芪倍液体外抗Ⅱ型单纯疱疹病毒的实验研究

・３２・　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａ１　ｏｆ　Ｉｎｆｏｒｍａｔ　ｉｏｎ　ｏｎ　ＴＣＭ　０ｃｔ．２００８　Ｖｏ１．１　５　Ｎｏ．１０　芪倍液体外抗ＩＩ型单纯疱疹病毒的实验研究　邓洪漪　，姜惠中　，于翔　（１．中国人民解放军第１８７中心医院妇产科，海南海口５７１１５９；２．湖北中医学院附属医院妇产科，湖北武汉４３００６１）　摘要：目的研究芪倍液体外抗ＩＩ型单纯疱疹病毒（ＨＳＶ－ＩＩ）的作用机理。方法标。结果利用体外细胞培养技术，采用微　量细胞病变抑制法来研究中药各浓度组的抑制病毒增殖作用、直接杀伤病毒作用，以病毒滴度和抑制病毒指数为指　①抑制病毒增殖实验：芪倍液１．６３、０．８１、０．４１　ｍｇ／ｍＬ浓度组的病毒滴度与病毒对照组比较，差异有统　计学意义（Ｐ＜０．０１），抑病毒指数＞２；②直接杀伤病毒实验：芪倍液１．６３　ｍｇ／ｍＬ一８　ｈ组、１．６３　ｍｇ／ｍＬ－２４　ｈ组、０．８１　ｍｇ／ｍＬ－　２４　ｈ组的病毒滴度与病毒对照组比较，差异有统计学意义（ｐ＜０．０５），其余各组的病毒滴度与病毒对照组比较，差异无　统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　芪倍液具有抗ＩＩ型单纯疱疹病毒的作用。　关键词：宫颈糜烂；ＩＩ型单纯疱疹病毒；芪倍液；　病毒滴度；　抑制病毒指数　中图分类号：Ｒ２８９．１１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５．５３０４（２００８）１０．００３２．０２　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ－１Ｉ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ＤＥＮＧ　Ｈｏｎｇ．ｙｉ　，　ＪＩＡＮＧ　Ｈｕｉ—ｚｈｏｎｇ２，ＹＵ　Ｘｉａｎｇ１　ｆｌ，Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，１８７　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＰＬＡ，Ｈａｉｋｏｕ　５７１１５９，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＴｈｅＡｆｉｌｆｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｕｂｅｉ　ＴＣＭＣｏｌｌｅｇｅ，Ｗｕｈａｎ　４３００６１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ　ａｇａｉｎｓｔ　ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ－ＩＩ　【ＨＳｖ－ＩＩ）ｆ０ｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｅｒｏｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｍｉｃｒｏ—ｎｈｉｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｒｏ　ｃｅｌｔｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ　ｉｎ　ｎｈｉｉｂｉｔｉｎｇ　ＨＳＶ—ＩＩ　ｐｒｏｌｆｉｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｅ　ｔｄｉｒｅｃｔ　ｖｉｒｕｃｉｄａｉ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ　ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ　ａｓ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　①Ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　１．６３，０．８１，０．４１　ｍｇ／ｍＬ　Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ　ｒｏｕｐ　ｈａｄ　ｇｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜Ｏ．０１），ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｈｉｂｉｉｔｎｇ　ｎｄｅｘ＞２．②Ｄｉｉｒｅｃｔ　ｖｉｒｕｃｉｄａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ．ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｉｔｗｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，１．６３　ｍｇ／ｍＬ　Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ　ｎ　８　ｈ，２４　ｈ　ａｉｎｄ　０．８ｌ　ｍｇ／ｍＬ一２４　ｈ　ｇｒｏｕｐｓ　ｈａｄ　ｍａｒｋｅｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞Ｏ．０ｓ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ　ａｎｔｉｖｉｒｕｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＨＳＶ—ＩＩ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｅｒｏｓｉｏｎ：ｈｅｒｐｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ—ＩＩ；Ｌｉｑ　Ｑｉｂｅｉ；ｖｉｒｕｓ　ｔｉｔｅｒ；ｖｉｒｕｓ　ｉｎｈｉｂｉｉｔｏｎ　ｉｎｄｅｘ　宫颈糜烂是慢性宫颈炎的一种主要病理变化，是妇产科常　心１０　ｍｉｎ（１　０００　ｒ／ｍｉｎ），去沉淀，取离心上清液，滤膜除菌过滤，　然后用无菌Ｅａｇｌｅ维持液配成１３　ｍｇ／ｍＬ的中药干液，实验前用　Ｅａｇｌｅ维持液倍比稀释干液，配成９个浓度组，经￣ｒｒＴ比色分析筛　选出对Ｖｅｒｏ细胞无毒性的０．１１～１．６３　ｍｇ／ｍＬ的５个浓度组。　２实验方法　见病、多发病，其癌变率颇高。芪倍液在临床中以粉膜剂型用　于治疗宫颈糜烂　，经临床观察，疗效确切　。我们在临床研究　的基础上，针对其病毒病因学说，利用体外细胞培养技术，采用　微量细胞病变抑制法　，进行了芪倍液抗ＩＩ型单纯疱疹病毒　（ＨＳＶ—ＩＩ）作用的实验研究。　１　实验材料　１．１病毒　２．１抑制ＩＩ型单纯疱疹病毒增殖作用实验　制备６块Ｖｅｔｏ细胞培养板，吸除各Ｖｅｔｏ细胞培养板上的　培养液上清，用Ｅａｇｌｅ维持液将ＨＳＶ—ＩＩ病毒原液稀释成９个稀　释度的病毒混合液，每块细菌培养板均接种９个稀释度的病毒　混合液，每稀释度４孔，每孔５０　病毒混合液，每板均留４孔　ＨＳＶ－ＩＩ病毒株由武汉大学医学院病毒研究所馈赠。　１．２细胞　Ｖｅｒｏ细胞由武汉大学医学院病毒研究所提供，细胞传代　及其悬液制备方法参见文献［４］。　１．３培养液及试剂　Ｅａｇｌｅ培养液（Ｇ．吣：用于培养细胞。由ＤＭＥＭ（８９　ｍＩＪ）、胎牛　血清（１Ｏ　ＩＩＩＬ）及卡拉霉素（１０　０００　Ｕ／ｍＬ，１　ｍＬ）组成，用７．５％ＮａＨＣ０。　作正常细胞对照，病毒吸附１　ｈ后，弃上清液。　将各浓度组的药液分别加入其中５块已接种病毒的细胞　培养板上，每孔ｉ００　，每板１个浓度组，另用Ｅａｇｌｅ培养液取　代药液，加入剩下的一块细胞培养板上作病毒对照组。　将上述６块细胞培养板密封后置入３７℃、５％Ｃ０　培养箱　调ｐＨ至７．２，过滤除菌，４℃保存。Ｅａｇｌｅ维持液（Ｍ．Ｍ）：用于　维持细胞及稀释药物和病毒。除胎牛血清含２％外，其余成分同　中培养３　ｄ，每天在倒置显微镜下观察特征性细胞病变效应（以　下简称ＣＰＥ），记录ＣＰＥ程度，计算病毒ＴＣＩＤ　滴度及抑制病毒　Ｇ．Ｍ，用７．５％ＮａＨＣＯ　调ｐＨ至７．２，过滤除菌，４℃保存。　１．４药物　指数（抑病毒指数≥２则表明药物具有抗病毒作用，反之则　无）　，并确定药物的最小抑毒浓度（ＭＩＣ）。　芪倍液：将黄芪、五倍子、儿茶、乳香、没药等按照一定的　比例配伍，制成浓度为１３０　ｇ／ｌＯＯ　ｍＬ的中药原液，将其低速离　２．２　细胞外直接杀伤病毒实验　将各浓度组的药液分别与ＨＳＶ—ＩＩ病毒原液在试管内等量　２００８年１０月第１　５卷第１　０期　中国中医药信息杂志　４讨论　・３３・　混合，分别作用８　ｈ和２４　ｈ，然后将中药病毒混合液用Ｅａｇｌｅ　维持液作连续１Ｏ倍稀释，稀释成９个稀释度。将已稀释各浓度　组的中药病毒混合液接种到Ｖｅｒｏ细胞培养板上，每板１个浓度　ＨＳＶ—ＩＩ为单纯疱疹病毒血清ＩＩ型，属疱疹病毒科，主要引　起人体泌尿生殖器及腰部以下的皮肤感染。现已证实，ＨＳＶ—ＩＩ　组，每个稀释度４孔，每板均留有４孔作正常细胞对照，覆盖１　ｈ　后吸除上清，更换Ｅａｇｌｅ培养液取代药液作对照组，将上述各　块细胞培养板密封后置入３７℃、５％Ｃ０　培养箱中培养３　ｄ，如　与宫颈糜烂及宫颈癌的发生有关。钱氏等　艮道２８９例宫颈糜　烂患者的ＨＳＶ—Ｉ１分离阳性率是正常宫颈的ｌ１．８倍；曾氏等　利用ＰＣＲ技术检测宫颈糜烂患者ＨＳＶ—ＩＩ阳性率为３０．４％。除了　上法每天在倒置显微镜下观察，记录ＣＰＥ程度，计算病毒ＴＣＩＤ　滴度。　直接在糜烂宫颈检出ＨＳＶ—ＩＩ外，有人应用抗病毒的生物制剂　局部治疗宫颈糜烂后，ＨＳＶ—Ｉ１分离阳性率呈明显下降，并且与　２．３统计学方法　临床症状的改善有一定的平行关系　。由此可见，ＨＳＶ—ＩＩ与宫　颈糜烂的发病存在一定的因果关系。　本研究采用微量滴定ＣＰＥ抑制法来研究药物抗病毒作用，　以病毒滴度及抑制病毒指数为指标，通过中药在ＨＳＶ—ＩＩ感染　Ｖｅｔｏ细胞前后分别给药及中药在Ｖｅｔｏ细胞直接作用ＨＳＶ－ＩＩ等　以上各实验重复３次，所得病毒滴度、抑制病毒指数等数　据构成计量资料，采用　及ｑ检验进行统计学分析处理。　３结果　３．１　芪倍液对ＩＩ型单纯疱疹病毒增殖的抑制作用　当药物浓度在０．４１　ｍｇ／ｍＬ以下各浓度组时，其病毒滴度与　病毒对照组差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５），其抑制病毒指数＜２，说　几个方面的实验来探讨该药物的抗病毒作用及作用机理。实验　中所用药物浓度对细胞无毒性作用，可排除药物的细胞毒性作　明其对ＨＳＶ—ＩＩ病毒无抑制增殖作用；而药物浓度在０．４１　ｍｇ／ｍＬ　及其以上各浓度组时，其病毒滴度与病毒对照组比较，差异有统　计学意义（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），其抑制病毒指数＞２，说明其对ＨＳＶ—ＩＩ病毒　有抑制增殖作用，药物的最小抑毒浓度为０．４１　ｍｇ／ｍＬ。结果见　表１。　表１不同浓度芪倍液对ＨＳＶ－ＩＩ增殖的抑制作用　用，使结果可靠。实验研究表明，芪倍液在体外对ＨＳＶ—ＩＩ有抑　制其增殖的作用（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）；且有剂量依赖性，药物浓度越高抑　病毒作用越强，反之亦然。１．６３　ｍｇ／ｍＬ浓度组抑制病毒作用最　强，其抑制病毒指数为３．７２３；０．４１　ｍｇ／ｍＬ浓度组抑制病毒作　用相对较弱，其抑制病毒指数为２．０３３；在０．４１　ｍｇ／ｍＬ浓度　组以下，则无抑制病毒作用（Ｐ＞Ｏ．０５）。另外，芪倍液还具有杀　伤ＨＳＶ—ＩＩ的作用，且有剂量依赖性，并与作用时间有关。浓度越　高，时间越长，杀伤力越强，当药物与病毒作用８　ｈ，仅１．６３　ｍｇ／ｍＬ　浓度组具有杀伤病毒作用（Ｐ＜Ｏ．０５）；当作用２４　ｈ后，０．８１　ｍｇ／ｍＬ　浓度组亦有杀伤病毒作用（Ｐ＜Ｏ．０５），而其他浓度组则无杀伤　病毒作用（Ｐ＞Ｏ．０５）。　综上所述，适当浓度芪倍液无细胞毒性且能直接杀伤　ＨＳＶ—ＩＩ及抑制ＨＳＶ—ＩＩ在细胞内增殖。总之，本实验为中药在抗　病毒研究方面提供良好的方法，也为芪倍液的临床推广应用提　注：书于印病毒指数＝病毒对照组ＴｃＩＤ　ｏ对数值／芪倍液组ＴＣＩＤｓｏ对数　供了更加确实的实验数据，并为临床用药提供了剂量范围。　参考文献：　［１］徐谦，姜惠中．中药粉膜疗法治疗宫颈糜烂的临床研究［Ｊ］．中国中西　医结合杂志，１９９７，１７（６）：３６７－３６８．　值　３．２　芪倍液直接杀伤ＩＩ型单纯疱疹病毒的作用　当药物浓度与病毒在细胞外作用８　ｈ后，药物浓度在　１．６３　ｍｇ／ｍＬ时，其病毒滴度与病毒对照组比较，差异有统计学　意义（Ｐ＜Ｏ．０５）；而药物浓度在０．８１、０．４１　ｍｇ／ｍＬ时，其病毒　滴度与病毒对照组比较，差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。当药物　［２３李喜兰．中药粉膜疗法治疗宫颈糜烂１６４例［Ｊ］．中国中西医结合杂志，　２００４，２４（６）：５６２．　［３３杜平．医用实验病毒学［＾１］．北京：人民军医出版社，１９８５．１０８．　［４］吴怀安，赵刚．医学细胞生物学［伽．武汉：武汉大学出版社，１９９４．　１６２——１６３．　与病毒在细胞外作用２４　ｈ后，药物浓度在１．６３　ｍｇ／ｍＬ时，其病　毒滴度与病毒对照组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）；而药　物浓度在０．８１　ｍｇ／ｍＬ时，其病毒滴度与病毒对照组比较，差异　亦有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。说明药物有直接杀伤ＨＳＶ—ＩＩ作用，　且与药物浓度和作用时间有关。结果见表２。　表２不同浓度芪倍液对ＨＳＶ－ＩＩ的直接杀伤作用Ｃ　ｓ，ｌｇＴＣＩＤ　。／ｍＩ＿）　［５３陈瑞琪．紫草多糖在组织培养管内抑制单纯疱疹病毒的实验研究［Ｊ］．　江西医学院学报．１９８２，（２）：５－９．　［６３钱止维，毛淑娟，李玉英，等．子宫颈糜烂病因的探讨［Ｊ］．病毒学报，　１９８７，３（１）：１２～１８．　［７３曾三武．聚合酶链反应检测宫颈糜烂患者单纯疱疹病毒感染［Ｊ］．白求　恩医科大学学报，２００１，２７（１）：７５—７６．　［８］王晓霞，皮肖冰，伍启康，等．性病门诊妇女宫颈糜烂与单纯疱疹病毒　２型活动感染关系探讨及临床治疗初探［Ｊ］．中国艾滋病性病，２００４，　１Ｏ（５）：３６７—３６８．３７８．　（收稿日期：２００８－０２－１　３，编辑：华强）