坎地沙坦对人乳腺癌细胞株MCF-7生长抑制作用的研究

实用医学杂志２０１４年第３０卷第４期　５１１　坎地沙坦对人乳腺癌细胞株ＭＣＦ一７生长抑制　作用的研究　林淑慧　谢国柱　张静芳蔡小慧　姚奇伟　孙权权　王玮　袁亚维　摘要　目的：探讨血管紧张素Ⅱ１型受体（ＡＴ１Ｒ）拮抗剂坎地沙坦对人乳腺癌细胞系ＭＣＦ一７的生长抑　制作用．为ＡＴ１Ｒ拮抗剂在乳腺癌中的应用提供实验依据。方法：噻唑蓝（ＭＴＦ）比色法检测坎地沙坦对乳腺　癌胞ＭＣＦ．７细胞的生长抑制率，计算半数抑制浓度（Ｉｃ　）。流式细胞仪分析坎地沙坦对ＭＣＦ一７细胞周期和　凋亡的影响。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测经坎地沙坦处理前后ＭＣＦ．７细胞中野生型ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎ的蛋白表达差异。结　果：坎地沙坦能够显著抑制乳腺癌细胞ＭｃＦ．７的增殖．使细胞凋亡显著增强。促使细胞发生Ｇ１期周期阻　滞，减小了ｓ期细胞比例，上调其野生型ｐ５３和下调ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白表达水平。结论：坎地沙坦在体外抑制　ＭＣＦ．７细胞生长．诱导细胞发生周期阻滞和凋亡，机制可能与其调节ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白的表达有关。　关键词乳腺肿瘤；　坎地沙坦；　细胞周期阻滞；　凋亡；ｐ５３；Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　Ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌＩｌｉｎｅ　ＭＣＦ－７　ＬＩＮ　Ｓｈｕ一　，ＺＨＡＮＧ￣ｎｇ－ｆａｎｇ，ＣＡＩ　Ｘｉａｏ—ｈｕｉ，ＸＩＥ　Ｇｕｏ—ｚｈｕ，ＹＡ０　Ｑｉ—ｗｅｉ，ＳＵＮ　ＱＭ肌一ｑｕａｒｔ，ＹＵＡＮ　Ｙａ—ｗｅｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉ￣ｉｏｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，　Ｎａｎｆａｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔｌ，Ｓｏｕｔａｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０５１５，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＹＵＡＮ　Ｙａ—ｗｅ　Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕａｎｙｗ６６＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　１１　１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＴ１Ｒ）　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ｃａｎｄｅｓａ￣ａｎ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＭＣＦ一７．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＭＣＦ一７　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｏｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃａｎｄｅｓａ￣ａｎ　ｗｉｔｈ　ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃａｎｄｅｓａ￣ａｎ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＭＣＦ一７　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ　ｐ５３　ａｎｄ　Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｃａｎｄｅｓａ￣ａｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａ　ｄｏｓｅ—ａｎｄ　ｔｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＭＣＦ一７　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇ１　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＭＣＦ－７　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｃａｎｄｅｓａａａｎ　ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｗｉｌｄ・ｔｙｐｅ　Ｐ５３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｈｅ　Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＭＣＦ・７　ｃｅｌｌｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｓｕｇｇｅｓｔｓ　ｔｈａｔ　ｃａｎｄｅｓａ￣ａｎ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｅ　Ｇ１　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＭＣＦ一７ｃｅｌｌｓｂｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｐ５３　ａｎｄ　Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；　Ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ；Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｐ５３；Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　血管紧张素Ⅱ受体（ＡＴＲ）拮抗剂是目前最常　用的高血压一线治疗药物之一。血管紧张素ＩＩ　１型　受体（ＡＴ１Ｒ）是ＡＴＲ的一个亚型。ＡＴ１Ｒ拮抗剂选　择性阻断ＡＴ１Ｒ，副作用小，安全性和耐受性好…。　在卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌等多种肿瘤中，已发现　ＡＴ１Ｒ的表达与恶性肿瘤细胞的侵袭及转移密切相　关，而ＡＴ１Ｒ拮抗剂可减少肿瘤血管生成和肿瘤转　移．拮抗ＡＴ１Ｒ可能成为一种有效的抗癌手段［２－－４］。　乳腺癌是当前威胁全球妇女生命健康最常见　的恶性肿瘤，目前国内外尚未有关于ＡＴ１Ｒ拮抗剂　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００６—５７２５．２０１４．０４．００４　基金项目：国家自然科学基金（编号：８１２７２５０８）；国家自然科学基　金（编号：８１３０２３２６）；广东省自然科学基金（编号：￥２０１１０４０００３４６５）；　高等学校博士学科点专项科研基金（编号：２０１１４４３３１１００１５）　作者单位：５１０５１５广州市，南方医科大学南方医院肿瘤放射治　疗科　通信作者：袁亚维Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕａｎｙｗ６６＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ　坎地沙坦直接杀伤乳腺癌细胞及诱导其凋亡的报　道。在此，我们研究了坎地沙坦对乳腺癌ＭＣＦ．７细　胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响．检测细胞内　野生型ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎ的蛋白表达差异，揭示ＡＴ１Ｒ　拮抗剂抑制乳腺癌细胞生长作用及部分机制。　１材料与方法　１．１材料与仪器　１．１．１　细胞来源及培养人乳腺癌细胞株ＭＣＦ．７　（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）　在含５％ＣＯ：、３７￣Ｃ饱和湿度的培养箱中用含１０％　胎牛血清（美国Ｇｉｂｃｏ公司）的ＤＭＥＭ培养基（美　国Ｇｉｂｃｏ公司）培养，用０．２５％胰蛋白酶（美国　Ｇｉｂｃｏ公司）消化传代。　１．】．２试剂及仪器坎地沙坦（Ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ，日本　Ｔａｋｅｄａ公司）用ＤＭＳＯ（美国Ｓｉｇｍａ公司）配制成　１０　ｍｍｏｌ／ｍＬ的储存液，使用时用ＤＭＥＭ培养基　稀释成所需浓度。噻唑蓝（ＭＴＦ）购于美国Ｓｉｇｍａ　５１２　公司。兔抗人ｐ５３单克隆抗体、兔抗人ｓｕｒｖｉｖｉｎ单　克隆抗体购自美国Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。　细胞周期检测试剂盒购自南京凯基公司　细胞凋　亡试剂盒购自美国Ｉｎｔｒｏｖｉｇｅｎ公司。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｍ５　多功能酶标仪为美国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ公司产品　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ流式细胞分析仪为美国ＢＤ公司产　品。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ所用电泳仪及转膜仪均购自美国　Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司，发光成像采用ＫｏｄａｋＦ多功能活体　成像仪。　１．２方法　１．２．１体外ＭＴＩ＂法测定细胞增殖抑制取对数生　长期的ＭＣＦ．７细胞，调整细胞数为１×ｌ０ｓ个／ｍＬ，　接种于９６孔培养板，每￣ｂＤｌ：ｉ入细胞悬液１００　Ｌ　于培养箱中培养，待细胞贴壁后加入含不同浓度　坎地沙坦的完全培养液１００　Ｌ（终浓度分别为：　２．５、５、１０、２０、４０　ｐ￣ｍｏｌ／ｍＬ），ｌ司时设立０．４％ＤＭＳＯ　对照组和空白对照组，每个浓度设６个复孔。分别　培养２４、４８、７２　ｈ。各孔加入５　ｍｇ／ｍＬ　ＭＴＴ　２０　ｔｘＬ，　继续培养４　ｈ，加入１５０　Ｌ　ＤＭＳＯ，测定５７０　ｎｍ处　各孑Ｌ吸光度ＯＤ值。增殖抑制率（％）＝１００％一（实验　组ＯＤ值一空白组ＯＤ值）／（对照组ＯＤ值一空白组　ＯＤ值）Ｘ　１００％。改良寇式法计算坎地沙坦对　ＭＣＦ．７细胞的半数抑制浓度。实验重复３次。　１．２．２细胞周期检测　取对数生长期ＭＣＦ．７细胞　消化传代．待细胞贴壁后更换含１０　ｐ￣ｍｏｌ／ｍＬ坎地　沙坦或含等体积ＤＭＳＯ（０．１％）的培养液，继续培　养２４　ｈ后，终止培养，按细胞周期检测试剂盒说　明书处理细胞，流式检测细胞周期　实验重复３　次。　１．２－３　细胞凋亡检测　取对数生长期ＭＣＦ一７细胞　消化传代，待细胞贴壁后更换含１０￣ｚｍｏｌ／ｍＬ坎地　沙坦或含等体积ＤＭＳＯ（０．１％）的培养液，继续培　养４８　ｈ后，终止培养，按细胞凋亡试剂盒说明书　处理细胞，流式检测细胞凋亡。实验重复３次。　１．２．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ检测相关蛋白表达水平　含　１０￣ｍｏｌ／ｍＬ浓度的坎地沙坦分别作用于ＭＣＦ一７　细胞０、６、２４　ｈ后，检测两组细胞ＧＡＰＤＨ、野生型　ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白的表达：提取细胞总蛋白，通过　聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素滤　膜上，脱脂奶粉封闭后分别加入一抗、二抗孵育，　化学发光试剂盒显色，进行发光成像。采用Ｂｉｏ．　Ｒａｄ公司Ｑｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ软件分析条带的灰度值，结　果以目的条带与组内参照的灰度值比值表示。　１．２．５统计学方法采用ＳＰＳＳ　１３．０统计软件进　行分析，实验数据用　±ｓ表示，组间比较采用方　差分析和两独立样本ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差异具　有显著性。　实用医学杂志２０１４年第３０卷第４期　２　结果　２．１　坎地沙坦抑制乳腺癌细胞株ＭＣＦ一７的增殖　Ｍ１Ｔｒ实验结果显示，２．５￣ｚｍｏｌ／ｍＬ的坎地沙坦　作用于ＭＣＦ．７细胞２４　ｈ即可抑制ＭＣＦ一７细胞的　生长．４０￣ｍｏｌ／Ｌ浓度坎地沙坦作用７２　ｈ后的抑　制率最高（９６．６３±２．２４）％（表１，图１）。不同时间　点抑制率比较可见显著性差异（　＝３　３７７．５９，Ｐ＜　０．０５），即随着时间的延长，坎地沙坦对乳腺癌　ＭＣＦ一７细胞的抑制率逐渐升高；不同浓度抑制率　比较亦可见差异有显著性（Ｆ：１　９７９．６８，Ｐ＜　０．０５），即随着药物浓度的增加，坎地沙坦对乳腺　癌ＭＣＦ．７细胞的抑制逐渐增强：同时时间和浓度　间存在交互效应（Ｆ＝２９９．６６，Ｐ＜０．０５），即随着时　间的延长和浓度的增加。坎地沙坦对乳腺癌ＭＣＦ　７细胞的抑制率逐渐升高。ＩＣ∞在２４、４８、７２　ｈ分别　为（３８．５４±１．２３）￣ｘｍｏｌ／ｍＬ、（２１．５７±０．７０）￣ｚｍｏｌ／　ｍＬ、（８．６６±０．２５）￣ｍｏｌ／ｍＬ。　表１坎地沙坦对ＭＣＦ一７细胞的增殖抑制作用ｘ±　注：与组内对照比较，　Ｐ＜０．０５　１００　７５　一　一　褂５Ｏ　器　器　２５　０　０　１Ｏ　２Ｏ　３０　４０　浓度（　ｍｏｌ／ｍＬ）　图１　坎地沙坦对乳腺癌细胞株ＭＣＦ一７的增殖抑制作用　２．２坎地沙坦作用于ＭＣＦ．７细胞后发生了Ｇｌ期　阻滞坎地沙坦组（１０￣ｚｍｏｌ／ｍＬ）与对照组的流式　细胞术检测结果比较，提示两组间的细胞周期百分　比情况差异显著。ＭＣＦ．７细胞经坎地沙坦处理２４　ｈ　后．Ｇ１期细胞比例明显增大，ｓ期细胞比例减小，　差异均具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（表２，图２）。　２．３　坎地沙坦直接诱导ＭＣＦ一７细胞凋亡　流式　细胞术检测发现经坎地沙坦（１０￣ｚｍｏｌ／ｍＬ）处理４８　实用医学杂志２０１４年第３０卷第４期　表２坎地沙坦作用于ＭＣＦ一７细胞后的周期变化　±Ｓ　注：与对照组比较，　Ｐ＜Ｏ．０５　昌ｎ　０９　０８　０　Ｄｉｐｌｏｉｄ：１００．００％　Ｄｉｐ　ＧＩ：８０．０１％ａｔ　７７　５０　Ｄｉｐ　Ｇ２：１．４６％砒１５５．Ｏ１　Ｄｉｐ　Ｓ：１８．５２％Ｇ２／ＧＩ：２．０００　％ＣＶ：３．６４　Ｊ　ｌ　一　０　５０　１００　１５０　２００　２５０　０　５０　１００　１５０　２００　２５０　对照组　坎地沙坦组　图２流式细胞术检测坎地沙坦对ＭＣＦ一７细胞周期变化　的影响　ｈ后细胞凋亡率较对照组显著上升。坎地沙坦组凋　亡发生率为（２８．１３±１．７１）％，对照组凋亡发生率是　（１．９３－／－０．７５）％，ｔ＝一２４．２３３，Ｐ＜０．０５，提示坎地沙　坦能够显著诱导乳腺癌ＭＣＦ．７细胞凋亡（图３）。　＋　。。　。　。　Ｏ１　Ｑ２　ＱＩ　●●　≯　甜　霹　Ｆｎ℃－Ａ　ＦｆｆＣ－Ａ　对照组　坎地沙坦组　图３流式细胞术检测坎地沙坦对ＭＣＦ．７细胞凋亡的影响　２．４坎地沙坦作用于ＭＣＦ．７细胞引起相关蛋白　表达水平变化　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示１０　ｐ．ｍｏｌ／　ｍＬ坎地沙坦处理ＭＣＦ．７细胞６、２４　ｈ后，野生型　ｐ５３蛋白表达水平明显升高，并呈现时间依赖性。　而ｓｕｒｖｉｖｉｎ的蛋白表达水平在坎地沙坦处理６　ｈ后　有所下降，２４　ｈ后呈现明显降低（图４）。　对照组６ｈ　２４ｈ　５３　一５３　ｋＤ　ｓｕｒｖｉｖｉｎ——　—　獬一１６　ｋＤａ　ＧＡＰＤＨ——　■　一３７　ｋＤａ　图４　ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白表达变化情况　３讨论　乳腺癌是全球女性的常见恶性肿瘤，手术、放　化疗和内分泌治疗是目前的主要治疗手段。但在　部分患者中其疗效仍不尽人意，因此新的、安全高　５１３　效的抗乳腺癌新药亟待开发。血管紧张素Ⅱ（Ａｎｇ　Ⅱ）是ＲＡＳ系统（ｔｈｅ　ｒｅｎｎｉｎ—ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ）中　最具活性的成分．也是ＲＡＳ系统中最重要的效应　因子之一。通过ＡＴＲ介导产生血管收缩和促炎症　效应＿５＿　。研究发现，在各种恶性肿瘤组织中存在局　部ＲＡＳ，Ａｎｇ　ｌＩ通过自分泌及旁分泌作用于肿瘤细　胞，起到促进肿瘤细胞增殖、促进肿瘤血管生成及　抑制肿瘤细胞分化的作用［８＿　。因此通过阻断　ＡＴＲ及其下游分子所转导的信号途径．也许可达　到抑制肿瘤细胞增殖的目的，对研究和开发新的　抗癌药具有重要临床意义。本研究将ＡＴ１Ｒ拮抗剂　坎地沙坦应用于乳腺癌ＭＣＦ．７细胞。通过体外实　验证实，坎地沙坦可明显抑制乳腺癌细胞的生长，　并且此抑制作用呈剂量与时间依赖性。　肿瘤的发生发展与细胞增殖失控、分化障碍　及凋亡受阻密切相关。ｐ５３蛋白是一种涉及细胞周　期调节和细胞凋亡的核蛋白．有野生型和突变型　两种。野生型ｐ５３为抑癌基因，可抑制细胞的分裂　和增殖，还能启动细胞程序化死亡过程，防止细胞　的恶性转化。当细胞ＤＮＡ受损时，野生型ｐ５３基　因过度表达．使受损细胞停留在Ｇ１到ｓ期修复或　发生凋亡［１０］。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是凋亡抑制蛋白家族的成　员，研究发现ｓｕｒｖｉｖｉｎ是内在肿瘤生长调节网络的　通用靶位，无论是抑癌基因还是致癌基因．也不管　是何种因子或何种途径，都可能作用于ｓｕｒｖｉｖｉｎ靶　点再发挥相应作用［ｎ］。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ与ｐ５３在肿瘤的发　生发展过程中起着重要作用，两者之间的关系密　切，他们可以通过直接信号通路相互作用。有研究　表明，过度表达的ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白。可以明显抑制野　生型ｐ５３诱导的细胞凋亡：野生型ｐ５３在体内可　与ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因启动子结合，从而抑制ｓｕｒｖｉｖｉｎ基　因的转录和蛋白的表达，促进细胞凋亡［１２－１３］。本研　究以具有野生型ｐ５３的ＭＣＦ一７乳腺癌细胞株为研　究对象，发现坎地沙坦可明显上调野生型ｐ５３蛋　白表达同时下调ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白的表达水平，诱导　Ｇ１期细胞周期阻滞及细胞凋亡。　综上所述，坎地沙坦对乳腺癌ＭＣＦ一７细胞有　较好的抑制作用，其机制可能与坎地沙坦调节细　胞周期及凋亡相关蛋白的表达有关。进一步研究　坎地沙坦对乳腺癌细胞的增殖抑制作用及其机　制，将可能为乳腺癌的治疗开辟出新的途径。　４参考文献　［１］Ｇｅｏｒｇｅ　ＡＪ，Ｔｈｏｍａｓ　ＷＧ，Ｈａｎｎａｎ　ＲＤ．Ｔｈｅ　ｒｅｎｉｎ—ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ：ｏｌｄ　ｄｏｇ，ｎｅｗ　ｔｒｉｃｋｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ，　２０１０，１０（１１）：７４５－７５９．　［２］Ｓｕｇａｎｕｍａ　Ｔ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ　ｔｙｐｅ一１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　５１４　实用医学杂志２０１４年第３Ｏ卷第４期　ｔｈｅｒａｐｙ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｖａｓｉｏｎ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，　［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１１，ｌ１（４）：３９２－３９４．　［９］　Ｏｍｉｎｓｋａ　Ｋ，Ｌａｅｈｏｗｉｅｚ－Ｏｃｈｅｄａｌｓｋａ　Ａ．Ｔｈｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｄ　ｐｅｉｒｔｏｎｅａｌ　ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００５，１　１　（７）：２６８６—２６９４．　ｒｅｎｉｎ—ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＲＡＳ）ｉｎ　ｃａｎｃｅｍｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｏｓｔｅｐｙ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，５４（３）：２９４－３００．　１ｗａｍｏｔｏ　Ｋ，Ｈａｍａｄａ　Ｈ，Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｍ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　［１０］　［３］　Ｓｈｉｒｏｔａｋｅ　Ｓ，Ｍｉｙ￣ｉｍａ　Ａ，Ｋｏｓａｋａ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ　ｔｙｐｅ　１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｕｒｏｌｏｇｙ，２０１１，７７（４）：１００９．ｅｌ９—２５．　［４］　Ｌａｕ　ＳＴ，Ｌｅｕｎｇ　ＰＳ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＡＳ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．　Ｃｕｒｒ　Ｃａｎｃｅｒ　ＤｒａｇＴａｒｇｅｔｓ，２０１１，１１（４）：４１２－４２０．　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐ５３　ｐｕｌｓｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｆｏｒｍ，２０１　１，２５　（１）：１２—２４．　Ｇｕｈａ　Ｍ，Ａｈｉｅｒｉ　ＤＣ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ａｓ　ａ　ｇｌｏｂａｌ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｉｎｔｉｎｓｉｃ　ｒ［５］　Ｄｅｓｈａｙｅｓ　Ｆ，Ｎａｈｍｉａｓ　Ｃ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ａ　ｎｅｗ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｎｅｔｗｏｒｋｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ，２００９，８（１７）：　２７０８—２７ｌＯ．　ｕｓ　ＬＭ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｐ５３　ｔｕｍｏｒ　［１２］　Ｗａｎｇ　Ｚ，Ｆｕｋｕｄａ　Ｓ，Ｐｅｌｃａｎｃｅｒ？［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２００５，１６（７）：２９３－２９９．　　Ｅ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ—Ｒｅｙｎａ　ＴＳ，Ａｒｒｉｅｔａ　０，ｅｔ　ａ１．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　［６］　ＥｓｃｏｂａｒＩＩ，　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ：ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００４，２３（４９）：８１４６－　８１５３．　Ｏｋａｄａ　Ｈ，［１３］　Ｂａｋａｌ　Ｃ，Ｓｈａｈｉｎｉａｎ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ｌｏｓｓ　ｉｎ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｖａｓｃ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，　２００４，２（４）：３８５—３９９．　［７］　Ｉｎｏ　Ｋ，Ｓｈｉｂａｔａ　Ｋ，Ｋａｊｉｙａｍａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ—ｎｅｗ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｏｌｉｄ　ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ　ｔｒｉｇｇｅｒｓ　ｐ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ｐ５３一　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ，２００４，１９９（３）：３９９—　４１０．　ｔｕｍｏｕｒｓ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｌ　Ｔｈｅｒ，２００６，６（３）：２４３—２５５．　［８］　Ｅｍｕｒａ　Ｈ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｒｅｎｉｎ—ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＲＡＳ）ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ　（收稿：２０１３—０９—２３编辑：吴淑金）　胆汁酸核受体激动剂对瘦素及ＯＢ—Ｒｂ的影响　辛小敏　张珊珊钟慕晓　杨公利　彭瑶　朱薇　张亚历　摘要　目的：观察胆汁酸核受体激动剂ＧＷ４０６４对３Ｔ３一Ｌ１前脂肪细胞分化过程中瘦素及长型瘦素受　体（ＯＢ—Ｒｂ）和对ＨｅｐＧ２细胞０Ｂ．Ｒｂ的影响。方法：用ＧＷ４０６４干预３Ｔ３一Ｌ１前脂肪细胞的分化过程，采用　荧光ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法检测分化过程中第０…２　４　６、８天瘦素及ＯＢ—Ｒｂ　ｍＲＮＡ相对表达量及ＥＬＩＳＡ法检测瘦　素分泌情况．同时．用ＧＷ４０６４干预饥饿后的ＨｅｐＧ２细胞０、１２、２４、４８　ｈ后，荧光ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法检测ＯＢ—　Ｒｂ　ｍＲＮＡ相对表达量。结果：ＧＷ４０６４干预后，３Ｔ３一Ｌ１前脂肪细胞中瘦素ｍＲＮＡ相对表达量较对照组明　显上升．瘦素蛋白分泌情况与其ｍＲＮＡ表达相似，差异均有统计学意义（均Ｐ＜０．０５），而０Ｂ—Ｒｂ　ｍＲＮＡ表　达无明显改变（Ｐ＞０．０５）：同时，ＨｅｐＧ２细胞的０Ｂ—Ｒｂ　ｍＲＮＡ在干预后表达明显增加，差异有统计学意义（Ｐ　＜０．００１）　结论：ＧＷ４０６４可上调脂肪细胞瘦素和ＨｅｐＧ２细胞０Ｂ．Ｒｂ的表达，目前瘦素在非酒精性脂肪性　肝病中的作用及机制尚不明确，而０Ｂ—Ｒｂ的低表达则与非酒精性脂肪性肝病中的瘦素抵抗相关，因此，我　们推测胆汁酸核受体激动剂可通过提高肝脏ＯＢ—Ｒｂ的表达改善瘦素抵抗，从而达到治疗非酒精性脂肪性　肝病的目的。　关键词　胆汁酸核受体；　瘦素；　ＯＢ—Ｒｂ；　３Ｔ３一ＬＩ；ＨｅｐＧ２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＦｘＲ　ａｇｏｎｉｓｔ　ｏｎ　ｌｅｐｔｉｎ　ａｎｄ　０Ｂ・Ｒｈ　ＸＩＮ　Ｘｉａｏ—ｍｉｎ．ｚＨＡＮＧ　ｓｈ６ｌｎ—ｓｈ∞　，ＺＨＯＮＧ　Ｍｕ—ｘｉａｏ，ＹＡＮＧ　Ｇｏｎｇ－ｌｉ。ＰＥＮＧ　Ｙａｏ．ｚＨＵ　Ｗｅｉ，ｚＨＡＮＧ　Ｙｄ　ｔｔ．Ｔｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｎ－ｆａｎｇ　Ｈａｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１ｏ５１５．Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＵ　Ｗｅ　ｃｏｒｎ　Ｅ—ｍａｉＺ：ｃｈｎｚｗ＠１２６．＿【Ａｂｓｔａｒｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＧＷ４０６４，ｏｎｅ　ＦＸＲ　ａｇｏｎｉｓｔ，ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｅｐｔｉｎ　ａｎｄ　ＯＢ—Ｒｂ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　３Ｔ３一Ｌ１　ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＯＢ—Ｒｂ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｐｔｉｎ．０Ｂ—Ｒｂ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｌｅｐｔｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄａｙ　ｏｆ　０，２，４，６，８　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　３Ｔ３一Ｌ１　ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＷ４０６４　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＥＬＩＳＡ．　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ．ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＯＢ—Ｒｂ　ｏｆ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＷ４０６４　０　ｈ，　１２　ｈ．２４　ｈ，４８　ｈ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｔｕＲＮＡ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｐｔｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　３Ｔ３一Ｌ１　ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ＯＢ．Ｒｂ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＷ４０６４　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｉｎｅｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｏｎｔｒｏｌ　ｄｏｉ：１０．３９６９ｄ．ｉｓｓｎ．１００６—５７２５．２０１４．０４．００５　基金项目：广东省科技计划项目（编号：２０１１Ｂ０５０４００００９，２０１０Ｂ０３１６　００２４３）　作者单位：５１０５１５广州市．南方医科大学南方医院消化内科　通信作者：朱薇Ｅ　ｍａｉｌ：ｃｈｎｚ＿ｗ＠１２６．ｃｏｍ