关于植物组培中MS培养基

培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。 大量元素(母液Ⅰ) mg/L NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl2·2H2O 8 800 MgSO4·7H2O 7 400 KH2PO4 3 400 微量元素(母液Ⅱ) KI 166 H3BO3 1 240 MnSO4·4H2O 4 460 ZnSO4·7H2O 1 720 Na2MoO4·2H2O 50

CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5 铁盐(母液Ⅲ) FeSO4·7H2O 5 560 Na2-EDTA·2H2O 7 460 有机成分(母液Ⅳ) ⅣA 肌醇 20 000 ⅣB 烟酸 100

盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 盐酸硫胺素(维生素B1) 100 甘氨酸 400

以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。

上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是:每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。 母液Ⅲ的配制方法是:将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是:分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。

配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量:母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。

配制培养液时应注意:①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制;②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次;③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。

溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的

搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。

调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4~7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。

2 BA为细胞分裂素 NAA 是萘乙酸，为生长素的一种 3 适于百合根的激素暂时没找到

以下是叶片和胚的激素:对麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)叶片进行离体培养 ,可成功获得无菌苗。试验结果表明 :培养基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L适于初代培养 ,有助于根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L适于增殖培养 ,利于愈伤组织的产生 ,并促进芽的分化 ;生根培养基为 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;当试管苗根长 1cm时移栽易成活

在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培养基上培养 ,蔗糖含量为 6 %~ 8%时 ,百合幼胚胚性生长最好 ,培养 30 d后可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培养基上可以形成淡绿色的愈伤组织 ,将这些愈伤组织转移到 1 / 2 MS无激素的培养基上培养可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽

后 ,其成活率可达90 %以上

马铃薯脱毒技术介绍

一、脱毒与组培:要想弄清楚脱毒技术之前需先了解什么是组织培养(简称组培，亦叫植物克隆)。组织培养( Tissue culture )是指从体内取出器官(部分)、组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存、生长，维持其正常结构和功能的方法。其基本原理基于细胞的全能性， 即正常生物体的每一个细胞，都含有该物种的全部遗传信息，在一定的条件下都具有发育成一株完整个体的潜在能力。就操作方法简单而言，组培就是根据需要把所取的植物材料经过一系列灭菌消毒处理后栽植到无菌培养基上，给予特定的培养环境(温湿度和光照)，使之逐步成长为独立的植株。而植物脱毒技术是利用植物茎尖组织培养,结合血清学病毒检测技术,在防蚜传毒条件下,将影响作物正常生长的植物病毒全部脱除的高新农业技术。通常将一两个叶原基的茎尖接种在一定的培养基上,进行无菌培养,直到长成试管苗,在确定不带任何病毒的情况下,快速繁育脱毒苗,以供推广应用。植物脱毒技术,实际上就是“克隆技术”在农业生产中的应用。由此可知，脱毒技术是建立在组培技术基础上的，即组培是脱毒的基础，脱毒时取的材料比正常组培的要求高、培养方式更复杂，而且对瓶苗出苗后的后续栽植有更高的要求。

二、什么是马铃薯脱毒: 在马铃薯栽培过程中，出现叶片皱缩卷曲，叶色浓淡不均，茎秆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量逐年下降等现象，就表明马铃薯已经发生“退化”。种薯“退化”是病毒的侵染及其在

薯块内积累造成的，也是引起产量降低和商品性状变差的主要原因现已发现，造成马铃薯退化的病毒有30余种，严重为害马铃薯的病毒有六种:马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯S病毒(PVS)及马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)。但作为下代“种子”的薯块由于病毒的不断侵染和积累，又不能自身清除体内的病毒，导致植株病毒病逐年加重，使植株在生产过程中不能充分发挥品种的生产特性，造成严重的减产。只有采用现代生物技术将种薯内的病毒去掉，恢复马铃薯品种本身的生理功能和生产特性，才能防止马铃薯的“退化”，使之达到育种家培育品种本身的商品性状和产量。这就是种薯需要脱毒和采用脱毒种薯能够大幅度提高产量的重要原因。 马铃薯脱毒就是取马铃薯茎尖分生组织进行组培，采用物理或化学的方式脱除已经侵入马铃薯植株体内的各种病毒后，在隔离毒源的条件下繁殖的、不带任何病毒的马铃薯种薯。由于去除了病毒的危害，因此极大地提高了产品质量和产量。 三、马铃薯脱毒种薯在生产上有哪些优越性? ①脱除了主要的马铃薯病毒，恢复了原品种的特征特性，达到了复壮的目的。同时，在脱毒过程中也将其所感染的真菌和细菌病原物一并脱除，所以，脱毒薯在一定时期内，没有病毒、细菌和真菌病害，其生活力特别旺盛。 ②提高了产量。因为没有各种病毒和病害，脱毒种薯的生长势很强，原品种的特征和特性充分表现出来，增产十分显著，一般增产30~70%，甚至翻番。 ③提高了质量。脱毒种薯生产繁殖的马铃薯不仅薯块变大了，而且商品薯率大幅度提高，极大地避免了种植感病种薯易引起

的腐烂、尖头、龟裂、畸形、疮疤等现象，显著提高了产品的质量。 ④减少了种薯的运输费用。脱毒种薯由于采用了高密度繁殖技术，种薯体积相对较小，便于运输，显著减小了种薯的运输费用。 四、脱毒种薯是怎样获得的? 马铃薯脱毒种薯是采取如下一系列技术措施获得的:首先将带毒薯在室内催芽、消毒处理;然后在超净工作台无菌条件下，切取茎尖分生组织，移植于试管中培养，大约4个月后，茎尖分生组织长成试管苗;试管苗经过病毒检测，从大量植株中鉴定出确实不带病毒的脱毒苗;再经过切段快繁和在温室和网棚内繁殖，获得脱毒微型小薯或原原种;再繁殖即可获得原种，原种再繁殖成一级种薯、二级种薯和三级种薯，经过上述途径获得的种薯一般统称为脱毒种薯。 常见的脱毒马铃薯种薯主要有:大西洋、费乌瑞它、紫花白、台湾红皮等。 五、主要脱毒方法: 1 取材和消毒 将欲脱毒的品种块茎催芽,芽长4~5cm时,剪芽并剥去外叶,自来水下冲洗40min,于无菌室内用漂白粉溶液消毒后,无菌水冲洗2~3次。 2 剥离和接种 在无菌室内,于40倍的解剖镜下,剥取带1个叶原基的茎尖,接种于MS茎尖培养基的试管中。试管中的MS茎尖培养基包括大量元素、微量元素、有机成分和生长素、细胞分裂素、蔗糖和琼脂,pH值为5.8,经高压灭菌后使用,每试管接种1个茎尖。 3 培养条件 接种的茎尖培养于25℃、1500~3000lx光照条件下培养室内,3个月则长成3~4片叶的小植株。在无菌条件下,进行切段扩繁1次,取部分苗进行病毒检测。 4 病毒检测 病毒检测是茎尖脱毒不可缺少的步骤,常用鉴别寄主即指示植物或血清学方法进行检测。经多次检测,及时淘汰血清学阳性

反应或在指示植物上有症状的茎尖苗,无任何反应的茎尖苗即脱毒苗用作繁殖。 六、产业前景 马铃薯加工增值能力强。据了解，其加工成淀粉可增值1倍;加工成乳酸可增值3倍;加工成食品可增值4倍;生产高吸水性树脂可增值8倍;加工成变性淀粉可增值15倍;生产生物胶增值在60倍以上。马铃薯精淀粉经过发酵或采用其他方法可生产300多种变性淀粉，可广泛应用于医药、纺织、铸造、染料等多种工业。 据预测，到2030年，我国马铃薯淀粉需求量高达300万吨，届时，我国将成为亚太地区乃至全球的马铃薯食品生产加工、贸易的产业中心，马铃薯产业前景广阔。 济南浩隆生物科技有限公司 欢迎您的咨询

组培应用之茎尖脱毒

日期：2010年4月1日 来源：互联网 作者：植物组培网 点击：3634

1、理论依据

（1）植物细胞全能性学说 1943年White提出了“植物细胞全能性”学说。1958年，Steward和Reinert对这一学说进行了验证，即一切植物都是由细胞构成的，植物的幼龄细胞含有全套遗传基因，具有形成完整植株的能力。

（2）植物病毒在寄主体内分布不均匀 怀特（1943）和利马塞特.科钮特（1949）发现，植物根尖和茎尖部分病毒含量极低或不能发现病毒。植物组织内的病毒含量随与茎尖相隔距离加大而增加。究其原

因可能有四个方面：其一，一般病毒顺着植物的微管系统移动，而分生组织中无此系统；病毒通过胞间连丝移动极慢，难以追上茎尖分生组织的活跃生长；其二，活跃生长的茎尖分生组织代谢水平很高，致使病毒无法复制；其三，植物体内可能存在“病毒钝化系统”，而在茎尖分生组织内活性应最高，钝化病毒，使茎尖分生组织不受病毒侵染；其四，茎尖分生组织的生长素含量很高，足以抑制病毒增殖。 2、脱毒方法

（1）培育脱毒母株，获得外植体

a.正确选择品种。用于生产的品种选择很重要。因不同品种产量、品质特性及对病毒侵染的反应不同，关系到去病毒的增产效果和脱毒种苗的应用年限。因此，要选择品质好，产量高，抗、耐病毒病性好的品种。

b.确保品种纯度。确保获取快繁外植体母株的品种纯度是生产高纯度、优质种苗的基础。特别是栽培历史长的无性繁殖作物，用种量大、易造成品种混杂。因此严格鉴定获取快繁外植体母株的品种纯度，可避免无效劳动，提高工作效率。

c.获得外植体。外植体可直接取于大田，但最好取于室内培育的，选择生长健壮、无病虫害的母株，既不受季节影响，又易消毒。 （2）选择培养基。研究确定的基本培养基有许多种，其中MS适合于大多数双子叶植物，培养基B5和培养基N6适合于许多单子叶植物，WHITE培养基适于根的培养，应先试用这些培养基再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整。一般培养用MS培养基均能成功，但

大蒜、洋葱用B5和N6培养基较好。

激素浓度和相对比例的确定。用不同种类的激素进行浓度和比例的配合试验。在比较好组合基础上进行小范围的调整，设计出新的配方，经过反复摸索，选出一种适合培养基。

（3）剥离和接种 将处理好的植物部分，如包含茎尖的茎段或芽等灭菌，置超净工作台40倍显微镜下，剥去外叶和较大的叶原基，暴露出生长点分生组织，剥离带1~2个叶原基的分生组织，接种到试管内的芽分化培养基上。

（4）继代培养生根和快繁 将已接种外植体的试管置（23±2）℃，光照3000LX，在光周期13-16H/D的培养基中培养2-3周成苗。待苗长至1-2CM高，转入生根培养基，生长7-10D生根，转入快繁培养基继续繁殖。

3、茎尖培养的关键技术环节

要提高茎尖培养成苗率和脱毒必须掌握下列关键环节

（1）剥取适当大小的茎尖 通常培养茎尖越小，产生幼苗的无毒率越高，而成活率越低。不同病毒种类去除的难易程度不同。因此需针对不同的病毒种类，培养适宜大小的茎尖。例如剥离培养带一个叶原基的生长点产生的马铃薯植株，可去处全部马铃薯卷叶病毒，去除80%Y病毒和A病毒，去除0.2%X病毒。马铃薯病毒去除从易到难的顺序是：马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒、马铃薯Y病毒、奥古巴病毒、马铃薯M病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒和纺锤块茎类病毒。对于同一种病毒，剥离茎尖越小，脱毒率越高。大蒜带1个叶原基的

茎尖产生苗中84%检测不到病毒，而带2-3个叶原基的无毒株率仅59%。因此，一般剥离带1-2个叶原基的茎尖即可获得较好的脱毒效果。对于难脱除的病毒则应配合采用其他措施。

（2）选用正确的培养基 培养基由大量元素（无机盐）、微量元素、有机成分、植物激素、糖和琼脂调配而成。一般铵盐及钾盐浓度高，有利于茎尖成活，反之则有利于生根或根生长，植物激素对茎尖的生长和发育有重要作用。植物细胞分裂素类如6-BA有利于长芽，而生长素类NAA有利于生根。不同品种对激素的反应不同。

（3）适宜的环境条件 大蒜、马铃薯、草莓接种后置温度23-25℃，光照1000-3000LX，每日照光13-16H。甘薯茎尖培养需温度较高，约26-32℃，光强和照光时间同马铃薯和大蒜。

（4）茎尖接种后的生长及调节方法 茎尖接种后的生长情况主要有4种。1）生长正常，生长点伸长，基本无愈伤组织形成，1-3周内形成小芽，4-6周长成小植株。2）生长停止，接种物不扩大，渐变褐色，至枯死。此情况多因剥离操作过程中茎尖受伤。3）生长缓慢，接种物扩大缓慢，渐转绿，成一绿点。说明培养条件不适应，要迅速转入高激素浓度培养基，并适当提高培养温度。4）生长过速，生长点不伸长或略伸长，大量疏松愈伤组织形成，需转入无激素培养基或采取降低培养温度等措施。

组培应用之诱变育种

选育丰产、优质的植物新品种，对丰富人们日益增长的物质生活具有重要的意义。由于主要靠无性繁殖的植物，如大蒜、姜其品种差异多源于自然变异，差异小，而且产生变异需要的时间长。不能进行常规的有性杂交，就难以充分利用丰富的遗产多样性，因而限制了品种改良。早在20世纪50年代，CRANHALL和ZWINTZSCHER等育种学家就开始探索突变育种技术，在40多年的发展过程中，从诱变剂的利用到诱变手段及分离筛选技术这一套诱变体系日趋完善。 近年来，我国组织培养技术迅速发展和普及，组织培养技术和诱变技术相结合，能有效地避免嵌合体的形成，具有不受环境条件限制、高效低耗，扩大变异谱和提高变异率等优点。可以用来对原生质、悬浮培养物、愈伤组织体系和花药培养体系以及产生的植株进行福照诱变，进而作体外筛选。组织培养技术和诱变技术相结合。在加速育种进程，提高育种效率，改进育种技术方面具有很大潜力，育成新品种的种类和数量也不断增加。 植物组织培养与诱变相结合技术

1、用诱变剂处理单细胞、愈伤组织或原生质体

用诱变剂处理单细胞和原生质体可以避免或限制嵌合体的形成。在甜橙原生质体培养基中加入EMS，接种培养2周后用X射线照射，经8-10周培养，可成功地诱导甜橙原生质体产生胚状体并再生植株。用EMS处理和X射线照射处理猕猴桃和苹果原生质体也获得再生植株。用诱变剂处理后的外植体或愈伤组织上单细胞（或少数细胞）分化成植株变异率增加。

2、用诱变剂处理花药

用诱变剂处理花药，经离体培养诱发突变，获得突变体，通过染色体加倍，得到稳定而纯合的突变系。辐射后的花粉培养集中了单倍体育种和辐射育种的优点，提高了诱变频率，克服了嵌合现象，后代分离小、易稳定。

3、用诱变剂处理离体培养茎尖

采用不同辐射剂量、剂量率处理植物茎尖分生组织，离体培养芽、嫩枝、不定芽等，可获得有益变异，如株高，果皮色，产量等性状的变异。用Y射线照射柑橘茎尖组织诱变，可收到扩大突变范围的效果，人工诱变率提高到4.49%（自然突变频率0.75%-1.3%）。 4、用诱变剂处理愈伤组织

用Y射线（30GY）照射水稻花药愈伤组织可促进分化。剂量超过40GY会抑制分化。将大蒜初萌发幼叶片切成3CM长条接种到MS+2.4-D2MG/L+水解酪蛋白500MG/L+酵母提取物100MG/L的培养基上，置温度25度，光照3000LX，16H/D条件下培养70D，生成类似球状结构的愈伤组织，然后用Y射线（1-10GY）照射这些球状体愈伤组织，在经60D培养获得大量有诱发突变的愈伤组织球状体。将愈伤组织球状体分离、继代培养，同时进行病原接种或逆镜压力筛选，最终获得有益的突变系。

5、植物组织培养结合诱变技术的关键问题 （1）选定合理的辐照受体和部位 （2）筛选出适宜的剂量和剂量率

（3）采用正确的体外选择方法