不同浓度间歇性低氧时Nrf2的表达及其抗氧化能力

Electronic Journal of Clinical Medical Literature

2019 年第 6 卷第 32 期2019 Vol.6 No.32

不同浓度间歇性低氧时Nrf2的表达及其抗氧化能力

孟婷婷，尚丛珊，马怀芬，白 宏，贺 喜（西安培华学院医学院，陕西 西安 710065）

【摘要】探讨不同浓度间歇性低氧时Nrf2的表达，研究其低氧应激下的抗氧化能力，利用分光光度计测定血清中低氧应激前、后超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽还原酶（GR）活性及丙二醛（MDA）含量。结果显示肺组织Nrf2阳性颗粒表达，低氧组Nrf2染色阳性颗粒显著多于常氧组。在常氧和5%低氧组，雌雄间超氧化物歧化酶（SOD）活性无显著性差异，10%低氧组，雌性超氧化物歧化酶（SOD）活性显著高于雄性（0.01＜P＜0.05）。在常氧和5%低氧组SD大鼠过氧化氢酶（CAT）雌雄间无显著性差异；7.5%低氧组，雄性CAT活性高于雌性（0.01＜P＜0.05）。5%低氧组，SD大鼠CAT活性无显著性变化，7.5%低氧组，CAT活性显著性升高（0.01＜P＜0.05）。SD大鼠谷胱甘肽还原酶（GR）活性雌雄变化趋势一致。SD大鼠丙二醛（MDA）含量在常氧和低氧组处理后无显著差异，10%低氧组，MDA含量明显增加（0.01＜P＜0.05），随着低氧浓度加强，MDA含量有上升趋势，在7.5%低氧后显著增加（0.01＜P＜0.05）。

【关键词】间歇性低氧；SOD；CAT；GR；MDA

【中图分类号】R56 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8242.2019.32.76.02

睡眠呼吸暂停综合征（Sleep apnea syndrome，SAS）一种常见的疾病，患者夜间睡眠时出现打鼾，且鼾声不规律，甚至出现呼吸暂停，自觉憋气，其可并发肺动脉高压、肾功能损伤、心律失常和脑血管疾病等，严重者可引发猝死[1]。SAS患者的病理改变有间歇性低氧、高碳酸血症、胸内压改变和睡眠周期紊乱等，这一系列变化会导致交感神经兴奋、代谢紊乱、氧化应激和神经体液调节功能改变等，可对机体内脏造成严重损害。

氧化应激产生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）能够直接或间接的损伤蛋白质、脂质、核酸等大分子物质，造成机体功能紊乱而引发众多疾病[2]。核因子NF-E2相关因子（Nrf2）是一个相对分子量为66000的蛋白，由2.2KD的碱基对编码，人类Nrf2基因位于2号染色体长臂3区1带，含有6个不同的同源结构域，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelck-like ECH-associat-edprotein1， Keap1）结合，处于活性状态，易于被降解，而核内少量的Nrf2可维持下游的靶基因的转录水平[3]。Nrf2-Keap1通路中，Keap1用于负调节Nrf2。当亲电体与Keap1结合后会改变其构型，使其无法和Nrf2结合，从而使Nrf2足量到达细胞核内，成功激活下游基因的上调。该通路是脊椎动物细胞抗氧化和低氧应答的关键通路[4]。且研究结果表明Nrf2-Keap1通路的8种基因表现出极强的保守性，其中下游6种基因的保守性高于Nrf2，但是并未出现明显的氨基酸替换。但在两种哺乳生物中Keap1的212位的酪氨酸被半胱氨酸所代替[5]。通过模拟的3D图显示该氨基酸位于一个螺旋的外侧，且处于一个亲电结合域中，推测该替换使得Keap1发生构型改变，易于和亲电体结合，从而使得Nrf2甚至在常氧及中度低氧环境中都有较高的表达量，进而使其具有较高的耐缺氧和抗癌特性。

这提示当机体处于氧化应激时， Keap1构想发生改变，Nrf2则游离进入细胞核，便可转录调控下游靶基因，这包括多种保护性基因的表达如抗氧化蛋白类基因，主要的抗氧化蛋白酶有：血红素加氧酶（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物

酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）及氧化还原酶等起到抗氧化，抑制组织损伤，保护细胞的作用[6]。

研究发现在中枢系统、心血管系统、消化系统以及肾、肺等组织的疾病发生和防治中，Nrf2具有重要的作用，可成为多器官系统疾病发生的潜在靶点。SAS的病程呈现反复缺氧再快速复氧类似于缺血-再灌注损伤，可使机体内产生过量的氧自由基，从而产生大量的活性氧（ROS），使抗氧化能力降低，体内氧化-抗氧化失衡，会导致结构和功能受损，造成组织的器官损害。

1 实验动物

成年雄性SD大鼠200～220 g，共30只，购自西安交通大学动物中心，雌雄均可，喂食普通鼠粮。

2 实验方法

2.1 实验分组

30只成年雄性SD大鼠随机分成5组，常氧组、5%氧浓度组、7.5%氧浓度组、10%氧浓度组、12.5%氧浓度组。

2.2 样品制备低氧后，20%氨基甲酸乙酯麻醉，采用真空抗凝管进行腹主动脉取血，取部分于抗凝处理后的离心管中，低温冷冻离心机（德国SIGMA）3000 r/min离心5 min，取上清。用紫外分光光度计（上海天美UV2300）测定SOD、GPX和MDA含量。

2.3 肺组织Nrf2的检测动物低氧处理后，20%氨基甲酸乙酯麻醉，剖开胸腔，暴露出心脏，并做前固定，由左心室注0.1 mol/L PBS 250 ml+4%多聚甲醛-PB（4℃）约250 ml，同时剪开右心房放血，迅速取下肺组织，于4%多聚甲醛-PB进行后固定24～48 h（4℃），石蜡包埋。根据兔抗大鼠免疫组化检测试剂盒说明操作，采用SP法，DAB显色，染色阳性颗粒细胞呈棕黄色。

项目来源：2018年西安培华学院校级科研科题作者简介： 孟婷婷（1983-），女，汉族，陕西省西安市人，陕西师范大学生命科学学院，硕士研究生，西安培华学院医学院讲师，研究

方向：比较神经生理学

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2.4 数据统计与分析

利用SPSS 17.0软件分析实验结果，数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示，取单因素方差分析比较组间差异，0.01＜P＜0.05为差异显著。

4 讨 论

生理条件下，机体内活性氧（ROS）产生和清除处于动态平衡，当活性氧增加时会攻击机体，产生氧化应激[7]。活性氧的强氧化作用可生成脂质过氧化物，可降解成丙二醛（MDA），因此丙二醛（MDA）是反映脂质过氧化（lipid peroxide，LPO）水平的一个重要指标。体内具有能够清除活性氧等自由基的酶被称为抗氧化酶，机体内存在着强大的抗氧化酶系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、和谷胱甘肽还原酶（GR）[8]。

本实验中，低氧12.5%内，丙二醛（MDA）水平无显著变化，说明机体可以对抗低氧所产生过多的活性氧，避免脂质过氧化，以维持机体稳态。同时机体内抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）等抗氧化酶系统被激活，其酶活性迅速增加，以便及时清除体内过多的自由基。丙二醛（MDA）含量始终处于低水平，说明在抗氧化酶作用下，较少受到低氧损伤。

3 实验结果

3.1 测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）的活性

比较低氧组和常氧组，随低氧浓度不断增加，SOD活性逐渐增强，雌雄变化趋势一致。5%低氧后SOD活性升高，与常氧组比较无差异，7.5%低氧后SOD活性较常氧升高（0.01＜P＜0.05）。比较常氧和5%低氧，雌雄间超氧化物歧化酶（SOD）活性无显著性差异，10%低氧组，雌性超氧化物歧化酶（SOD）活性显著高于雄性（0.01＜P＜0.05）。

7.5%低氧组，CAT活性降低，与常氧相较无变化，10%低氧组，过氧化氢酶（CAT）活性显著性升高（0.01＜P＜0.05），之后趋于稳定；雌雄间变化趋势一致。在常氧和5%低氧组SD大鼠过氧化氢酶（CAT）活性雌雄间无显著性差异；7.5%低氧后，雄性CAT活性显著高于雌性（0.01＜P＜0.05）。5%低氧后，CAT活性较常氧无变化，7.5%低氧后，CAT活性显著性升高（0.01＜P＜0.05）。

谷胱甘肽还原酶（GR）活性雌雄变化趋势一致。5%、7.5%、10%低氧组，谷胱甘肽还原酶（GR）活性变化没有显著性差异，7.5%低氧后，GR活性显著性升高（0.01＜P＜0.05）。

3.2 丙二醛（MDA）含量变化SD大鼠丙二醛（MDA）含量在常氧和低氧组处理后无显著差异，10%低氧后MDA含量增加（0.01＜P＜0.05），随低氧浓度加强，MDA含量有所上升，7.5%低氧后显著性增加（0.01＜P＜0.05）。

3.3 Nrf2蛋白在肺组织的表达免疫组化检实验结果显示，Nrf2染色阳性颗粒细胞呈亮黄色，于400倍镜下每张片随机选取5个视野观察，Image pro-plus软件测量肺组织Nrf2阳性颗粒表达，低氧组Nrf2染色阳性颗粒显著多于常氧组。见图1。

参考文献

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析.临床耳鼻喉科杂志.2002,16(8):395-396.

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stresses activate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity of keap1[J].Mol cell Biol,2006,26(1):221-229.

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[8] 黄丽英,翁锡全,林 文,潘海燕,黄利军.间歇低氧训练对抗氧化

酶系统及其适应能力的影响.广州体育学院学报,2007,27(2).

本文编辑：吴 卫

常氧组 低氧组

图1

（上接75页）

志物再次升高，延缓病情进展，改善其生存质量及预后效

果，安全性高，值得推广。

志物升高二线治疗的价值[J].实用医学杂志,2016,32(12):1975-1979.

[2] 陈传喜.新辅助化疗对晚期乳腺癌患者血清肿瘤标志物及转移

浸润相关指标的影响[J].海南医学院学报,2016,22(2):172-174.

参考文献

[1] 蔡雅虹,姚广裕,陈路嘉,et al.晚期乳腺癌治疗后单纯血清肿瘤标

本文编辑：吴 卫