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GST蛋白纯化

2024-02-09 来源:易榕旅网


GST的蛋白表达:

转化BL21,挑菌,酶切验证,接种到250 ml的2YT带Amp的培养基,接种比例一般为1:100,每3小时测一次。37度 250转 3小时,OD一般为0.6-1.5,加1M IPTG(终浓度为0.1 mM) 诱导在30度 4小时,5000g 10分钟收集细胞,晚上冻在-80度。

裂解:STE裂解液(10mM Tris-HCl pH8.0;150 mM NaCl;1mM EDTA),加100ug/ml lysozme, 1mM PMSF, 10mMDTT,),冰上20min 转动。加1%的triton-100,超声250s,12000g 30min 取上清,12000g20min 再取上清。

纯化:活化beads(用500ul PBS洗涤3次),放入上清结合,室温2h;用加入(1% triton-100,1mM PMSF, 10mMDTT 0.5-1 M NaCl)的PBS wash 4次 elution3次。

Elution Buffer:100 mM Tris-HCl pH8.0, 1% triton-100,1mM PMSF, 10mMDTT 150 mM NaCl 15mM glutathione)。

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