裸鼠肝癌T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立

维普资讯 http://www.cqvip.com 垒Ｈ　学临床与教育！（Ｈ】７　５爿草５鉴弟３期Ｃｌｉ『ｌ】（・ａｌ　Ｅ，ｈ　ａｌＩｌｌｌｌｆｌｌ【　ｃｎｅｒａｌ　Ｐｒａｅｌｉｃｅ　），ｌａｙ　２００７．Ｖ　ｒ，１．５．＾【１．３　・经验交流・　裸鼠肝癌Ｔ淋巴细胞免疫功能重建模型的　建立　兰秋平　王凯峰　在肝癌的治疗中，Ｔ细胞免疫在肿瘤免疫中起　着重要的作用。尽管肝癌组织存在淋巴细胞的浸润，　但是这并没有使肝癌的病情进展速度减缓。所以关　于淋巴细胞在肿瘤患者体内的功能变化特别是Ｔ淋　巴细胞在肝癌患者体内的免疫作用值得进一步的研　究。目前，一直缺少一个有效而且特异性强的研究模　型。从而造成研究的影响宿主免疫状态因素增多，增　加了研究的难度。本研究在裸鼠体内建立起一个以　Ｔ细胞免疫功能重建为基础的模型，为进一步进行　免疫与肿瘤的转移和复发的关系提供实验平台。　１　资料和方法　１．１　细胞系与培养　小鼠高淋巴高转移潜能细胞　株（Ｈｃａ—Ｐ）和低转移潜能细胞株（Ｈｃａ—Ｆ）购于大连　医科大学。在含有１０％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈ．，美国）中，置于３７℃、含有５％　ｃ０２温箱中常规培养、传代。或者接种于６１５小鼠腹　腔，４天后形成腹水，取腹水，分离肿瘤细胞传代　１．２　动物的饲养　ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ雄性裸小鼠，４—　６周龄，体重２０ｇ左右，置于层流式超净架内的有机　玻璃饲养盒内（５只／盒），在恒温（２５—２７℃）、恒湿　（４５—５０％）、无特殊病原菌（ＳＰＦ）级环境下饲养。灭　菌处理的水和饲料供动物自由摄人。　６１５小鼠，雄性，４—６周龄，体重２０ｇ左右，饲养　于复旦大学中山医院实验动物中心。　１．３　小鼠Ｔ淋巴细胞的提取取２只４周龄Ｂａｌｂ／　Ｃ雄性小鼠，引颈处死，无菌取胸腺，放于不含小牛血　清的ＲＰＭ１１６４０中，于２００目金属网上研压，收集网　下细胞悬液注入无菌离心管中，用不完全培养液洗　涤２次并重新悬浮。　将悬浮的细胞再次离心，计数，与淋巴细胞分离　作者单位：３２１０１７　浙江金华，浙江省金华市中医院　（兰秋平）；浙江大学医学院附属邵逸夫医院（王凯峰）　液（１．０７７Ａ，批号：１０１１０４８７，ＡＸＩＳ—ＳＨＩＥＬＤ　ＰｏＣ　ＡＳ，　Ｎｏｒｗａｙ）按照细胞悬液：分离液＝２：１的体积小心将　细胞悬液加于分离液上方，分层放置。再于６００　ｇ水　平离心２０ｒａｉｎ。小心取出离心管，吸取中间的单个核　细胞层，用ＰＢＳ重新悬浮，并计数。　将分离的单个核细胞用Ｔ淋巴细胞分离柱　（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ，Ｃａｎａｄａ）进行分离，方法详见说明书。　收集分离到的Ｔ淋巴细胞，进行下一步的实验。　１．４　Ｔ淋巴细胞免疫体系在裸鼠体内的建立取　４２只Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ雄性裸小鼠，分为４组。分别是高　转移重建组（Ｐ１），高转移未重建组（Ｐ２），低转移重建　组（Ｆ１），低转移未重建组（Ｆ２）。第１天取Ｔ淋巴细胞　分别经尾静脉注入小鼠体内。每只小鼠０．３ｍｌ，含细　胞数量为（６—８）×１０　个。此后，每周尾静脉注射Ｔ　淋巴细胞１次，３周后处死小鼠。　１．５　Ｔ细胞免疫功能重建效果的评价淋巴细胞　表型的鉴定：分别取高、低转移组的小鼠的外周血淋　巴细胞以及脾细胞（分离方法同上），配制成大约１×　１０　／ｍｌ，按照１０　细胞量加入ｌＯ￣ｔｌ小鼠ＣＤ３、ＣＤ４、　ＣＤ８流式抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．），避光反应３０分钟　后，流式细胞仪（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）检测ＣＤ３、　ＣＤ４、ＣＤ８细胞的百分比。每组随机抽取７例样本进　行检测。　１．６　淋巴细胞功能的检测　采用混合淋巴细胞反　应，进行体外实验。分别于无菌条件下取两只免疫重　建后的裸鼠脾脏以及未进行免疫功能重建的裸鼠脾　脏，按照上述程序分离单个核细胞。进行混合淋巴细　胞反应。　１．７　统计方法采用ＳＰＳＳｌ１．０对实验结果进行单　因素方差分析以及秩和检验。　２　结果　２．１　Ｔ细胞免疫功能重建前后细胞表面标志物的　变化裸鼠Ｔ细胞免疫功能重建后的ＣＤ４／ＣＤ８与　维普资讯 http://www.cqvip.com 全卡牛医学临床与教育２００７午５月带５－卷第３朗Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ＥｄｕｃａｔｉｔⅢ　１ｆ＿Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　Ｍａｙ　２００７．　１．５．Ｎ¨．　０５），见表１。流式细胞　对照组相比有明显的差异（Ｐ＜０．０５）。其中免疫功能　相比没有显著性差异（Ｐ＞０．重建后裸鼠外周血、脾脏的ＣＤ３、脾脏ＣＤ４的绝对百　仪检测免疫功能重建后高、低转移组的ＣＤ４、ＣＤ８波　峰大小均高于免疫功能未重建组（图１）。　分比、脾脏ＣＤ４／ＣＤ８均高于免疫功能未重建组（Ｐ　＜０．０５）。ＣＤ８的绝对百分比在免疫重建组与对照组　表ｌ　Ｔ细胞免疫功能重建前后裸鼠脾脏淋巴细胞标志物变化（％）　注：　与对照组比较，　Ｐ＜０．０５　图１　流式细胞仪检测Ｔ细胞免疫功能重建前后裸鼠外周血淋巴　细胞标志物变化　２．２　Ｔ细胞免疫功能重建前后免疫细胞功能检测　见表２。免疫功能正常的接种高（Ｐ）、低（Ｆ）转移细胞株　的Ｔ细胞与相应的肿瘤细胞进行混合淋巴细胞反应　后，其ｃｐｍ值均低于未重建组的ｃｐｍ值。其中在高转　移组（Ｐ组）的ｃｐｍ值明显小于对照组（Ｐ＜０．０５）。　表２　裸鼠Ｔ细胞免疫功能重建后Ｔ淋巴细胞功能检测　Ｆ　Ｐ　Ｔｌｙｍｐｈｏｅｙｔｅｓ＋　３２９２．０ｏ±１１２５．３４　５８８３，７５　４－３０３６．２２’　Ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ（ｒｅｃｏａｓｔｉｔｕｔ％ｎ）　Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ＋　３６５１．６Ｏ４－２０９９，２８　ｌ２９６１．１７　４－６４６１．５７　Ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌＩｓ（ｎｏｎ～ｒｃｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）　注：与ｎｏｎ—ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｆｉｏｎ组比较，　Ｐ＝Ｏ．０１８　３　讨论　肿瘤的转移与免疫之间的关系一直是研究的热　点之一。肝癌的转移和复发与基因的突变有关，也与　机体的免疫状态有关　。肝癌复发转移的研究将建　立在生物学的基础上，在治疗方面，肝癌根治性切除　后生物治疗可能占重要地位，尤其是在提高机体免　疫功能方面。不论从整体角度研究免疫治疗还是在　微观角度研究，对肝癌而言，均需要建立一个可以进　行研究的模型。　目前，研究者建立了各种模型进行肿瘤转移的　研究　－８１￣关于肝癌转移研究的模型也进行了探讨　，　但是关于肝癌免疫研究的模型目前尚缺乏。本研究　利用Ｔ细胞免疫功能重建在裸鼠体内建立起一种新　型研究的模型。该模型利用正常Ｂａｌｂ／ｃ小鼠的胸腺　细胞建立在无胸腺的Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ裸鼠体内，具有以　下特点：①两种小鼠种系相同，高、低转移的细胞株　亦是小鼠来源，排除了ＭＨＣ限制性对研究的影响；　②本模型在裸鼠体内较为单纯地模拟了Ｔ细胞免疫　功能的重建，经过流式细胞仪检测裸鼠的外周血和　脾脏Ｔ淋巴细胞的表达，证实了该免疫重建模型的　有效性；③本研究利用胸腺细胞进行免疫功能重建，　可以较好的模拟免疫环境，便于深入进行研究。可以　为今后进一步进行肿瘤免疫方面的研究提供参考。　但是在研究中我们发现，免疫重建后裸鼠外周　血及脾脏Ｔ淋巴细胞绝对比例数值不高，淋巴细胞　杀伤肿瘤细胞功能并不理想。分析可能系以下原因：　①采集标本的时间与重建时间间隔较长或免疫功能　重建所用胸腺中ｎａｔｉｖｅ　Ｔ细胞进行阳性选择大量死　亡所致；②肝癌细胞是否存在杀伤免疫细胞的机制　尚不清楚，但是肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用已　经有大量的研究“。’“　；③本免疫重建模型建立的方　法还不够完善，有待于进一步摸索。此亦为今后模型　进一步改进的方向。但是，该模型的建立为深入研究　肝癌转移的免疫学因素及手段提供了实验平台。　参考文献　ＴａｂｏｒＥ・Ｌｉｖｅｒｔｕｍｏｒｓａｎｄ　ｈｏｓｔｄｅｆｅｎｓｅ・ＳｅｍｉｎＬｉｖｅｒＤｉｓ，１９９７　１７（４）：３５１—３５５・　Ｌａｕ　Ａ　Ｈ，Ｔ　。　０ｎ　Ａｗ・Ｄｅｎ　ｆｉ　ｉ。ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｅｇｕ１ａ．　维普资讯 http://www.cqvip.com ２３８．　．　全科医学临床与教育２００７　ｌ币５．｝＿Ｉ第５　苹　期Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｄｕｃａｔｉ，ＩｆＩ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ），ｌａｙ　２００７．Ｖｏ１．５．Ｎｏ．３　ｌｌｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ【Ｊ　Ｊ．Ｇｕｔ，２００３．５２（２）：３０７—３１４．　Ｎｉｓｈｉｍｏｒｉ　Ｈ．Ｙａ￣ｓｈｉｍａ．ｒ．Ｈａｔｓ｜１．．ｅｔ　ａ１．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｎｕｄｅ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｎｍｔａｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｅｆｉｔｏｎｅａｌ　ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　８　．＼ｓｈｌｅｙ　ＬＭ．Ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｈｕｎｍｎ　ｄｉｓｅａｓｅ．１．ｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏ－　ｍａ．ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｈｅｐａｔｏｍａ［Ｊ　Ｊ．Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，１９７３，　７２（２）：３４５—３４８．　９　Ｓｔａｐｆｅｒ　ＭＪ，Ｈｕ　Ｄ，Ｗｅｉ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆａ　ｎｕｄｅ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｓａｍｅｈｕｍａｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｌｉｎｅ［Ｊ　Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｓ，２００２，２４（３）：　２４２—２５０．　４　“ＨＦ，Ｌｉｎｇ，ＭＹ，Ｘｉｅ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆａｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｈｃａ—Ｆ　ｃｅＵｓ　ｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ［Ｊ　Ｊ．Ｊ　ＳｕｒｇＯｎｃｏｌ，２００３，８２（２）：１２１一ｌ３０；ｄｉｓｃｕ．　ｓｓｉｏｎ　ｌ３Ｉ．　ｉｎＣ３Ｈ／Ｈｅｊｍｉｃｅ［Ｊ】．ＯｎｃｏｌＲｅｓ，１９９８，１０（１ｌ一１２）：５６９—５７３．　５　１０　ＷａｎｇＨ，ＸｉｅＸ，ＬｕＷＧ．，ｅｔ　ａ１．Ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅＵｓｉｎｈｉｂｉｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌＬ一２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａ　ａｎｄ　ｇａｍｍａ　Ｙａｎｏ　Ｓ，Ｎｉｓｈｉｏｋａ　Ｙ，ｌｚｕｍｉ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｖｅｌ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｎ　ＳＣＩＤ　ｍｉｃｅ　ｄｅｐｌｅｔｅｄ　ｏｆ　ＮＫ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ】．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，ｌ９９６，６７（２）：２ｌｌ一２１７．　６　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ＪＡＫ—ＳＴＡＴ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ【Ｊ】．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，２００４，７４（１４）：１７３９—１７４９．　１ｌ　“Ｒ，Ｖｉｌｌａｃｒｅｓｅｓ　Ｎ，Ｌａｄｉｓｃｈ　Ｓ．Ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ　ｉｎｈｉｂｉｔ　Ｓｕｎ　ＦＸ，ＴａｎｇＺＹ，Ｌｕｉ　ＫＤ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔｂｌａｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆａｍｅｔｓｔａａｔｉｃ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ　ｖｉａ　ｏｒｔｈ－　ｍｕｒｉｎｅｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎｖｉｖｏ［Ｊ１．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９５，５５（２）：　２儿一２ｌ４．　ｏｔｏｐｉｃｉｍｐｌｎｔａａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｉｎｔａｃｔｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ】．１ｎｔＪＣａｎｃｅｒ，　ｌ９９６。６６（２）：２３９—２４３．　７　（收稿日期　２００７—０３—１９）　（本文编辑　陆远强）　Ｔａｋａｚａｗａ　Ｈ　ａｎｄ　Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｓ．Ａｎ　ｅｘｐｅｆｉｍｅｎｔＭ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｌｙｍｐｈａｔｉｃ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ【Ｊ】．Ｇａｎｎ，１９７６，６７（３）：４ｏ３—４ｏ６．　・经验交流・　中西医结合治疗声带小结５５例疗效观察　张健魏炯洲　病程为３个月～３年。所有　声带小结（ｖｏｃａｌ　ｎｏｄｕｌｅｓ）也称歌唱者小结，教师　３２例，年龄１９岁～６５岁，小结，是慢性喉炎的一型。一般声带小结早期采用保　病例均经电子动态喉镜检查证实声带小结，采用随　守治疗，经过适当禁声休息，病变常可变小或消失…。　机分为中西医结合组（简称治疗组）和西医组。治疗　本文的目的是探讨中西医结合治疗声带小结的疗　组３０例，男性ｌ２例，女性ｌ８例，其中个体户８人，教　效。对共５５例声带小结患者，保守治疗无效，先采用　师ｌ０人，营业员５人，农民４人，其它３人。西医对照　先手术摘除，再内服中药的中西医结合治疗，与单纯　组２５例，男性１１例，女性ｌ４例，其中个体户６人，教　手术西医治疗对照评估疗效。　１　资料与方法　师８人，营业员６人，农民３人，其它２人。　１．２　治疗方法　１　１　一般资料选择２００２年～２００６年均为保守治　治疗组：进行喉内显微手术摘除小结，使用内侧　（开音散结汤：淡芩、玄参、木蝴蝶、赤芍、桑白皮、生　疗无效的声带小结患者５５例，其中男性２３例，女性　微瓣技术乜Ｊ，术后不用西药，而予以内服中药汤剂　地、桃仁、浙贝、桔梗、甘草、红花、丝瓜络、麦冬），每　作者单位：３１０００６　浙江杭州，浙江省中医院耳鼻喉科