正交试验优选天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的提取工艺

第３８卷第６期　２０１７年ｌ２月　吉林　医　药　学　院　学　报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｖｏ１．３８　Ｎｏ．６　Ｄｅｃ．２０１７　文章编号：１６７３．２９９５（２０１７）０６－０４１５－０３　・论著・　正交试验优选天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的提取工艺　朱鹤云　，张秀荣　，于德水　，张林摘颖　，李海鹏　郝乘仪　，吕　芳　，关　皎ｈ　（１．吉林医药学院药学院，吉林吉　１２１０００）　１３２０１３；２．解放军９３２６３部队场站医院，辽宁锦州要：目的　优选天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的超声提取工艺。方法　采用高效液相色谱法测定天麻中　天麻素与对羟基苯甲醇的含量，以乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因素，以天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的　含量为考察指标，采用Ｌ。（３　）正交试验优选最佳提取工艺条件。结果　最佳提取工艺为提取溶剂５０％乙醇，　提取时间１５　ｒａｉｎ，料液比ｌ：２０。结论关键该提取工艺具有效率高、时间短、能耗低、环保等优点，可为天麻中天　麻素与对羟基苯甲醇的工业化生产和新药开发提供依据。　词：天麻；天麻素；对羟基苯甲醇；高效液相色谱；正交试验　文献标识码：Ａ　中图分类号：Ｒ２８４．２　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｏｄｉｎ　ａｎｄ　４－ｈｙｄｒ０ｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｉｎ　Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｄａｔａ　Ｂｌｕｍｅ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ＺＨＵ　Ｈｅｙｕｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｕｒｏｎｇ　，ＹＵ　Ｄｅｓｈｕｉ　，ＺＨＡＮＧ　Ｙｉｎｇ　，ＬＩ　Ｈａｉｐｅｎｇ　，ＨＡＯ　Ｃｈｅｎｇｙｉ　，Ｌｔ０　Ｆａｎｇ　，ＧＵＡＮ　Ｊｉａｏ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｊｉｌｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ　Ｃｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，１　３２０　１　３；２．Ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ　Ａｒｍｙ　９３２６３　Ｔｒｏｏｐｓ，Ｊｉｎｚｈｏｕ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，１２１０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｏｄｉｎ　ａｎｄ　４一ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｉｎ　Ｃａｓｔ—　ｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ　Ｂｌｕｍｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ　ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｏｄｉｎ　ａｎｄ　４－ｈｙｄｒｏｘｙ—　ｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｉｎ　Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ　Ｂｌｕｍｅ．Ｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｏｄｉｎ　ａｎｄ　４一ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｉｎ　Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ　Ｂｌｕｍｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ａｓ　ｉｎｄｅｘｅｓ，Ｌ９（３　）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉ—　ｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗａｓ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｏｆ　５０％ｅｔｈａｎｏｌ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　１５　ｍｉｎ，ａｎｄ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｌｉｑ—　ｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１：２０．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｓｈｏｒｔ　ｔｉｍｅ，ｌｏｗ　ｅｎｅｒｇｙ　ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｏｄｉｎ　ａｎｄ　４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｉｎ　Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ　Ｂｈｍｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ　Ｂｌｕｍｅ；ｇａｓｔｒｏｄｉｎ；４一ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ；ＨＰＬＣ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　天麻为兰科植物天麻Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｄａｔａ　Ｂｌｕｍｅ的干　中的酚类化合物具有广泛的生物活性，如镇静、催眠、　抗惊厥、抗癫痫、益智、延缓衰老和神经保护等，还具　燥块茎，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国传　统贵重中药材，其味甘性平，归肝经，具有息风止痉、　平抑肝阳、祛风通络的功效　。天麻中的主要活性　有增强细胞免疫和机体非特异性免疫的作用　４。。目　前文献报道的天麻提取方法主要采用超声提取法　成分为酚类化合物，包括天麻素和对羟基苯甲醇等，　这类物质是天麻发挥药效的物质基础，文献报道天麻　基金项目：吉林市科技局杰出青年基金项目（２０１６６０２９）；吉林市科技　局杰出青年基金项目（２０１６６０３１）；吉林医药学院大学生创　新创业项目（２０１６）．　和回流提取法。。　，以天麻素作为检测指标，存在样品　处理复杂、提取时间长、检测指标少等缺点。本研究　以天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的含量为指标，采用　正交试验设计优选天麻中天麻素与对羟基苯甲醇提　取的工艺参数，为天麻的质量评价提供参考。　作者简介：朱鹤云（１９８３一），男（汉族），讲师，博士．　通讯作者：关皎（１９８３一），女（汉族），讲师，博士．　吉林医药学院学报２０１７年１２月　第３８卷　１仪器与试药　日本岛津Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　ＵＦＬＣ型超快速液相色谱　仪（配备ＳＩＬ－２０ＡＨＴ自动进样器，ＬＣ－２０ＡＤ二元泵，　ＣＴＯ一２０Ａ柱温箱，ＳＰＤ一２０Ａ紫外检测器，ＬＣ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　色谱工作站）；ＫＱ．２５０ＤＥ型数控超声波清洗器（江苏　昆山超声仪器有限公司）；ＣＰＡ　２２５Ｄ型十万分之一　电子天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；不锈钢电　热恒温水浴锅（北京医疗设备厂）；ＦＷ８０型微型高速　万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。　乙腈为色谱纯（美国Ｆｉｓｈｅｒ科技），所用水为娃　哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。对照品天麻素　（批号：１１０８０７．２０１６０８，纯度：９５．４％）与对羟基苯甲　醇（批号：１１１９７０—２０１５０１，纯度：９８．５％）均购自中国　食品药品检定研究院。　天麻药材（产地：四川）购自吉林市吉林大药房，　经吉林医药学院生药学教研室李景华副教授鉴定为　天麻为兰科植物天麻Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ　Ｂｌｕｍｅ的干燥块　茎，样本留存于吉林医药学院药学院中药样品室。　２方法与结果　２．１天麻素与对羟基苯甲醇的含量测定　２．１．１色谱条件　色谱柱为Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ　Ｃ】８（２）柱（２５０　ｍｍ×　４．６　ｍｍ，５　Ｉｘｍ），流动相为乙腈－０．０５％磷酸水（３：　９７，ｖ／ｖ），流速为１．０　ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２２０　ＨＥ，柱　温为３０℃，进样量为２０　Ｌ，色谱图见图１。　１．天麻素；２．对羟基苯甲醇　图１混合对照品（Ａ）和样品（Ｂ）的色谱图　２．１．２标准曲线的制备　精密称取对照品天麻中天麻素与对羟基苯甲醇　适量，用乙腈一水（３：９７，ｖ／ｖ）配成浓度为０．２　ｇ／Ｌ的　混合对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液０．１２５、　０．２５、０．５、１．２５、２．５　ｍＬ，置于５　ｍＬ量瓶中，用乙腈一　水（３：９７，ｖ／ｖ）稀释并定容至刻度，依次注入高效液　相色谱仪，测定色谱峰面积，以样品色谱峰面积（ｙ）　为纵坐标，浓度（Ｘ）为横坐标，进行线性回归。天麻　素的回归方程为：Ｙ＝４８０１Ｘ一３７４０．８，Ｒ＝０．９９９　９；对　羟基苯甲醇的回归方程为Ｙ＝８７５７Ｘ一１３７６，Ｒ＝　０．９９９　９。结果表明，天麻素和对羟基苯甲醇分别在　５～２００　ｍｇ／Ｌ和１～４０　ｍｇ／Ｌ浓度范围内与峰面积呈　良好的线性关系。　２．１．３供试品溶液的制备　取天麻药材粉末（过４０目筛）约２．０　ｇ，精密称　定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇５０　ｍＬ，称定重　量，超声处理（功率２５０　Ｗ，频率４０　ｋＨＺ）３０　ｍｉｎ，放　冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，精　密量取续滤液１０　ｍＬ，浓缩至近干无醇味，残渣加乙　腈一水（３：９７，ｖ／ｖ）溶解，转移至２５　ｍＬ量瓶中，用乙　腈．水（３：９７，ｖ／ｖ）稀释至刻度，摇匀，经０．４５　ｍ微　孔滤膜过滤，即得。　２．１．４精密度试验　分别精密吸取对照品溶液２０　Ｌ，按“２．１．１”项　下色谱条件连续进样６次，测定峰面积。结果，天麻　素峰面积的ＲＳＤ（ｎ＝６）为０．２％，对羟基苯甲醇峰面　积的ＲＳＤ（ｎ＝６）为０．１％。结果表明，仪器精密度良　好。　２．１．５稳定性试验　取同一批次的供试品溶液，放置于室温，分别于　不同时间（０、２、４、８、１２、２４　ｈ）进样测定，测定峰面积。　结果，天麻素峰面积ＲＳＤ（ｎ＝６）为１．３％；对羟基苯　甲醇峰面积ＲＳＤ（ｎ＝６）为１．８％。结果表明，供试品　溶液在２４　ｈ内稳定。　２．１．６重复性试验　取同一批天麻样品６份，精密称定，按“２．１．３”　项下方法制备供试品溶液，进样２０　，计算天麻素　与对羟基苯甲醇的含量，结果天麻素含量平均值　（ｎ＝６）为０．３２３％，ＲＳＤ为０．６％；对羟基苯甲醇含　量平均值（ｎ＝６）为０．０２８％，ＲＳＤ为１．１％。结果表　明，该方法重复性良好。　２．１．７回收率试验　精密称取已知含量的天麻样品粉末（天麻素与　第６期　朱鹤云，等．正交试验优选天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的提取工艺　对羟基苯甲醇含量分别为０．０７４％）９份，每份　０．２５　ｇ，分别加入相当于样品中天麻素与对羟基苯甲　醇含量８０％、１００％、１２０％的对照品溶液，各３份。　按“２．１．３”项下方法制备供试品溶液，进样分析，结　果天麻素与对羟基苯甲醇的平均回收率为分别为　９８．９％和９９．１％，ＲＳＤ分别为１．２％和０．８％。　２．１．８样品含量测定　取６批天麻样品粉末，按“２．１．３”项下方法制备　供试品溶液，进样２０　Ｌ，按“２．Ｉ．ｉ”项下色谱条件进　样分析。　２．２正交试验优化天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的　超声提取工艺　参考单因素考察结果，选择乙醇浓度（Ａ）、提取　时间（Ｂ）和料液比（Ｃ）３个因素，以天麻中天麻素与　对羟基苯甲醇总含量为考察指标，采用Ｌ　（３　）正交　设计表安排试验，因素水平见表１，正交试验结果见　表２，方差分析结果见表３。　由正交试验可知，以天麻素与对羟基苯甲醇的含　量为检测指标，各因素影响顺序为Ａ＞Ｂ＞Ｃ。优化　出超声法提取天麻中天麻素与对羟基苯甲醇的最佳　方案为Ａ　Ｂ　Ｃ　，即提取溶剂为５０％乙醇，提取时间为　１５　ｒａｉｎ，料液比为１：２０。　表１超声法因素水平表　１　１　０．３８３　１　２　０．３６９　ｌ　３　０．３３７　１　２　０．４０９　＇　３　０．２８４　１　０．３７２　３　ｌ　３　０．４２２　３　１　０．４１０　２　１　０．４１２　０．３６３　０．４０５　０．３８８　０．３６０　０．３５５　０．３５４　０．３９７　０．３８８　０．４１４　０．３７３　０．３４７　０．３８５　０．０５９　Ｏ．０５１　０．０５０　０．０２８　表３方差分析结果　２．３验证试验　取供试品３份，按照已确定的最佳工艺条件，重　复３次试验进行验证。天麻素与对羟基苯甲醇的含　量（％）平均值为０．５０１％，比正交试验中的最高提取　率（０．４２２％）高，证明本试验所确定的工艺条件为最　佳条件。　３讨论　本研究基于正交设计优选了天麻中天麻素与对　羟基苯甲醇的最佳超声提取工艺：提取溶剂为５０％　乙醇，提取时间为１５　ｍｉｎ，料液比为１：２０。结果表　明，本研究优选的提取工艺具有提取时间短、提取效　率高，溶剂消耗少等优点，可为天麻药材的药效物质　基础研究提供依据。　参考文献：　［１］　国家药典委员会．中华人民共和国药典：２０１５年版一部　［Ｓ］．北京：中国医药科技出版社，２０１５：５８－５９．　［２］李云，王志伟，耿岩玲，等．天麻素注射液的药理机制及　临床应用研究进展［Ｊ］．中国药房，２０１６，２７（３２）：４６０２—　４６０４．　［３］　龚其海，石京山，杨丹莉，等．天麻素在中枢神经系统的　药理作用及其机制［Ｊ］．中国新药与临床杂志，２０１１，３０　（３）：１７６—１７９．　［４］　岑信钊．天麻的化学成分与药理作用研究进展［Ｊ］．中　药材，２００５，２８（１Ｏ）：９５８－９６２．　［５］　谭沙，吴天祥，付红伟．天麻有效成分天麻素提取工艺的　优化研究［Ｊ］．食品科技，２０１０（９）：２３０－２３３．　［６］　田洋，肖蓉，徐昆龙，等．天麻中天麻素ＲＰ．ＨＰＬＣ测定及　提取工艺研究［Ｊ］．食品科学，２００９，３０（１０）：７７—８１．　［７］　肖慧，王跃生，陈莎，等．动态优化法在天麻提取工艺优　化中的应用［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１４，２０（２０）：　３５—３８．　（收稿日期：２０１７－０６－３０）