血小板衍生生长因子促进鼠骨早期修复中增殖细胞核抗原与c—Jun蛋白的表达

中国临床康复筹加卷筹４，船２００６一ｌｌ一１Ｏ出版　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１０　２００６　Ｖｏ１．１０　Ｎｏ．４１　・５３　基础研究・　血小板衍生生长因子促进鼠骨早期修复中增殖细胞核抗原与　ｃ—Ｊｕｎ蛋白的表达★　崔●　猛　，陈建庭　３００２１１；　南方医科大学南方医院脊拄骨　ＰＤＧＦ－ＡＢ）注人大鼠桡骨骨缺损模型，同体双侧对照，运用免疫组织化　学染色方法，从细胞分子水平观察和分析血小板衍生生长因子对骨折　天津医院创伤骨科，天津市病科，广东省广州市５１０５ｌ５　●　崔猛★，男，１９７４年生，山东崔莒南县人，汉族，２０００年解放军第一军　医大学毕业，硕士，主治医师，主要从事创伤骨科研究。　中图分类号：Ｒ３１８　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７１—５９２６（２ｏｏ６）４１—００５３—０３　收稿１３期：２００６—０４一Ｏ５修回１３期：２００６一Ｏ６—０８（０５－５０－１２－１００２０／Ｗ・Ｑ）　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　愈合期间软骨骨痂发生、生长的刺激作用及其刺激信号的传导机制。　方法：实验于２００４—１２／２００５—０８在解放军总医院三０四临床部烧伤研　究所完成。①ｓＤ大鼠３０只，造成双侧上肢平均约３　ｍｍ的桡骨骨缺损　模型。将重组因子ＰＤＧＦ—ＡＢ分别于术后第ｌ，３，５，７天分４次注人大鼠　ｎｄ　ｃ－Ｊｕｎ　ｐｒｏｔｅｉａｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｉｅｒ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ｒａｔ　ｂｏｎｅ　ｈｅａｌｉｎｇ　ｗｉｈ　ｐｌｔａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　Ｃｕｉ　Ｍｅｎｇ　Ｃｈｅｎ　Ｊｉａｎ，ｒｉｎｇ　Ｄｅｐｍ＇ｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　ａｎｄ　Ｔｒａｕｍａ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００２　１　ｌ，Ｃｈｉｎａ；　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｐｉｎａｌ　Ｏｓｔｅｅｄｙｓｔｍｐｈｙ，Ｎａｎｆａｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０５１５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，　Ｃｈｉｎａ　’　右侧桡骨骨缺损区内（血小板衍生生长因子组），左侧骨缺损区内注人　生理盐水作为对照组。②两组分别于术后第１，２，４周各取１０只大鼠骨　痂组织做成切片，分别进行增殖细胞核抗原与ｃ－Ｊｕｎ免疫组织化学观察　并对阳性结果作定量分析。　结果：３０只大鼠全部进入结果分析。④增殖细胞核抗原蛋白与ｃ．Ｊｕｎ蛋　白在软骨骨痂形成与转归中的表达规律有比较一致的相似性，且增殖　细胞核抗原能刺激间充质细胞、软骨细胞合成这两种蛋白。②术后ｌ　周，血小板衍生生长因子组间充质细胞内增殖细胞核抗原蛋白与ｃ－Ｊｕｎ　Ｃｕｉ　Ｍｅｎｇ＊，Ｍａｓｔｅｒ，Ａｔｔｅｎｄｉｎｇ　ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　ａｎｄ　蛋白表达均高于生理盐水组【（６．０７￣２．０９）ｘｌ００比（３．７８￣１．８４）×１０～，　（８．６２￣２．１０）ｘｌ０　比（４．８９￣１．７４）ｘ１０　，Ｐ值均小于０．０１１。⑧术后２周，血小　板衍生生长因子组非肥大软骨细胞内增殖细胞核抗原蛋白与ｃ－ｊ．ｎ蛋白　表达均高于生理盐水组（４．３３＋１．２６）ｘｌ０　比（３．ｏ５±１．１４）ｘ１０－３，Ｐ＜０．０５；　（６．８４￣１．４５）ｘｌ０　比（５．００￣１．１８）×ｌ０～。Ｐ＜０．０１）。　Ｔｒａｕｍａ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００２　１　ｌ，Ｃｈｉｎａ　Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２００６－Ｏ４—０５　Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２００６一Ｏ６一Ｏ８　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＡＩＭ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｔｅｌｅｔ．ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ＡＢ　ｆＰＤＧＦ．ＡＢ）　ｉｓ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｒａｄｉｌ　ｂｏｎｅ　ｄｅｆａｅｃｔ　ｒａｔ　ｍｅｄｅｌｓ．　ａｎｄ　ｂｉｌａｔｅｒａｌ　ｓｉｄｅｓ　ｏｆ　ｈｏｍｅｂｏｄｙ　ａｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏ１．Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　ｆｕｎｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＤＧＦ　ｏｎ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎ　ｆｒａｃｔｕｒｅ　ｕｎｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｓｐｉｋｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｅｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌｅｖｅｌ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．　ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｂｕｒｎ　ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｔｈｅ　３０４　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔｌ　ａｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ＰＬＡ　ｆｒｏｍ　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２００４　结论：血小板衍生生长因子能刺激动物体内间充质细胞和软骨细胞的　增殖，加速软骨骨痂的形成，促进骨愈合。血小板衍生生长因子能诱导　这两种细胞表达ｃ・Ｊｕｎ，它或许能通过Ｃ—ＦＯＳ／ＪＵＮ蛋白来传递其生长　作用信号，从而实现其刺激间充质细胞和软骨细胞增殖的目的。　关键词：血小板衍生生长因子一ＡＢ；骨痂；增殖细胞核抗原　ｔｏ　Ａｕｇｕｓｔ　２００５．（里）Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　３０　ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗａｓ　ｏｐｅｒａｔｅｄ　ｔｏ　ｃａｕｓｅ　ａｂｏｕｔ　３　ｍｍ　ｍａｓｓｉｖｅ　ｓｅｇｍｅｎｔａｌ　ｂｏｎｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｉｔｓ　ｂｏｔｈ　ｒｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｌｅｆｔ　ｒａｄｉｕｓ．Ｒａｄｉａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ　０　引言　ｉｎｔｈｅ　ｒａｔｓ’血出ｔｍｄｉｕｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ　ＰＤＧ　Ｂ　ａｔ　ｄａｙｓ　ｌ，３，５　ａｎｄ　７　ａｆｔｅｒ　近年研究认为：血小板衍生生长因子可促进骨修　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｆＰＤＧＦ　ｒｏｕｐ）ｇ．Ｌｅｆｔ　ｓｉｄｅ　ｗａｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓａｌｉｎｅ　ａｓ　复过程中软骨和膜间骨的形成，在骨折修复早期起重　要作用［１］。骨折的修复需要经历纤维骨痂、软骨骨痂和　骨性骨痂３个阶段，成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞　分别是这３个阶段的主要功能细胞。血小板衍生生长　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｇｏｕｐ．（￣）Ｂｏｎｙ　ｃａｌｌｕｓ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　１０　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｔ　ｗｅｅｋｓ　ｌ＿２　ｎｄ　ａ４　ａｆｔｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｉｎｔｏ　ｓｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｅ－Ｊｕｎ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｅｈｅｍｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ，ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ．　ＲＥＳＵＬＴｓ．Ｔｏｔｌｌａｙ　３０　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．（　ｒｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ１　ａｎｄ　ｅ－Ｊｕｎ　ｗｅｒｅ　ｏｆ　ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ　ｉｎ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｏｆ　ｃｇｒｔｉｌａｇｅ　ｃａｔｌｕｓ．ＰｅＮＡ　ｃｏｕｌｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｅｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｔｏ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ　ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　因子通过参与调节这３种细胞的增殖与分化来实现其　促进骨折修复的目的。本实验通过观察血小板衍生生　长因子在骨修复早期软骨骨痂发生、生长过程中对增　殖细胞核抗原与ｃ　Ｊｕｎ蛋白表达水平的影响，试图为　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．＠Ｏｎｅ　ｗｅｅｋ　ｆａｔｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＮＡ　ａｎｄ　ｃ－Ｊｕｎ　ｉｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＰＤＧＦ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｌｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ（６．０７＋２．０９）ｘｌｆｆｓ　（３．７８＋１．８４）ｘｌ　，（８，６２￣２．１０）ｘｌ　（４．８９±１．７４）ｘｌ　。　Ｐ＜０．０ｌ　１．￣Ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ａｆｔｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＮＡ　ａｎｄ　ｃ－Ｊｕｎ　ｉｎ　ｎｏｎ・ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｅｈｏｎｄｒｏｅｙｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＰＤＧＦ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　研究血小板衍生生长因子在动物体内刺激软骨骨痂发　生、生长及其过程中的信号传导机制提供新的理论依　据。　１材料和方法　设计：分组对照观察。　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｌｉｎｅ　ｇｒｏｕｐ『（４．３３±１．２６）×１０　１３５　（３．０５￣１．１４）ｘ１０～，Ｐ＜０．０５；　（６．８４￣１．４５）×１００　ｓ（５．００±１．１８）×１０。　，Ｐ＜０．０１）１．　●　ＣｏＮＣＬＵＳＩＯＮ：ＰＤＧＦ　ｃａｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｎ　ａｎｉｍａｌｓ．ｗｈｉｃｈ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｈｅａｌｉｎｇ．ＰＤＧＦ　ｃａｎ　●　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｃ－Ｊｕｎ．ｉｔ　ｍａｙ　ｂｅ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ｃ－Ｆｏｓ／Ｊｕｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｍｅｄｉａｔｉｎｇ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ＋　Ｃｕｉ　Ｍ，Ｃｈｅｎ　ＪＴ　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌ　ｌｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　ｃ－Ｊｕｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｉｅｒ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ｒｏｔ　ｂｏｎｅ　ｈｅａｌｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｔｅｔｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　单位：解放军总医院三０四临床部烧伤研究所。　材料：实验于２００４—１２／２００５—０８在解放军总医院　三０四临床部烧伤研究所完成。人生长因子ＰＤＧＦ－ＡＢ　（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司，英国）；兔ｃ．Ｊｕｎ多克隆抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，美国）；鼠增殖细胞核抗原单克隆抗体　ｆａｃｔｏｒ　唧　Ｌｉｔｗｈｕａｎｇ　Ｋａ￣ｇｆｕ　２００６：１Ｏｌ４　３—５ＩＣｈＩｎａｌ　崔猛．陈建庭血小板衍生生长因子促进鼠骨早期修复中增殖细胞核抗原与ｃ＿Ｊｕｎ　蛋白的表达Ｕｌ＿中国临床康复，２００６　１０（４１｝：５３－５　１ｗｗｗｚｇｌｃｌｄｃａｍ｝　摘要　目的：将重组人ｉ￣／Ｉｓ板衍生生长因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ＡＢ　（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，美国）；ＳＰ免疫组织化学试剂盒（北　京中山生物技术有限公司）；二氨基联苯胺免疫组织化　维普资讯 http://www.cqvip.com

瓣　路　学染色试剂盒（武汉博士德试剂有限公司）。雄性ＳＤ　大鼠３０只，体质量２００～２２０　ｇ（北京津美利华实验动　物中心，许可证号：４１７７）。　设计、实施、评估者：为第一、二作者及解放军总　医院三０四临床部烧伤研究所付小兵，均受过培训。　方法：　。。　崔猛ｌ等＇　ｃ－慷Ｊｕ曩　凄　促进鼠骨早期修复中增殖细胞核抗原　采用显微摄像计算机图像分析管理系统　（Ｃｍｉａｓｗｉｎ软件）对间充质细胞、非肥大软骨细胞中增　殖细胞核抗原与ｃ—Ｊｕｎ阳性结果进行电脑图像分析，　两种蛋白的表达均用数密度（目标个数／统计场面积／　４００倍视野）表示。分别比较两组间充质细胞中增殖细　胞核抗原与ｃ—Ｊｕｎ的数密度值（ｎ＝ｌＯ）。分别比较两组　非肥大软骨细胞中增殖细胞核抗原与ｃ—Ｊｕｎ的数密度　值（　＝１０）。　童　实验动物模型与分组：ＳＤ大鼠３０只，３０　ｇ／Ｌ戊巴　比妥钠腹腔注射麻醉后（麻醉剂量：３５～４０　ｍｇ／ｋｇ），无　菌操作，于双前肢外侧切口，长约１．５　ｃｍ，暴露桡骨中　段。在桡骨中段测定５　ｍｍ距离后，将５　ｍｍ的中段桡　统计学分析：各项统计指标均以Ｅ＋ｓ表示，由第一　作者用ＰＣ／ＳＡＳ　６．０４版本统计软件包处理，组间样本　均数比较采用ｔ检验。Ｐ＜０．０５为差异显著，Ｐ＜０．０１　为差异非常显著。　主要观察指标：两组组间充质细胞中增殖细胞核　抗原与ｃ—Ｊｕｎ蛋白表达结果。　２　结果　ｊ　骨连同骨膜一并切除，造成平均约３．１　ｍｍ的大鼠双　侧桡骨骨缺损模型（因肌肉牵拉等原因致使桡骨两断　端不同程度的回缩，经术后摄片测量骨缺损间距离，　最大距离为４．５　ｍｍ，最小为２．３　ｍｍ，平均３．１　ｍｍ）嘲。　在每只大鼠右前肢骨缺损部位植入ＰＤＧＦ—ＡＢ溶液　０．２　ｍＬ，内含血小板衍生生长因子１００　ｎｇ（ＰＤＧＦ—ＡＢ　溶液：粉末状ＰＤＧＦ—ＡＢ因子和去离子水，浓度为　２．１　实验动物数量分析　实验选用大鼠３０只，全部　进入结果分析。　５００　ｇ／Ｌ）；左前肢骨缺损部位植入生理盐水０．２　ｍＬ　作为对照。术后不给予抗菌素，不加用外固定，动物随　机分笼饲养。再于术后分３个时间点（术后第３，５，７　天）将ＰＤＧＦ—ＡＢ溶液经皮下注入大鼠右前肢骨缺损　区内（每只大鼠每次注入０．２　ｍＬ）；左前肢骨缺损区内　２．２　两组中增殖细胞核抗原与ｃ—Ｊｕｎ蛋白表达结果　见表ｌ。　表ｌ血小板衍生生长因子组、生理盐水组术后ｌ周间充质细胞与术后２　周非肥大软骨细胞中增殖细胞核抗原和￣－Ｊｕｎ的表迭　（　，ｎ＝ｌＯ，ｌｘｌ０３）　注入生理盐水（每只大鼠每次注入０．２　ｍＬ）作为对照。　石蜡包块的制备：分别于术后第１，２，４周各随机　取大鼠ｌ０只，过量戊巴比妥钠处死后，立即用剪刀剪　下大鼠双前肢，将肢体整个投入４０　ｇ／Ｌ中性甲醛液中　固定。待组织固定后将肢体再置于浓度为ｌ　ｍｏｌ／Ｌ的　稀盐酸液中浸泡，脱钙。用刀片将缺损区连带相邻尺　增殖细胞核抗原蛋白的表达呈颗粒状阳性，定位　于细胞核，颜色为棕黄色。ｃ—Ｊｕｎ蛋白的表达在细胞的　核、浆中均可见到，阳性颜色为棕黄色。　术后１周：血小板衍生生长因子组中分化与未分　化的间充质细胞，新生小血管中的内皮细胞，幼稚的软　骨细胞等细胞内均见增殖细胞核抗原与ｅ－Ｊａｎ阳性颗　骨及周围软组织一并切下，做成大小为５　ｍｍｘｌＯ　ｍｍ　的组织块，梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片（５　ｍ厚）。　在切片上进行免疫组织化学染色观察。　免疫组织化学染色：①烤片溶蜡、二甲苯脱蜡、常　规下行乙醇复水（石蜡切片脱蜡至水）。②３％Ｈ　Ｏ　与切　片３７℃孵育１０　ｍｉｎ。③蒸馏水洗，磷酸盐缓冲液浸泡　５　ｍｉｎ。④微波修复抗原，９７℃，１５　ｍｉｎ。⑤冷却至室温　粒，阳性颗粒数量较多信号较强。同期生理盐水组中间　充质细胞等细胞内两种阳性颗粒数量较少信号较弱。　两组中两种蛋白数密度值统计学比较，差异均非常显　著。　术后２周：血小板衍生生长因子组梭形间充质细　后，蒸馏水洗５　ｍｉｎ，磷酸盐缓冲液浸泡５　ｍｉｎ。⑥正　常体积分数为０．１的山羊血清（磷酸盐缓冲液稀释）　室温封闭１０　ｍｉｎ。（Ｚ）甩掉血清，加入适当比例稀释的　一胞、幼稚和成熟的软骨细胞、类骨质骨小梁中的成骨细　胞内均见许多增殖细胞核抗原与ｃ．Ｊｕｎ阳性颗粒，阳　抗（以磷酸盐缓冲液工作液代替一抗作空白对照），　性颗粒数量较多信号较强。同期生理盐水组的这些细　曾　４℃，过夜。⑧磷酸盐缓冲液洗，５　ｍｉｎｘ３次。⑨滴加生　物素标记的ＩｇＧ，３７　ｏＣ，２Ｏ　ｍｉｎ。⑩磷酸盐缓冲液洗，　５　ｍｉｎｘ３次。　滴加辣根酶标记的链霉卵白素，３７℃，　２０　ｍｉｎ。＠磷酸盐缓冲液洗，５　ｍｉｎｘ３次。⑩滴加二氨基　联苯胺显色剂，镜下控制显色。＠自来水冲洗、苏木精　胞中这两种阳性颗粒数量较少信号较弱。两组中毗邻　类骨质骨小梁的肥大软骨细胞内，两种阳性颗粒少见，　变性死亡的软骨细胞内，几乎没有阳性颗粒表达。两组　中两种蛋白数密度值统计学比较，差异为显著和非常　显著。　。　复染、脱水、透明、封固。光镜下观察，电脑图像分析仪　分析结果，并拍照记录。　术后４周：血小板衍生生长因子组类骨质骨小梁　中的成骨细胞和软骨组织边缘部分的非肥大软骨细胞　维普资讯 http://www.cqvip.com

１ＳＳＮ　１６７１—５９２６　ＣＮ　２１—１４７０／Ｒ　，　耐　删　中国临床康复　２００６年１１，ｆ＝ｊ　１Ｏ日　第１Ｏ卷　第４１期　５５　内见少量增殖细胞核抗原与ｃ．Ｊｕｎ阳性颗粒，新生骨　髓细胞中也见其阳性颗粒。而同期生理盐水组类骨质　原的表达结果说明血小板衍生生长因子有刺激问充质　细胞和软骨细胞的增殖作用。血小板衍生生长因子刺　骨小梁和软骨组织中的两种阳性颗粒仍有相当的数　量。　激问充质细胞增殖，也就增加了能分化为软骨细胞的　细胞数量，导致缺损区内更广泛的软骨骨痂发生；同时　它又能刺激新生软骨组织中软骨细胞的增殖，促使软　骨细胞数量增加，使软骨骨痂不断发展壮大，最终填满　缺损区。　３讨论　增殖细胞核抗原是一种相对分子质量为３．６ｘｌＯ　・　的酸性蛋白质，它是ＤＮＡ聚合酶的一种辅助蛋白，　能参与ＤＮＡ的合成，其含量随细胞的增殖而变化。　＿　近年来，Ｆｏｓ／Ｊｕｎ蛋白已被人们认为是核内转录水　在静止期细胞中，其量很少，ＤＮＡ合成前期晚期开使　增加，ＤＮＡ合成期达到高峰，ＤＮＡ合成后期＋分裂期　平上的不同信号传递的“中转站”，基因转录调控的分　子开关，可以间接调控细胞的增殖与分化１　。一般情况　明显下降。增殖细胞核抗原可作为评价细胞增殖状　态的指标ｌ３４－Ｉ。本实验中，软骨骨痂是大鼠骨折修复早期　形成的主要骨痂，在骨愈合初期起填充缺损区，连接　骨断端作用。因此作者利用增殖细胞核抗原观察与对　比两组样本中主要参与软骨骨痂形成的问充质细胞　和软骨细胞的增殖状况。软骨骨痂的发生与生长是建　立在问充质细胞、软骨细胞不断增殖与分化的基础　上，细胞的增殖与分化是同步进行的。来自血管的未　分化问充质细胞在不断分裂增殖的同时也不断分化，　首先分化为幼稚软骨细胞；幼稚软骨细胞继续分裂增　殖，然后分化为成熟软骨细胞；成熟软骨细胞再增殖　分化为肥大软骨细胞；软骨细胞发展到肥大软骨细胞　阶段，细胞的分化程度已经很高，电镜下见其胞核肿　胀，核质固缩，胞质内细胞器减少而含空泡结构［５１，它　不再增殖而是变性死亡脱颗粒，最终细胞消失。增殖　细胞核抗原在两组样本中有增殖能力的间充质细胞、　幼稚和成熟软骨细胞中可表达，在两组中没有增殖能　力的肥大和变性软骨细胞中几乎不表达。术后１周：　血小板衍生生长因子组的问充质细胞中增殖细胞核　抗原呈高表达，这说明该组的间充质细胞处于高增殖　状态，细胞增殖能力强分化程度高且数量多；同期生　理盐水组的间充质细胞中增殖细胞核抗原呈低表达，　说明该组的间充质细胞增殖能力较弱分化程度较低，　数量少。术后２周：血小板衍生生长因子组的幼稚和　成熟软骨细胞较多且其中增殖细胞核抗原呈高表达，　说明许多问充质细胞已增殖分化为软骨细胞且这些　细胞仍处于较强增殖与分化状态；同期生理盐水组的　幼稚和成熟软骨细胞较少，其中增殖细胞核抗原呈低　表达，说明已分化的软骨细胞较少且这些细胞的增殖　与分化能力相对较弱。术后４周：血小板衍生生长因　子组的软骨组织中增殖细胞核抗原的表达很少，因为　组织中的软骨细胞大都已肥大或变性死亡；同期生理　盐水组的软骨组织中仍有许多幼稚和成熟软骨细胞，　所以增殖细胞核抗原尚有一定的表达。增殖细胞核抗　下，细胞处于静止期时，它们均不表达；但在生长因子、　诱导因子、血清等多种因素的刺激下，ｃ—ＦＯＳ和ｃ—ＪＵＮ　基因可被迅速诱导ｌ　７ｌ。研究表明血小板衍生生长因子　与细胞表面的其相应受体结合后可以启动细胞核内　ｃ—ＭＹＣ，ｃ—ＦＯＳ和ｃ—ＪＵＮ基因的转录并使其水平升　高，继而引发与细胞分裂有关的各种转录调节因子的　合成　１。这些因子作用于次级反应基因５’端的一些调　控程序列，如ＡＰ一１，一２，ＮＦ一１，ｃＡＭＰ，进而加快有丝分　裂细胞周期的进程Ｉ　。Ｋａｐｌａｎ等　Ｏｌ发现：在软骨的修复　过程中，间充质细胞和软骨细胞均表达ｃ—Ｆｏｓ蛋白，他　们认为ｃ—Ｆｏｓ有可能参与了这两种细胞的增殖与分　化。本实验中观察到：血小板衍生生长因子组间充质细　胞和非肥大软骨细胞中ｃ—Ｊｕｎ蛋白的表达均强于生理　盐水组两种细胞中ｃ—Ｊｕｎ蛋白的表达。说明正常骨缺　损区内的各种内源性刺激因素能够刺激间充质细胞和　非肥大软骨细胞中ｃ—Ｊｕｎ的转录，在缺损区内注入血　小板衍生生长因子能够进一步诱导间充质细胞和非肥　大软骨细胞中ｃ—Ｊｕｎ的转录增高，其基因产物刺激问　充质细胞、非肥大软骨细胞的增殖与分化，加速软骨骨　痂的发生与生长。　４参考文献　１　狄勋元．生长因子对骨折修复的作用［ＪＪ１骨与关节损伤杂志，１９９１，６（２）：１２０—　１　２　周新富，梁启申．牛骨形态发生蛋白对大鼠实验性骨缺损的治疗作用…中　华骨科杂志，１９８８，３（３）：２２７—９　３　Ｂｒａｖｏ　Ｒ，Ｆｒａｎｋ　Ｒ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ　ＰＡ．ｅｔ　ａ／．Ｃｙｃｌｉｎ／ＰＣＮＡ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｕｘｉｌｉａｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　６．Ｎａｔｕｒｅ　１９８７；３２６：５１５　４　Ｂｒａｖｏ　Ｒ．Ｍａｃｂｏｎａｌｄ　ＢＨ．Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｐｏｐｕｌ￣ｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｙｃ１ｉｎ／ｐｒｏ１ｉｆｅｒ　ｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ．ｊ　ＣｅＩＩ　Ｂｉｏｌ　１９８７；１０５：１５４９　５　夏志道，常超英，房世源，等．骨折愈合中的软骨骨痂【Ｊ１ｌ中幽骨伤，１９９４，７（５）：　１Ｏ—４　６　李菊根，陈建庭，金大地．血小板衍生生｝之因于刺激鼠成骨细胞内Ｃａ　浓度　变化的研究【ＪＪ．第一军医大学学报，１９９９，１９（４）：３０４—５　７　Ａｎｇｅｌ　Ｐ，Ｋａｒｉｎ　Ｍ．Ｔｈｅ　ｍｌｅ　０ｆ　Ｊｕｎ，Ｆｏｓａｎｄ　ｔｈｅ　ＡＰ一１　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｐｍｌｉｆｅｒａ！ｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｅｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　ｅｔａ　１９９１；１０７２（２／３）：　１２９—７　８　Ｃａｎｔｌｅｙ　ＬＣ，Ａｕｇｅｒ　ＫＲ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　Ｃ．ｅｔ　ａ１．Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．　Ｃｅｌｌ　１９９１；６４：２８１　３０２　９　Ｈｕｎｔｅｒ　Ｔ．Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ　１９９１；６４：２４９—６Ｏ　１Ｏ　Ｋａｐｌａｎ　ＦＳ．Ｓｈ０ｒｅ　ＥＭ．Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｃ—ｆｏｓ：ｅａｒｌｙ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｉｎ　ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ　ｂｏｎｅ　ｔｂｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｏｎｅ　１９９６；１９（１　ｓｕｐｐ１）：ｌ３Ｓ一２１Ｓ