分

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类。

[0157]

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本

领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

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图1

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图3

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图5

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