反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究(1)

反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究

姓名：洪武林申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：柳建设;谢学辉

2012-01-11

东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究幸摘要近些年以来，我国地表水污染问题依然较重，湖泊（水库）富营养化问题依然突出。氮和磷已经成为导致水体宫营养化的主要营养物质，但是目前城市污水处理中对氮、磷的去除率并不高，所以防治水体富营养化首要目的就是研究如何进行脱氮除磷。反硝化聚磷菌可以在缺氧条件下，利用硝酸盐作为电子受体，实现同步反硝化和过量吸磷。所以，从微生物学的角度出发分离筛选出能够反硝化除磷的菌株，并将其应用于污水处理工艺中，氮磷去除的效果将会很大程度上得到改盖口。本研究利用传统平板分离技术，结合除磷试验、反硝化产气试验以及异染颗粒和聚．ｐ．羟基丁酸（ＰＨＢ）颗粒染色试验，从内蒙古湖泊水样中筛选出一株反硝化聚磷菌株Ｐｌ一１。经过形态、生理生化试验、Ｂｉ０１０９碳源利用分析以及１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析，鉴定该菌株为荧光假单胞菌（ｎＰ甜如朋。聆以ｓ伽Ｄ船ｃＰ，ｚｓ／）。从温度、接种量、ｐＨ、摇床转速和碳源等多个方面对菌株Ｐ１．１的生长条件进行研究，并测定其在各因素下的脱氮除磷特性，得出了该菌株的最佳生长条件和最佳脱氮除磷条件。＋基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏｓ．５０３７４０７５，４１０７３０６０）；上海市重点学科建设项目（Ｂ６０４）。／）东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究此外，用海藻酸钠和聚乙烯醇同时作为包埋载体，添加一定量的沸石作为吸附剂，使微生物的固定化作用同时具有包埋和吸附的双重特点。通过正交试验确定了固定化条件为５ｍＬ浓缩菌液，１．Ｏ％的海藻酸钠，１０％的聚乙烯醇，２％的沸石时菌株Ｐ１．１的除磷效果最好。在高盐度和重金属条件下，研究发现固定化菌体比游离菌体有更好的除磷效果。最后，在模拟反应器中，利用固定化菌体与游离菌体对模拟废水进行处理，２４小时后，结果发现固定化菌体除磷率为８６．４％，脱氮率９４％；游离菌体的除磷率为７１．４％，脱氮率为９２．２％。关键词：反硝化聚磷菌；分离；鉴定；固定化ＳＴＵＤＹｏＮＩＳＯＬＡＴＩｏＮ，ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩｏＮＡＮＤＩＭＭＯＢＩＬＩＺＡＴＩｏＮｏＦＤＥＮＩＴＩＵＦⅥＮＧＰＯＬＹＰＨＯＳＰＨＡＴＥ－ＡＣＣＵＭＵＬＡＴＩＮＧｏＲＧＡＮＩＳＭＳＡＢＳＴＲＡＣＴＳｕＩＩｆａｃｅｗａｔｅｒｐｏｌｌｕｔｉｏｎｈａｓｂｅｅｎｓｅｒｉｏｕｓｉｎＣｈｉｎａｒｅｃｅｎｔｌｙ，ａｎｄｔｈｅａｎｄｅｕ仃ｏｐｈｉｃａｔｉｏｎｏｆ１ａｋｅｓｔｏｒｅｓｅⅣ０１ｒｓｈａｓｂｅｅｎａｌｓｏｏｂｓｅⅣａｂｌｅ．Ｔｈｅｒｅａｒｅｖａｎｏｕｓｋｉｎｄｓｏｆ姗ｔｒｉｅｎｔｓｌｅａｄｉｎｇｅｕｔｒｏｐｎｌｃａｔｌｏｎ，ｓｕｃｈａｓｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｍｓⅥ，ｈｉｃｈａｒｅｓｔｉＵｎｏｔｅｆｒｅｃｔｔｉｖｅｌｖＩ．ｅｍｏｖｅｄｂｖｍｕｌｌｌｃｌｐａｌ啪ｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｌｌｔ．ｎｅｒｅｆｏｒｅ，ｗｅｐｎｏｓｌ）ｈｏｍ８ｌｎ‘ｈｅｐｒｅＶｅｎｔｉｏｎｏｆｓｈｏｕｌｄｆｏｃｕｓａｌｌ０Ｘｉｃｏｎｈｏｗｔｏ僦１０ｖｅｎｉ仃ｏｇｃｎａｌｌｄｅｕ扛Ｄｐｈｉｃａｔｉｏｎ．ｈｌｃａｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｄｅｌｌｉｔｒｉ聊ｎｇｐ０１ｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｎｉｔｒｉ黟ａｎｄｅＸｃｅｓｓｉＶｅｌＹａｃｃ啪ｕｌａｎｎｇｏ唱ａｎｉｓｍｓ（ＤＮＰＡｏｓ）ａｓｓｉＩＩｌｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｒｃｍｏｖｅｐｎｏｓｐｎｏｍｓｂｙｕｓｌｎｇｎｌ仃ａｔｅｔ锄ｉＩｌａｌｅｌｅｃ仰ｎａｃｃ印ｔｏｒ．Ｆｒｏｍｍｅｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ西ｃａｌＶｉｅｗ＇ｉｔｉｓｃａｎｅ８８ｅｎｔｌａｌｔｏ１ｓｏｌａｔｅａｎｄｓｃｒｅＩｍＤＮＰＡＯｓｗｈｉｃｈｉｍｐｒｏｖｅｎｉ仃ｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ砌ｎｏＶａｌｉＩｌｔｈｅｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｋｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ＤＮｆ＇ＡＯｓＰ１—１ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｆｂｍｔｈｅｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｉｎａｌａｋｅｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ，ｂｙｕｓｉｎｇｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｐｌａｔｅｎｌｔｒａ‘ｅ８ｗｅｒｅｄｅｎｉｔｒｉｆｉｅｄｔｏｓｃｒｅＩｅｎｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅｕｐｔａｋｅｅｘｐ舐ｍｅｎｔ，ｗｒｈｅｒｅｇａｓａｎｄｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃａｎｄｔｏｐｏｌｙｐｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔ），ｒａｔｅ（ＰＨＢ）ｇｒａｎｕｌｅｓ・Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｉｔｓｍｏ印ｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｌ６ＳｒＩ埘Ａｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｉｔｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｓ仃ａｉｎｏｆ尸譬Ｐ“葫Ｄ聊Ｄ，２船∥甜Ｄ，℃ｓｃｅ，２ｓ．ＵｎｄｅｒｔｈｅＶａｒｉｏｕｓｔｌｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｏｃｕｌａ．ｗａｓｓｎＪｄｉｅｄｏｎａｍｏｕｎｔ，ｐＨ，ｒｏｔａｔｌｏｎｓｐｅｅｄａｎｄｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ，ｔｈｅｓｔｒａｉｎＰ１．１ｇｒｏｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｎｓｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｅｆＩ’ｅｃｔｓｏｆｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｍｓ“；ｍｏｖａｌ．Ｉｎｔｈｅｅｎｄ．ｔｈｅｂｅｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏｖａｌｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄ．ＩＩｌＭｏｒｅｏｖｅｒ，ｗｉｔｈｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅａｎｄｐ０１ｙｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ（Ｐ１、ｆＡ）ａｓｅｍｂｅｄｄｅｄＶｅｃｔｏｒ’ｗｉｔｈｚｅｏｌｉｔｅａｓａｄｓｏｒｂｅｎｔ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｒｅｔａｉｎｅｄｄｏｕｂｌｅｃｈａｒａｃｔ喇ｓｔｉｃｓｏｆｅｍｂｅｄｄｉｎｇａｎｄａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ．ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｍｉｃｒｏｏ唱ａｎ—Ｂｙｏｒｍｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌ２％ｉｓｍｓｗａｓ５ｍＬｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄ，ｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅ１．０％，ＰＶＡ１０％ａｎｄｚｅｏｌｉｔｅｆｏｒｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｌｌｌｓｒｅｍｏｖａｌ．Ｉｎｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｍｉｃｒｏｏ唱ａｎｉｓｍｓｔｈａｎｆｒｅｅＩｎｔｈｅｏｎｅｓｏｒｆｏｒｈｅａＶｙｍｅｎｔａｌ，ｉｔｗａｓｂｅｔｔｅｒｉｎｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅｍｏＶａｌ．ｅｎｄ．ｓⅧｍｅｔｉｃｗａｓｔｅｗａｔｅｒｗａｓｔｒｅａｔｅｄｉｎｔｈｅｓｔｉｍｕｌａｎｔｒｅａｃｔｏｒｂｙｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄａｎｄ仔ｅｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＡＲｅｒ２４ｈｏｕｒｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅｍｏＶａｌｗａｓ８６．４％ａｎｄｎｉｔｒ０２ｅｎｒ锄ｏｖａｌｗａｓ９４．０％ｂｙｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｍｉｃｒｏｏ略ａｎｉｓｍｓ；ｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅｍｏＶａｌｗａｓ７１．４％ａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｍｏｖａｌｗａｓ９２．２％．ＨｏｎｇＷｕｌｉｎ（ＥｎＶｉｍｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ）ｂｙＬｉｕＪｉａｎｓｈｅＳｕｐｅ而ｓｅｄＫＥＹＷｏＲＤＳ：ｄｅｎｉｔｒｉ聊ｎｇｐ０１），ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｏ唱ａｎｉｓｍｓ（ＤＮＰＡＯｓ）；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＶ东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究第一章绪论生命起源于水，世上的生命也都离不开水。丰富的水资源，特别是那些淡水资源，不仅是我们人类生存发展的重要条件，而且也是人类走可持续发展道路的坚实基础。然而随着世界科技的进步，工农业的快速发展，再加上世界人口的与同俱增，人类生存的环境正在面临着严重的水资源危机，主要表现在水资源短缺与水资源污染严重两个方面。我国是发展中国家，同时也是一个水资源相对比较贫乏的国家，随着我国经济的不断发展，用水量也在不断增长，因此，水资源贫乏的问题表现得越来越突出。另一方面，水资源短缺的问题也在很大程度上制约了我国经济的快速发展，影响了我国经济社会的可持续发展。《２００９中国环境状况公报》公布的情况表明全国地表水污染依然较重。总体来说，七大水系总体处于轻度污染，浙闽区河流为轻度污染，西北诸河为轻度污染，西南诸河相对水质良好，湖泊（包括水库）富营养化问题依然突出。另一方面，在２６个国控重点湖泊（包括水库）中（主要污染指标为总氮和总磷），满足ＩＩ类水质的只有１个，占３．９％；ＩＩＩ类的５个，占１９．２％；Ⅳ类的６个，占２３．１％；Ｖ类的５个，占１９．２％；劣Ｖ类的９个，占３４．６％；营养状态为重度富营养的１个，占３．８％；中度富营养的２个，占７．７％：轻度富营养的８个，占３０．８％；其他均为中营养，占５７．７％【１１。可见我国短缺的水资源正在遭受水体富营养化的危险，同时水体富营养化也会对我国经济发展和自然环境保护构成不小的威胁，而如何治理水体富营养化已经成为水处理领域的重点之一。因此，控制水体的富营养化，寻求高效、节能的污水脱氮除磷工艺和方法成为了今后要开展的课题。１．１水体富营养化的原因氮、磷等营养元素的过度排放在很大程度上造成了水体富营养化的形成，富含氮磷的废水排放到湖泊等相对静态的水体会引起“水华”，而排放到海洋等相对动态的水体则会引起“赤潮”【２１。总体来说，现在由氮磷所引起的水体富营养化问题已经很严重，并且有加剧的倾向。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究１．１．１水体中氮磷的主要来源水体中，氮的两种存在形态是无机态和有机态。无机氮主要是指硝态氮、亚硝态氮和氨氮，这些氮大部分直接来自工业废水，还有一些是含有有机氮的废水在积存的过程中转化为氨氮等无机氮；有机氮主要有尿素、蛋白质、氨基酸和多肤等，生活污水、农业废弃物和其它一些工业废水是有机氮的主要来源【３Ｊ。另外，水体中的磷主要来自于像粪便、磷化肥和洗涤剂等各种废水，其形态主要有聚磷酸盐、有机磷和正磷酸盐，聚磷酸盐和正磷酸盐占到了其中大多数，还有磷也可以在不可溶性磷和可溶性磷、无机磷和有机磷之间相互发生一定的转换，但价态不出现变化一Ｊ。上述这些含氮磷物质进入水环境的途径不少，概括起来就是以下两类：人类活动和自然过程，其中主要的外部来源是人类活动。外源氮磷进入水体的主要方式是点污染和面污染两种。常见的点污染源包括工业废水与城市污水的直接排放、生活垃圾场和工业废料场等；常见的面污染源包括城市雨水径流污染、农业面源污染和水产养殖等。虽然自然过程中，特别像水体内部自身的沉积物释放出来的氮磷对水体的二次污染作用也很大，但这都不是引起水体中氮磷含量过多的主要原因。［５】１．１．２过多的氮磷对人类生活及环境所带来的危害相对水体的富营养化来说，当水体中磷的含量大于ｏ．５ｍ∥Ｌ时，就会加速水体的富营养化；当水体中磷的含量小于Ｏ．５ｍ∥Ｌ时，就能控制藻类的生长；当水体中磷的含量小于Ｏ．０５ｍ∥Ｌ时，藻类几乎就停止生长【６】。另一方面，过量的氮存在不仅使得水环境质量出现恶化，而且还会对人体健康以及动、植物的生存产生相当大的危害，包括以下几个方面：（１）游离氨会影响到鱼腮中氧的传递，故而成为鱼类的有毒物质之一（对很多鱼类来说，水体中游离氨对鱼的致死量为１ｍ∥Ｌ）峥Ｊ；（２）氨氮进入水体后会被硝化细菌氧化，同时消耗了水体中的溶解氧；（３）影响水源水质，同时增加一定的给水处理成本。如果把含有高浓度氨氮的水体用于作为水源，那么会因为氨氮和氯的反应生成氯胺，从而氯消耗量就会增加；还有研究显示，加氯消毒过程中可能会反应生成氯仿等有毒有害物质，并且加氯量越多，生成的有毒有害物质也会越多【６】。（４）水体中的氮化合物会严重危害人和其他生物的健康。饮用水中Ｎ０２’和Ｎ０，一的含量过高，可以导致得肝癌、胃癌、食管癌的几率增加，这是因为在自然条件下ＮＯ：一、Ｎ０３。都有转化为亚硝胺的可能，尤其亚硝胺是一种强致癌物质，对人体的潜在危害更大；再者，饮用水中Ｎ０２‘和Ｎ０３一的含量高也会损害人体内东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究的心血管系统，同时干扰机体利用维生素Ａ，从而导致人体缺乏维生素Ａ［们。１．２生物脱氮除磷技术研究进展水体中氮磷的常规去除方法有化学法、物理法和生物法三种。由于成本最低，适用范围最广，没有二次污染并且操作简单方便，排放的水体达标可靠性强，生物法已经成为氮磷去除的最佳办法。１．２．１传统生物除磷技术污水中所含的磷主要来自人类活动，所存在的各种含磷物质大多数是不同形式的磷酸盐。污水中的磷酸盐类物质按照物理特性不同可以分为颗粒性和溶解性两类；如果根据化学特性不同来分，那么又可以分为有机磷酸盐、聚合磷酸盐和正磷酸盐。由于受到各种因素的影响，城市污水中的含磷量容易出现大的波动，而生活污水中含磷量大致在４ｍ∥Ｌ～１５ｍ∥Ｌ，其中７０％左右是可溶性的。因为在常温条件下单质磷及其化合物没有稳定的气态形式存在，所以污水中的总磷在生化系统中都是被微生物吸附或者结合入细胞跟随剩余污泥一起排除，亦或者随水排出。生物体合成ＨＡｃ④胁／／厌氧环境：释磷、贮碳１．ＨＡｃ一醋酸（ＣＯＤ）２．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ．糖原好（缺）氧环境：吸磷、消耗碳源３．Ｐｏｌｙ—Ｐ．多聚磷酸盐５．ＰＨＢ（聚．Ｂ．羟基丁酸酯）４．ＡＴＰ（三磷酸腺甘）６＿ＮＡＤＨ２一烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶）图１．１聚磷微生物释磷、吸磷机理图Ｆｊｇ．１—１Ｔｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏｖａｌ东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究目前，国际上普遍认可的关于生物除磷技术的理论是“聚合磷酸盐累积微生物”（Ｐｏｌｙ＿ｐｈｏｓｐｈａｔｅＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＰＡＯｓ）的摄／放磷原理：在厌氧／好氧这种交替运行的条件下驯化出具有聚磷功能的微生物，这类微生物可以过量的，并且在数量上超过它本身生理所需的，从体外环境当中摄取磷，并将磷以多聚磷酸盐的形式贮存在微生物体内，形成含磷高的污泥，从而将磷排除系统，实现废水生物除磷的目的【７、８、９１。厌氧释磷和好氧过量吸磷是传统生物除磷两个过程，其代谢模式如图１．１所示ｌＩ…。厌氧释磷阶段【ｌｏ】：厌氧条件下，聚磷菌会水解体内的ＡＴＰ，生成ＡＤＰ，同时释放出一些能量，此时会分解细胞内的多聚磷酸盐（Ｐ０１ｙ．Ｐ），并以无机磷酸盐（Ｐｏ；一）的形式从体内释放出去。另外，聚磷菌可以利用糖原酵解产物（ＮＡＤＨ２）和部分能量来摄取废水中的有机物质同时合成有机颗粒物质聚．ｐ－羟基丁酸（Ｐｏｌｖ－Ｂ．Ｈｙｄ—ｒｏｘｙｂｕｔ河ｃａｃｉｄ，ＰＨＢ），贮存于细胞体内。好氧吸磷阶段【ｌｏ】：在好氧条件下，聚磷菌以０２作为电子受体氧化分解体内存贮的ＰＨＢ，并将此过程所产生的能量用于完成细胞的繁殖代谢，同时ＡＤＰ也会获得一些能量，去合成ＡＴＰ：此外，聚磷菌可以超量吸收细胞体外的磷酸盐用于合成Ｐｏｌｙ－Ｐ等有机颗粒物质并且储存在体内。１．２．２传统生物脱氮技术２０世纪７０年代中期，在生物、催化和化学处理方法研究的基础之上，一些南非和美国的水处理领域专家提出了一种相对经济有效的技术——废水生物脱氨化菌亚硝化菌硝化菌反硝化菌ｏｒ哥Ｎ——————◆ＮＨ４＋－Ｎ———◆Ｎ０２一二Ｎ——◆Ｎ０３。心卜———＋Ｎ２（好氧或厌氧，需要有机物，产酸）（好氧，不需要有机物，耗碱）（缺氧，需要有机物，产碱）氨化作用硝化作用反硝化作用Ｎ０２’一Ｎ—◆ＮＨ２０Ｈ—————◆ＮＨ３（Ｉ司步反石肖化，成为有机／／Ｎ０３’－Ｎ＼原生质）Ｎ０２。－Ｎ——卜Ｎ２０————◆Ｎ２（异化反石肖化，成为气态氮）＿◆Ｎ２（异化反硝化，成为气态氮）、０２－．Ｎ一．－Ｎ２０——图１．２生物脱氮的原理图Ｆｉ２．１．２Ｔｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａ２ｒａｍｏｆｂｉｏｌ０２ｉｃａｌｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究氮技术［８】。近些年以来，废水生物脱氮技术经历了较快地发展，不少脱氮工艺被一些研究提出来，而且这些工艺也出现在了一定的实际应用中；另一方面，关于废水生物脱氮的理论也日渐成熟。废水生物脱氮技术具有很好的应用前景，它的基本原理是有机氮转化成氨氮以后，通过硝化菌和反硝化菌的先后作用，利用硝化作用使氨氮转化成亚硝氮、硝氮，然后再通过反硝化作用可以把硝态氮再转化成氮气，达到了废水中氮去除的目的。另外，废水中氮的去除也包括了依靠微生物细胞自身的同化作用使氮转化成为细胞体内的原生质成分，详细过程如图１．２…Ｊ。１．２．３生物反硝化除磷技术的发现在传统的生物脱氮除磷工艺中存在着一些难以解决的弊端，针对硝酸盐氮的影响和碳源不足问题，传统的脱氮除磷工艺都进行了适当的改进，但是都只能起到缓解脱氮和除磷之间矛盾的作用，无法从根本上解决问题。最新的研究发现¨卜１４Ｌ４种反硝化聚磷细菌具有兼性厌氧的特点，可以在缺氧条件下利用Ｎ０３’作为电子受体来氧化污水中的有机物，同时进行过量摄磷，这样就把除磷和反硝化两个看似不同的生物过程，借助同一种微生物在同一种环境中同一时刻进行，这样的放磷／摄磷作用被叫做“反硝化除磷”。Ｋｕｂａ【１５】发现反硝化磷菌（Ｄｅｎｉｔｒｉ劬ｎｇＰｈｏｓｐｈａｔｅ—ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇＯ唱ａｎｉｓｍｓ，ＤＮＰＡＯｓ）除磷能力与传统～ｏ工艺中～般的聚磷菌相似，生物代谢机理也相似。所不同的是，这些聚磷菌除了利用０２作为电子受体外，还可以利用Ｎ０３一作为电子受体来氧化体内储存的ＰＨＢ，然后将氮元素以氮气的形式从系统中排除，摄磷和反硝化两个过程就可以同时进行了，完成了氮、磷元素一起去除的目的，使生物脱氮除磷工艺得到简化，因此该技术的应用前景很广。１．３反硝化除磷技术的应用反硝化除磷技术是指在缺氧条件下，利用反硝化聚磷菌以硝酸盐作为电子受体，反硝化和过量摄磷同步完成的一项生物处理技术【１６】。跟传统的生物脱氮除磷技术作比较，反硝化除磷技术能有效解决或减弱这些传统生物脱氮除磷技术中的一些矛盾，同时还能使耗氧量和污泥产量分别下降３０％和５０％【１７、１８１，并减少了工艺的复杂性，比较适用于氮磷含量高的废水。１．３．１反硝化除磷技术的机理研究早在上个世纪八十年代人们就在对脱氮除磷系统的研究中发现，聚磷菌不是东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究专一的好氧菌，研究者们提取到的活性污泥中有一些聚磷菌能利用硝酸盐作为电子受体来完成反硝化除磷【”Ｊ。１９９３年的时候，荷兰ＤｅｌＲ大学的Ｋｕｂａ也在试验中发现ｕ５Ｊ：在厌氧／缺氧交替运行的条件下，可以富集到同时具有过量摄磷和反硝化两种作用的一类兼性厌氧微生物，此种微生物可以利用０２或Ｎ０３一作为电子受体，并且它基于胞内物质聚．Ｄ．羟基丁酸（Ｐ０１ｙ．ｐ．ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，ＰＨＢ）和糖原质的生物代谢过程与传统Ａ／０法中的聚磷菌（ＰＡｏｓ）相似，所以人们就把此类微生物称为反硝化聚磷菌（ＤＰＡＯｓ）。针对这类微生物的反硝化除磷作用，科学家们提出了两种不同的假说：第一种是两类菌属学说ｕ９、２０Ｊ，即把生物除磷体系中的ＰＡ０ｓ分成两类菌属，其中一类只能利用０２作为电子受体，而另一类则不仅能利用０２而且又能利用Ｎ０３一来作为电子受体，所以后者在吸磷的同时完成了反硝化；第二种假说是一类菌属学说［２¨，也就是说在生物除磷的体系中只存在着一类ＰＡＯｓ，它们能在一定程度上表现反硝化这种能力，而能否将这种能力表现出来关键取决于厌氧／缺氧这种交替环境是否被强化，一旦环境被强化，那么系统中ＰＡＯｓ所展现出来的反硝化这种能力就会越强，反之亦然，换句话说，要是给ＰＡＯｓ创造出特定的厌氧／缺氧这样交替运行的环境那么就会诱导出它们体内那些具有反硝化作用的酶，这样ＰＡＯｓ才可以拥有了反硝化能力。这两种假说目前的支持者都有，但是大部分还是比较认同前者。前段时间又有一些研究者利用厌氧／缺氧系统中的聚磷污泥分别以０２、Ｎ０３‘和Ｎ０２。作为电子受体来进行关于吸磷效果的对比试验研究，结果发现系统中存在一类可以利用０２、Ｎ０３。和Ｎ０２。作为电子受体的聚磷微生物［２２１。根据这个结论，该研究者认为关于反硝化除磷菌的两类菌属假说应该扩增到了三类菌属假说。关于Ｎ０３’是否可以作为生物除磷过程中的电子受体，Ｖ１ｅｋｋｅ等人【２ｊＪ和眦ａｈｉｒｏ等人【２４】分别利用厌氧／缺氧ＳＢＲ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ／ａＩｌｏｘｉｃＳＢＲ，简称∥ＳＢＲ）系统和固定生物膜反应器来进行了相关的试验研究。结果发现，作为氧化剂的Ｎ０３。和０２在微生物的除磷过程中都起到了相同的作用，而且通过创造厌氧／缺氧这种交替的环境，就可以从该环境中分离筛选出利用Ｎ０３。作为电子受体进行除磷的聚磷菌菌属即ＤＰＡ０ｓ。同时在一些类似的实验室研究中或者～些生产性规模大小的生物脱氮除磷研究中也发现，在经历过厌氧、缺氧和好氧这样三个阶段的强化以后，大约５０％的聚磷菌既可以利用氧气又可以利用Ｎ０３‘作为电子受体来实现除磷过程，也就是说，ＤＰＡｏｓ的除磷效果就相当于所有聚磷菌的５０％左右【６、２５、２６１。这些研究结果不仅表明了硝酸盐在一些微生物进行氧化ＰＨＢ的时候可以作为电子受体，而且也表明了在ＤＰＡＯｓ微生物的确存在于一些污水的生物除磷系统中，同时利用驯化培养是我们可以得到富集ＤＰＡＯｓ的活性污泥。关于ＤＰＡＯｓ的研究可以看出：１）ＤＰＡＯｓ可以在厌氧／缺氧序批反应器中富集；２）在传统除磷系统中发现了大量的ＤＰＡｏｓ；３）跟那些完全好氧的聚磷菌相６东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究比，ＤＰＡＯｓ有相似的除磷能力和对细胞体内包括ＰＨＢ和糖原在内的有机物质的降解能力；４）与好氧聚磷菌在除磷过程中不同的是ＤＰＡＯｓ所利用的电子受体是ＮＯ。。而不是０２，详见图１．２。１．３．２反硝化除磷技术的应用现状现在，关于反硝化聚磷技术的研究，国内外研究者的重点主要集中在工艺试验和影响反硝化除磷的因素上，但是对反硝化除磷脱氮微生物进行单独的研究还不多。首先，在反硝化除磷工艺的研究方面。ＫｅｎｎＪｅｓｐｅｒｓｅｎ等人【２７】在１９９４年利用固定生物膜反应器，在厌氧／缺氧交替的环境中进行生物释磷和摄磷的试验。接种来自于一座生物污水处理厂，生物膜反应器以厌氧２ｈ、缺氧４ｈ作为一个周期交替运行。厌氧阶段注入Ｏ．６Ｌ原污水和ＨＡｃ，缺氧阶段加入磷酸盐、硝酸盐和ｏ．６Ｌ经过一定生物处理的污水。在厌氧／缺氧交替过程中，要用自来水对生物膜反应器进行适当冲洗，确保在缺氧阶段没有ＨＡｃ存在，而厌氧阶段没有硝酸盐存在。同时污泥负荷量是根据污泥量的增加而提高。根据试验结果，ＫｅｍｌＪｅｓｐｅｒｓｅｎ认为：生物膜反应器通过厌氧／缺氧这种交替方式来进行时，该工艺可以利用硝酸盐作为电子受体达到生物除磷的目的。另外在２００１年的时候，新加坡国立大学的Ｗ．Ｊ．Ｎ扩８】也通过利用Ａ２ｓＢＲ试验装置来进行关于反硝化除磷相关试验研究。他在文章写到，从厌氧／缺氧／好氧生物除磷系统中给４个Ａ２ＳＢＲ试验装置进行接种；以人工模拟废水来作为进水，通过向反应器上空不断吹入氮气以防止０２进入，在缺氧段适当补充硝酸盐氮来用作电子受体；反应装置每周期的时间分别选择为６小时或者８小时，然后持续运行时间为１８个月。根据试验结果，Ｗ．Ｊ．Ｎｇ认为在现有的厌氧／缺氧／好氧的生物除磷系统中存在着一些反硝化聚磷菌，这些微生物能在Ａ２ＳＢＲ试验装置中得到一定的富集，系统的反硝化除磷效率可以维持在４０～１００％。同时在２００１年，法国的Ｍ．Ｍｅｒｚｏｕｋｉ【１８】利用大小为１．５Ｌ的Ａ２ＳＢＲ试验装置来进行关于生物缺氧吸磷的试验，该试验所用的污泥是取自法国Ｒｏａｎｎｅ的污水处理厂，同样采用了人工模拟废水来作为进水，在缺氧段适当补充了硝酸盐氮来作为电子受体，反应装置的周期确定为１２小时，持续运行时间定在６０天。通过试验结果的分析，Ｍ．ＭｅｒＺｏ幽认为要想在Ａ２ＳＢＲ反应器当中进行优化缺氧除磷主要取决于两个参数——外加的硝酸盐量和泥龄（Ｓｌ玎）。当泥龄为１５日，同时补充Ｎ０３一－Ｎ量达到１２０ｍ∥Ｌ时，那么Ａ２ｓＢＲ反应器中的磷会全部被去除。在我们国内，研究较早的是中国市政工程华北设计院一个除磷脱氮技术研究组１２圳，他们在１９８７年，利用Ａ２／Ｏ工艺进行中试研究时发现在缺氧段出现了反硝化除磷现象。在２０００年的时候，青岛建筑工程学院的张波等【３ＵＪ利用倒置的Ａ２／０工艺与传统的Ａ２／０工艺进行对比试验，结果发现，７东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离攀定及其同定化应用研究传统Ａ２／Ｏ工艺在缺氧阶段适当补充了硝酸盐以后，聚磷菌就开始了缺氧吸磷，但是它的吸磷速率要比好氧吸磷速率来的慢。虽然上述文献资料报道中运用的试验手段和试验结果存在一定的不同，但是它们都具有一个共同点，那就是研究者们都是从现有的生物脱氮除磷工艺中选取稳定成熟的活性污泥来作为试验的种子污泥，并且在试验过程中都表现出了明显的反硝化除磷现象，所有的厌氧／缺氧试验装置可以在不需要好氧阶段的情况下运行一段时间以后，仍表现出了高效、稳定的厌氧释磷以及缺氧吸磷效果。再者，关于能进行反硝化除磷的微生物的研究。这些年来，关于反硝化聚磷菌这类菌的组成，国内外研究者们陆续进行研究，但是在这方面有说服力的研究报道却不多。国外方面，Ｋｕｂａ【１７１、Ｍｉｎｏ【３ｌ】关于Ａ２ＳＢＲ中的反硝化除磷微生物组成及其生理生化的代谢过程进行了较为深入的研究，而且关于反硝化除磷过程的代谢模型也得到了建立，给出了不少重要动力学和化学计量学方面的参数，为人们今后更深入地理解反硝化除磷机理提供了试验依据。Ｌｏｔｔｅｒｐ２、３３Ｊ研究了三座除磷效果在１９％～４３％的Ｂａｒｄｅｎｐｈｏ法污水处理厂的曝气段活性污泥，结果发现其中不动杆菌属占到５６％～６６％，剩下的能超量吸磷的细菌大多属于革兰氏阳性菌、气单胞菌属和假单胞菌属。对分离纯化出来的１００株细菌进行特定的硝酸盐还原试验，后来发现其中有５２株菌可以将硝酸盐还原成最后的氮气。国内方面，罗宁等【３４】在２００２年的时候首先利用Ａ２Ｎ，／ＡＳＢＲ双污泥反应器取得活性污泥混合液，接着对其进行适当的分离，在他试验得到的微生物当中，气单胞菌属、肠杆菌科细菌、假单胞菌属、莫拉氏菌属这四种菌属占到了细菌总数的６６．６％，它们所起到了的作用主要是反硝化除磷，在这其中假单胞菌属的含量是最高，占到了所有菌株总和的２２．９％。总之，从国内外研究反硝化除磷技术的现状来看，目前大多数研究者大都从宏观环境理论去探讨反硝化除磷的机理及其影响因素，而关于反硝化聚磷菌的菌群及其微生物学特性有待进一步的研究。所以，对反硝化除磷技术的研究可以重点放在对反硝化聚磷菌的筛选和相关应用上，还要从生物学角度进行进一步研究，探讨反硝化聚磷菌的生长条件和脱氮除磷特性，这样有助于反硝化除磷现象的解释。１．４固定化技术在水处理中的应用从上个世纪七十年代以来，微生物固定化技术是随着固定化酶技术的发展而出现的，通过物理或化学手段将细胞固定在有限的空间区域内，并且可以使微生物保持原有的生物活性同时能反复利用的一种相对较新的生物技术。生物固定化技术具有提高生物浓度、保持生物活性和抵御外界环境干扰等功东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究能，一般包括固定化藻、固定化酶和固定化细胞。１．４．１微生物固定化技术的原理与特点目前关于微生物固定化的方法主要包括了吸附法、交联法、膜截留法和包埋法等。吸附法是利用与载体之间的静电、粘附力以及共价结合等作用，将功能菌株吸附在多孔陶瓷、活性炭、大孔树脂、木屑、硅藻土等一些不溶性载体上，从而形成生物膜。这种方法属于物理吸附，操作起来比较简单易行，而且对微生物的活性影响也相对较小，应用也就比较广泛。但是它的不足之处是微生物吸附以后容易出现脱落，重复利用性比较差和反应稳定性能一般。交联法根据利用微生物之间作用的不同，包括化学交联与物理交联。化学交联所用的试剂如聚乙烯亚胺和戊二醛，它们能与微生物细胞进行分子间的交联；物理交联则主要利用在适当的培养条件下微生物细胞自絮凝形成颗粒。由于交联剂的价格比较昂贵，而且微生物的酶会出现一定的失活，所以交联法的应用范围有限。膜截留法的原理是利用中空纤维膜、超滤膜、半透膜等截留作用，使微生物细胞不能透过这些膜，而产物和底物是可以透过去的。虽然这种方法用于水处理效果不错，但是容易出现诸如膜污染和堵塞一系列问题。剩下的第四种方法——包埋法，是比较常用的一种固定化方法，它可以有效地将微生物细胞固定在凝胶聚合物孔隙的有限网络空间中，它的优点是成本较低、抗微生物分解、固定化过程简单、固定化后对微生物无毒、细胞密度大、基质通透性好等等。一般现已采用的包埋载体有琼脂、聚乙烯醇、海藻酸钠和聚丙烯酰胺等一些有机物质。固定化微生物技术的主要优势有【３５、３６】：（１）微生物密度高。传统的废水生物处理工艺中容易出现高生物量浓度，以混合液挥发性悬浮固体浓度（ＭＬｖＳＳ）表示，工艺中曝气池内的微生物浓度一般会在１５００￣３０００ｍ∥Ｌ，并且处在悬浮的生长状态，当工艺负荷过高或者进水微生物浓度过高后都会造成反应器内泥水分离困难或者生物流失等诸多问题而影响出水的水质。如果微生物固定化以后，载体与官能团之间可以发生范德华力或者共价键等作用，这样微生物就不会轻易流失，而且反应器中的微生物浓度也可以得到适当提高。（２）容易实现固液分离。生长在不溶性固定化载体内的微生物，它的密度相对水来说就会大一些，并且微生物密集度高，所以比较容易固液分离，对重复利用也很有利，同时实现了固体停留时间和水力停留时间的分离，为今后水处理新工艺的研究设计提供了利好条件。（３）适用于处理含有高盐度、有害有毒物质的废水。通过不同方法固定化了的微生物，因为它们被包埋材料和作为载体的高分子物质所覆盖，进而减弱了外部环境对微生物的影响，很大程度上提高了反应器工艺运行的安全性。９东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究１．４．２常见的固定化载体一般固定化载体的特点有：对细胞无毒害、不易被微生物分解、制作工艺简单、传质性能好、性质稳定、价格低廉等。现有固定化载体主要包括以下三大类：（１）像海藻酸钙凝胶、卡拉胶、琼脂、骨胶原和明胶等的天然有机载体类。这类载体普遍的优点是对微生物无毒害作用，且传质性好。其中海藻酸钙凝胶对微生物无毒、操作简单、价格便宜，但是这类载体机械强度一般，且在废水处理的过程中，容易被微生物分解，海藻酸钙凝胶也容易受钠离子或钾离子的侵蚀，会不断溶解，影响使用寿命。（２）包括聚乙烯醇（ＰＶＡ）凝胶、聚丙烯酸凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和光硬化树脂在内的人工合成有机载体类。目前国内外研究比较多的一种包埋固定化载体是ＰＶＡ凝胶，它具有化学稳定性能好、抗微生物分解性强、强度高、对细胞无毒性且价格低廉等优点。ＰＶ八凝胶常见的制备方法有紫外线法、冷冻．解冻法和硼酸交联法，其中最为简便经济的是硼酸交联法。（３）无机载体类，包括活性炭、砖粒、陶土、沸石、硅藻土、微孔玻璃和高岭土等，它们的共同特点是具有多孔结构、靠电荷效应或吸附作用将微生物细胞固定，载体中的空隙提供了微生物生长繁殖的空间。这些载体的优势是对细胞无毒害、传质性好、强度大、制备过程简单而且价格低廉，应用价值也不错。但是它们也有缺点，那就是密度大、微生物吸附比较有限且易脱落和流化等。１．４．３固定化微生物技术的研究现状在现代生物工程领域中，固定化微生物技术是一项比较前沿的技术。将生物固定在特定的载体上，形成“生物催化剂”，并用于生化反应，特别是在流化系统中，能够提高反应速率。国内外研究者对微生物固定化技术尤其在脱氮方面进行了不少研究【３７、３８１。日本的中村裕纪等人【３９】通过利用聚丙烯酞胺作为材料，包埋固定硝化菌和脱氮菌，并采用了好氧硝化与厌氧反硝化这样两段工艺开展脱氮试验。在低温条件下，跟悬浮生物法相比较，固定化生物的硝化速度提高了“７倍，脱氮速度也提高了３倍。在国内，赵兴利等人【４ＵＪ利用ＰＶＡ－Ｈ３８０３包埋粉末活性炭和驯化后的硝化菌，在流化床作为反应器的试验中，固定化硝化菌寿命可以长达７个月以上，ＮＨ４＋．Ｎ的去除率可以维持在９０％以上。曹国民等１４ＪＪ利用ＰｖＡ作为载体，采用循环冷冻法将固定化细胞制成平板膜状，利用固定化细胞膜（膜中固定有反硝化细菌和硝化细菌）将脱氮反应器一分为二，膜的一侧和好氧的废水相接触，另外一侧则和缺氧的乙醇水溶液（作为碳源）接触。固定在膜里面的硝化细菌可以将氨氮氧化为亚硝氮与硝氮，随后被同一膜里面的反硝化菌把它还原为氮气，把硝化细菌和反硝化细菌混合固定在膜内时，它的氨氧化速率是单独固１０东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究定硝化细菌时的２倍左右。杜刚等Ｈ２Ｊ利用海藻酸钠和聚乙烯醇包埋固定光合细菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、硝化和反硝化菌，用于进行养殖水体的脱氮研究，发现氨氮、硝态氮的去除率分别可以达到８５．０％和７９．３％。这些研究表明将不同菌群共同固定化以后进行污水处理可以达到较好的效果，但是首先应该考虑投加的不同菌群之间是否具备协同效应。另外，固定化硝化细菌具有耐低温的能力，低温相对提高了硝化细菌对基质的亲和力；同时固定化载体反应受扩散控制，扩散对温度的敏感程度较低【４３ｌ。为了提高固定化微生物去除污水中污染物的能力，应该从以下几方面进行探讨：①寻找可以高效降解或去除特定污染物的功能微生物或菌群。由于污水中的污染物成分比较复杂，所以首先要针对主要成分或特定成分筛选具有特定功能的微生物或菌群。同时微生物应该具有易富集、高成活率、高处理效率和适应环境变化能力强等特点。②研究开发制备简单、性能稳定、价格低廉和与微生物结合力强的固定化载体。③研究高效的固定化微生物反应器，力求高效处理、操作容易、工艺简单、适合连续化和自动化处理污废水的反应器。课题研究的意义与内容１．５．１课题研究的意义由于水资源相对短缺，而且生活中水体富营养化现象也越来越严重，国家以及地方相关部门都出台或者补充了一些有关污水排放的各项标准，尤其是对氮、磷等营养物质的排放标准相对更加严格。传统的生物脱氮除磷技术基本上是对生物硝化、生物反硝化及生物除磷技术的简单结合，由于此类工艺中反硝化和除磷是两个不同的生化过程，两者存在着一定的矛盾【１５】。另外，现在城市污水中的Ｃ／Ｎ和Ｃ／Ｐ比值有明显下降趋势，使得反硝化菌与聚磷菌争夺碳源的问题更加明显。当前不少污水处理厂所排出的出水都无法同时达到氮磷的排放标准，而且在同时脱氮除磷的过程中存在着菌群竞争、泥龄难以控制、碳源不足等一系列问题¨川，所以，寻找一种能同时反硝化除磷的技术就显得很有意义。反硝化聚磷菌可以在缺氧的条件下，利用硝酸盐作为电子受体，同时完成反硝化和过量吸磷两个过程。反硝化聚磷菌的发现为反硝化除磷技术的发展指明了研究方向，使得反硝化除磷技术具备了反硝化过程中无需碳源、吸磷时无需曝气和排泥量少等优点¨７Ｊ【ｌ８｜。利用微生物学知识筛选出能够反硝化除磷的菌种，并将该菌株接种于污水处理工艺中，将会大大改善污水的处理效果。乌梁素海属于内蒙古高原上的干旱区，是该地区典型的浅水草型湖泊，对黄河中上游的调水、蓄水和保水意义重大。该湖属于大型草型湖泊，具有环境保护东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究和生物多样性等多功能，在调节内蒙古西部干旱地区的生态环境、气候以及维持生物的多样性等方面都具有重要作用【４４１。但是，随着工农业现代化的不断推进，每年汇入乌梁素海的各种营养盐加速了乌梁素海的富营养化，使乌梁素海成为了典型的重度富营养化草型湖泊【４引。乌梁素海的富营养化问题严重，这为反硝化聚磷菌的存在创造了条件，而反硝化聚磷技术的应用也为该湖的富营养化治理提供了新的思路。废水生物处理工艺的设计过程中必须以微生物的生长环境和生理生化特性为依据来设置运行工况，这样才能实现所要的生物处理目的。因此，微生物的生化特性研究是废水生物处理法应用的基础。展开对微生物的基础研究，不仅有利于解释现有废水生物处理工艺中出现的现象，而且有利于新工艺的开发与设计。为此，本研究从微生物学角度出发，从乌梁素海湖水中分离筛选出具有高效反硝化聚磷作用的菌株，研究其生物学特性，从而为反硝化聚磷菌的应用提供一些理论依据和技术支持。１．５．２课题研究的内容本研究利用传统平板分离技术，从乌梁素海湖水中，分离筛选出能反硝化除磷的菌株，并对菌株进行了脱氮除磷特性的研究和固定化应用的研究。具体开展的研究包括：（１）反硝化聚磷菌的筛选：从乌梁素海湖水中分离纯化出反硝化聚磷菌菌株；（２）反硝化聚磷菌的鉴定：对所筛选出的菌株进行生理生化实验、Ｂｉ０１０９碳源利用分析试验和１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析试验，确定该菌株的种属；（３）反硝化聚磷菌的生长特性与脱氮除磷特性研究：考察温度、接种量、初始ｐＨ、摇床转速等因素对反硝化聚磷菌生长及脱氮除磷效果的影响；（４）研究反硝化聚磷菌的固定化方法；（５）在模拟反应器中，利用反硝化聚磷菌对模拟废水进行脱氮除磷试验。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究第二章反硝化聚磷菌的筛选与鉴定传统的生物脱氮除磷工艺中存在一些工艺本身不容易解决的矛盾：１）反硝化菌和聚磷菌对碳源一直存在竞争；２）聚磷菌、反硝化菌、硝化菌菌龄各不相同，将各种菌混合在一起就会出现互相制约，很难让整个系统以最优的条件运行。为了克服这些问题，国内外水处理专家进行了大量有针对性的研究，对水处理工艺进行了一定程度的变革，特别是反硝化聚磷菌ＤＰＡＯｓ（Ｄｅｎｉｔｒｉ聊ｎｇｐｈｏｓｐ．ｈｏｍｓ－ａｃｃ啪ｕｌａｔｉｎｇｏ唱ａｎｉｓｍｓ）的出现使生物脱氮除磷工艺有了新的发展前景【１５】。近些年来，反硝化除磷技术已经成为生物水处理技术领域的一个研究热点，而且不少专家学者也意识到了应该从生物学的角度展开进一步研究，探讨了关于反硝化聚磷菌的生长特性和反硝化除磷机理，只有这样才能可以阐明反硝化除磷现象，充分利用它的优越性，提高生物反硝化除磷的效率。但是要从生物学的角度出发，研究反硝化除磷技术，首先应该要解决的问题是如何实现反硝化聚磷菌的富集，并对其进行分离、纯化。所以，本研究利用了传统平板分离的培养方法从内蒙古乌梁素海湖水中分离筛选得到具有反硝化除磷功能的菌株，再通过分子生物学手段对其进行鉴定。２．１材料与方法２．１．１菌株来源内蒙古乌梁素海湖水，由于乌梁素海现在己成为典型的重度富营养化草型湖泊，为反硝化聚磷菌的存在提供了可能性，因此本课题以该湖水作为试验材料。２．１．２培养基与实验仪器设备聚磷菌分离培养基（Ｌ。）㈤：３．６８９ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２０、１３１．８２ｍｇＭｇＳ０４・７Ｈ２０、２８．７３ｍｇＮａ２ＨＰ０４’２Ｈ２０、２６．７４ｍｇＫ２Ｓ０４、５７．２７ｍｇＮＨ４Ｃ１、１７．２ｍｇＣａＣｌ２‘２Ｈ２０、琼脂２０９、１２９ＨＥＰＥＳ缓冲溶液和２ｍＬ微量元素，ｐＨ７．０，用于聚磷菌的分离；牛肉膏３蛋白陈培养基（Ｌ。１）：蛋白胨１０９、牛肉膏５９、ＮａＣＩ５９、琼脂２０９，ｐＨ７．０，用于反硝化聚磷菌的纯化；缺磷培养基（Ｌ１１）‘４７、４８】：３．３２９ＣＨ３Ｃ００Ｎａ・３Ｈ２０、１５２．８ｍｇＮＨ４Ｃ１、２３ｍｇＮａ２ＨＰ０４‘２Ｈ２０、８１．１２ｍｇＭｇＳ０４’７Ｈ２０、１１ｍｇＣａＣｌ２’２Ｈ２０、１７．８３ｍｇＫ２Ｓ０４、７９东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究ＨＥＰＥＳ缓冲溶液和２ｍＬ的微量元素，ｐＨ７．０；富磷培养基（Ｌ‘１）【４７、４８】：３．３２９ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２０、３０５．５２ｍｇＮＨ４Ｃ１、２５ｍｇＫＨ２Ｐ０４、２５．６８ｍｇＣａＣｌ２・２Ｈ２０、９１．２６ｍｇＭｇＳ０４・７Ｈ２０、８．５９ＰＩＰＥＳ缓冲液和２ｍＬ的微量元素，ｐＨ７．０；可作为模拟废水。微量元素溶液（Ｌ。１）【４７、４８】：５９ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、５９ＥＤＴＡ、１．６９ＣｕＳ０４・５Ｈ２０、５９１０ｍｇＭｎＣｌ２・４Ｈ２０、５０ｍｇＨ３８０３、５０ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍ０７０２４‘４Ｈ２０、ＣｏＣｌ２‘６Ｈ２０。ＫＩ和５０ｍｇ实验过程中主要使用到的仪器设备见表２．１表２—１主要实验仪器设备Ｔａｂ．２－１Ｍａｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ仪器恒温培养箱ｐＨ计超低温冰箱离心机冷冻离心机稳压稳流电泳仪紫外一可见分光光度计０１ｙｍｐｕｓ光学显微镜梯度ＰＣＲ仪恒温水浴锅高速离心机型号ＴＦ．１ＡＰＨＳＪ．４Ａ厂家或产地江苏姜堰仪器厂上海雷磁美国德国德国ＨＡＲＲＩＳＥｐｐｅｎｄｏ卜５３０１Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ一５８０４ＲＤＹＹ—ＩＩｌ２ｕ一２９１０北京六一仪器厂ＨＩＴＡｃＨＣＸ３１Ｔ－Ｇｒａ西ｅｎｔ，，，，，ｌｎｅｎｎｏｂｌＯＣＫＯＬＹＭＰＵＳＢｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｅｍａｎｙ天恒仪器ＴＨＥＲＭＯＨＣ．１５１Ｓ—Ｒ台式低速夸容量离心机移液枪电热恒温鼓风干燥箱立式压力蒸汽灭菌锅自动双重纯水蒸馏器生化普通冰箱低温恒温槽数控恒温浴锅空气浴振荡器暗箱式紫外透射仪ＴＤＬ一４０Ｂ湖南星科科学仪器有限公司大龙医疗设备（上海）有限公司上海精密仪器仪表有限公司上海三中上海亚荣生化仪器厂青岛海尔股份有限公司宁波市海曙天恒仪器厂余姚市长江温度仪表厂哈尔滨市东明医疗仪器厂上海顾村电光仪器厂ＤｒａｇｏｎＤＨＧ．９０７０Ａ型ＹＸＱ．ＬＳＳＺ一９３ＨａｉｅｒＤＣＷ一２００８ｘＭＴＥ一７０００ＨＺＱ．ＣＺＦ．９０型１４东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究２．１．３试验分析方法２．１．３．１磷酸盐磷浓度测定【４９Ｊ磷酸盐磷浓度测定采用的是钼锑抗分光光度法。在酸性的条件下，正磷酸盐能与钼酸铵、酒石酸锑钾发生反应，生成磷钼杂多酸，该物质会被还原剂抗坏血酸还原，变成蓝色络合物，通常称为磷钼蓝。本法的最低检出浓度是０．０１ｍ∥Ｌ（吸光度Ａ＝０．０１时所对应的浓度），测定的上限是０．６ｍ∥Ｌ。（１）所需试剂①（１＋１）硫酸；②１０％的抗坏血酸溶液：溶解１０９抗坏血酸于水中，并稀释至１００ｍＬ，该溶液需要贮存在棕色的玻璃瓶中，在４℃冰箱中能稳定几周，但是如果颜色变黄，那么必须重新配置；③钼酸盐溶液：溶解１３９钼酸铵（（ＮＨ４）６Ｍ０７０２４・４Ｈ２０）于１００ｍＬ水中，再溶解Ｏ．３５９酒石酸锑钾（Ｋ（ＳｂＯ）Ｃ４Ｈ４０６・１／２Ｈ２０）于另外的１００ｍＬ水中，在不断搅拌的情况下，将钼酸铵溶液缓缓倒入到３００ｍＬ（１＋１）硫酸中，然后再缓缓倒入酒石酸锑钾溶液使溶液混合均匀，并且贮存在棕色玻璃瓶中，于４℃冰箱中保存至少可以稳定两个月；④磷酸盐贮备溶液（制备溶液每毫升含５０．ｏ嵋磷（以Ｐ计））：先将优级纯磷酸二氢钾（ＩⅢ２Ｐ０４）在１１０℃下干燥２ｈ，再在干燥器中使温度降到室温，然后称取Ｏ．２１９７士Ｏ．ｏ００１９磷酸二氢钾溶于适量水中，并准确移入１００ｍＬ的容量瓶中，同时加（１＋１）硫酸５ｍＬ，最后用水稀释至标线；⑤磷酸盐标准溶液：准确吸取１０．００ｍＬ磷酸盐贮备液到２５０ｍＬ容量瓶中，用水稀释至标线，该溶液每毫升含２．００岭磷（以Ｐ计），应该现用现配。（２）标准曲线的绘制取若干支５０ｍＬ具塞比色管，分别加入磷酸盐标准液Ｏ．ｏｏ、Ｏ．５０、１．ＯＯ、３．ＯＯ、５．ＯＯ、１０．ＯＯ、１５．ＯＯｍＬ，加水稀释至５０ｍＬ。①显色：向每只比色管中分别加入１ｍＬｌＯ％的抗坏血酸溶液，混合均匀，３０ｓ后再加入２ｍＬ钼酸盐溶液充分混合均匀，放置１５ｍｉｎ。②测量：用１０ｍｍ比色皿，于７００啪波长处，以蒸馏水作为参比，测量吸光度，每个样品需进行三次重复测定，以减少试验误差。将得到的数据绘制成吸光度（Ａ）与磷酸盐磷浓度的标准曲线，如图２．１所示。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究磷酸盐磷浓度／（ｍｇ・Ｌ’１）图２．１磷酸盐磷标准曲线Ｆｉｇ．２－１Ｔｈｅｓｔａ玎ｄａｒｄｃｕｒＶｅｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅｓａｌｔｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ（３）水样中磷酸盐磷浓度的计算分别取适量经过滤膜过滤或者消解的水样（使待测样含磷量不得超过３０ｐｇ）加入５０ｍＬ比色管中，用水稀释至标线。按绘制标准曲线的步骤进行显色和测量，减去了空白实验的吸光度，得出公式（２．１），利用下式可以求出含磷量。公式（２－１）Ｐｏ；一一Ｐ（ｍｇ／Ｌ）＝警×稀释倍数２．１．３．２异染颗粒染色试验【５０】异染颗粒染色试剂：甲液为甲苯胺蓝Ｏ．１５９，孔雀绿Ｏ．２９，冰醋酸１ｍＬ，酒精（９５％）２ｍＬ，溶于１００ｍＬ蒸馏水；乙液为碘２克，碘化钾３克，溶于３００ｍｌ蒸馏水。实验步骤如图２．２：嬲洲蒯‘一嗍黼｝一燕霎染嬲冲一水洗吸干一羹警美嚣豢翟粉艴濮黼龌暗图２．２异染颗粒染色试验Ｆｉｇ．２—２１’ｅｓｔｏｆｓｔａｉｎｅｄｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃｇｒａｎｕｌｅｓ东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究２．１．３．３ＰＨＢ（聚．Ｂ．羟基丁酸）染色试验［５０］ＰＨＢ染色试剂：染色剂为苏丹黑ＢＯ．３９和酒精（７５％）１００ｍＬ混合摇匀，放置过夜备用；褪色剂为二甲苯；复染剂为Ｏ．５％番红花水溶液。试验步骤如图２．３。按常规法制成涂片用—ｌｌ岭用水冲去染剂，—ｌｌ－用二甲苯冲洗’并用滤纸吸干涂片至无色素苏丹黑染色１０分钟’洗脱一粲？臻争复一一干一飘黔图２—３聚．Ｂ．羟基丁酸染色试验Ｆｉｇ．２—３ＴｅｓｔＯｆｓｔａｉｎｅｄＰＨＢ２．１．３．４反硝化产气试验【５０】（１）培养基：牛肉膏蛋白胨１００ｍ１＋１克Ｉ＜Ｎ０３，调ｐＨ为７．２～７．４，分装试管，每管接培养基高度约为５ｃｍ，１２１℃灭菌２０分钟。（２）接种：用牛肉膏蛋白胨斜面菌苔为菌种，用接种环接种于（１）中培养基封管，同时以不含硝酸钾的培养基作为对照。（３）结果观察：培养１～７天，观察含有硝酸钾的培养基中是否有菌体生长和是否产生气泡，如产生气泡说明有反硝化作用有氮气产生，则为阳性反应；但如果不含硝酸钾的对照培养基也有气泡产生则只能按照可疑或阴性处理：不产气泡则为阴性。２．１．３．５硝酸盐氮浓度测定‘４９】硝酸盐氮浓度测定采用紫外分光光度法，利用硝酸根离子在２２０啪波长处的吸收而定量测定硝酸盐氮。虽然溶解的有机物在２２０１１１１１处也会有吸收，但是硝酸根离子在２７５１１ｌＩｌ处没有吸收。因此，可以在２７５ｎｍ处再作另一次测量，以校正硝酸盐氮值。本法的最低检出浓度为Ｏ．０８ｍ∥Ｌ，测量上限为４ｍ∥Ｌ。（１）所需试剂①１０％的硫酸锌溶液；②５ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液；③１ｍｏｌ／Ｌ的盐酸：④硝酸盐标准贮备液：每毫升含有０．１００ｍｇ硝酸盐氮；⑤０．８％的氨基磺酸溶液：需避光保存于４℃冰箱中；（２）标准曲线绘制在６个２００ｍＬ的容量瓶中分别加入Ｏ．ＯＯ、Ｏ．５０、１．ｏｏ、２．００、３．ｏｏ、４．ＯＯｍＬ硝酸盐氮标准贮备液，用新鲜去离子水稀释至标线，其浓度分别为Ｏ．ｏｏ、Ｏ．２５、东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究Ｏ．５０、１．００、１．５０、２．ｏｏｍ∥Ｌ硝酸盐氮，然后用光程长１０ｍｍ的石英比色皿，以试剂空白（０号）为参比溶液，在２２０１１１１１和２７５ｎｍ波长下分别测定其吸光度。每个样品进行三次重复测定，以减少试验误差。用所得的数据绘制出吸光度（Ａ）与硝酸盐氮浓度的标准曲线，如图２—４所示。硝酸盐氮／（ｍｇ．Ｌ。）图２－４硝酸盐氮标准曲线Ｆｉｇ．２－４．ＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｎｒｅｏｆｎｉｔｒａｔｅｓａｌｔＩＩｉｔｒｏｇｅｎ（３）计算硝酸盐氮浓度取适量水样加去离子水稀释至１００ｍＬ，加入１ｍＬ硫酸锌溶液，在搅拌的情况下加氢氧化钠溶液，调至ｐＨ７。待絮凝胶团下沉后，经４０００ｒ／ｍｉｎ离心分离，吸取上清液５０ｍＬ于比色管中待测。用１０ｍｍ石英比色皿，在２００ＩⅡｎ和２７５１１１１１波长处分别测量吸光度。矫正吸光度Ａ枝的计算方式如公式２．２。Ａ校＝Ａ２２０．２Ａ２７５式中：Ａ２２ｒ２２０哪波长测得吸光度；Ａ２７５——２７５ｎＩＩｌ波长测得吸光度。公式（２－２）求得吸光度的校正值（Ａ校）以后，利用公式（２．３）求得相应的硝酸盐氮量，即为水样测定结果（ｍ∥Ｌ）。如果水样经稀释后测定，那么结果应乘以稀释倍数。公式（２。３）Ｎｏｉ—Ｎ（ｍｇ／Ｌ）＝警×稀释倍数东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究２．１．４菌株分离方法先将保存好的水样混合均匀，接着用移液管准确移取１０ｍＬ水样，并且移入至盛有９０ｍＬ无菌水的三角瓶中，充分振荡使其混合均匀，然后按倍比稀释，分别得到１０～，１０～，１０一，１０‘４，１０‘。，１０击的稀释溶液。分别取１０～，１０一，１０～，１０曲不同浓度的０．１ｍＬ水样溶液在聚磷菌分离培养基上进行涂布培养，在恒温隔水式培养箱中，３０℃条件下培养２天。从这几个稀释梯度中挑选出１个合适的梯度，要求平板上菌落分布清晰均匀（菌落数最好一般在３０～３００个），然后用此梯度的水样进行３个重复平行涂布，挑取形态清晰、易于挑取的单菌落用牛肉膏蛋白胨培养基进行纯化，重复３次以上菌落形态特征一致，如果没有异常菌落出现，那么可以认为是单菌落，即完全纯化。然后挑取最后一次纯化在平板上的单一菌落接种到斜面培养基上培养２天，４℃保存备用。用１ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液和１ｍ０１／Ｌ的盐酸将所需培养物调到ｐＨ７．０，选取上面分离纯化后所得斜面菌株，首先接种在缺磷培养基中，通过３０℃，１４０ｒ／ｍｉｎ的摇床进行１～２天的富集预培养；接着取预培养的５ｍｌ菌液，在１ｘ１０４ｒ／ｍｉｎ的条件下离心２分钟，倒去上清液，用无菌蒸馏水洗涤，重复离心２次，将得到菌株悬浮于富磷培养基中，整个过程都需要在无菌操作台上进行；然后将接种好菌株的富磷培养基在３０℃，１４０ｒ／ｍｉｎ的摇床中进行扩大培养，培养２４小时以后，每种菌取１５ｍｌ菌液，在１×１０４ｒ／ｍｉｎ的条件下离心２分钟，取上清液钼锑抗分光光度法测定接种前后Ｐ０４｝。Ｐ含量的变化；最后取除磷率高于５０％的菌株进行硝酸盐还原产气实验、异染颗粒染色实验和ＰＨＢ颗粒染色试验，将既能过量摄磷，又具有反硝化功能并有异染颗粒和ＰＨＢ颗粒的菌株定为反硝化聚磷菌（ＤＮＰＡＯｓ）【７ｌ。２．１．５ＤＮＰＡＯｓ的脱氮除磷试验将富磷培养基作为模拟废水，首先在原有富磷培养基的基础上加入一定量的ＫＮ０３，使硝态氮的含量为６０ｍ１／Ｌ【４７１，接着装入密封的三角锥形瓶，取预培养２４小时后的ＤＮＰＡＯｓ进行无菌蒸馏水洗涤２次，离心后投入到加有ＫＮ０３的富磷培养基中；最后在３０℃恒温隔水式培养箱中培养２４小时后用钼锑抗分光光度法测定培养前后磷含量的变化，并用紫外分光光度法测定硝态氮含量的变化。２．１．６菌株的鉴定２．１．６．１形态学与生理生化鉴定东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究将处于稳定期的菌液制片，并做革兰氏染色试验，在光学显微镜下观察。剩余菌液梯度脱水处理后进行扫描电镜分析。对固体平板上菌落进行形态观察。参照《常见细菌系统鉴定手册》［５０１和《伯杰氏细菌鉴定手册》【５１１对菌株进行形态和结构特征、培养特征和生理生化特征等方面的初步鉴定。２．１．６．２Ｂｉｏｌｏｇ碳源利用分析利用Ｂｉｏｌｏｇ微生物自动分析系统，以菌株对微平板上９５种碳源的利用情况为基础进行鉴定。２．１．６．３菌种的分子生物学鉴定１６ＳｒＤＮＡ是一段相对保守的区域，被称作细菌进化的分子钟，其序列在所有的原核生物中具有极高的保守性，它常常被作为鉴定细菌的目标区域，通过对菌株１６ＳｒＤＮＡ的克隆及序列测定和比较【５２】，可进一步鉴定出菌株的分类地位。提取纯菌株的总ＤＮＡ，用细菌的１６ＳｒＤＮＡ通用引物，扩增出菌株的１６ＳｒＤＮＡ的片段。（１）筛选菌株的ＤＮＡ提取从活化培养２４ｈ的目的菌株中提取基因组ＤＮＡ。在实验中，采取的是ＴｉａＩｌＧｅｎ试剂盒提取基因组ＤＮＡ的方法。具体操作步骤如下：Ａ）取细菌培养液１．５ｍＬ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，尽量吸净上清。Ｂ）向菌体沉淀中加入２００ｕＬ缓冲液ＧＡ，振荡至菌体彻底悬浮。Ｃ）向管中加入２０¨Ｌ蛋白酶Ｋ溶液，混匀。Ｄ）加入２２０此缓冲液ＧＢ，振荡１５ｓ，７０℃放置１０ｍｉｎ，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。Ｅ）加２２０此无水乙醇，充分振荡混匀１５ｓ，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。Ｆ１将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱ＣＢ３中（吸附柱放入收集管中），１２ｏｏＯ“ｍｉｎ离心３０ｓ，倒掉废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管中。Ｇ）向吸附柱ＣＢ３中加入５００江缓冲液ＧＤ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，倒掉废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管中。Ｈ）向吸附柱ＣＢ３中加入７００ｕＬ漂洗液ＰＷ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，倒掉废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管中。Ｉ）向吸附柱ＣＢ３中加入５００ｕＬ漂洗液ＰＷ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，倒掉废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管中。Ｊ１将吸附柱ＣＢ３放回收集管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，倒掉废液。讲吸附柱ＣＢ３置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。Ｋ）将吸附柱ＣＢ３转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究５０．２００此洗脱缓冲液ＴＥ，室温放置２．５将溶液收集到离心管中。ｍｉｎ，１２Ｏｏｏｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，提取结果用１％的琼脂糖凝胶电泳检测。切胶并用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒回收，从而获得纯化好的菌体总ＤＮＡ。（２）基因组ＤＮＡ凝胶纯化方法基因组ＤＮＡ凝胶纯化方法由ＴｉａｎＧｅｎ的凝胶纯化试剂盒提供，具体的操作如下：Ａ）柱平衡步骤：向吸附柱ＣＡ２中（吸附柱放入收集管中）加入５００ｕＬ平衡液ＢＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。Ｂ）将单一的目的ＤＮＡ条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。Ｃ）向胶块中加入３倍体积溶胶液ＰＮ：当回收的目的片段＜１５０ｂｐ或琼脂糖凝胶浓度＞２％时，建议使用６倍体积溶胶液ＰＮ。５０℃水浴放置１０ｍｉｎ，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解。Ｄ）将上一步所得溶液加入一个吸附柱ＣＡ２中，室温放置２ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０－６０ｓ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ＣＡ２放入收集管中。Ｅ）向吸附柱ＣＡ２中加入６００“Ｌ漂洗液ＰＷ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０．６０ｓ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ｃＡ２放入收集管中。Ｆ）向吸附柱ＣＡ２中加入６００“Ｌ漂洗液Ｐｗ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０．６０ｓ，倒掉收集管中的废液。Ｇ）将吸附柱ＣＡ２放入收集管中，１２ｏｏＯｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，尽量除尽漂洗液。将吸附柱ＣＡ２置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以放置残留的漂洗液影响下一步的实验。Ｈ）将吸附柱ＣＡ２放到一个干净离心管中，想吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液ＥＢ，室温放置２液。（３）细菌的１６ＳｒＲＮＡｍｉｎ。１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ收集ＤＮＡ溶ＰＣＲ扩增①扩增细菌１６ｓｒＲＮＡ的引物为２７Ｆ和１４９２Ｒ【５３】，它们的序列如下：２７Ｆ１４９２Ｒ５’一ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ．３’：５’一ＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＩ’ＡＣＧＡＣＴＴ－３’：以上引物由上海生工生物技术公司合成。②进行细菌１６ｓｒＲＮＡ．ＰＣＲ的反应体系如表２．２：东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究表２．２１６ＳｒＩⅢＡ．ＰＣＲ反应体系１’ａｂｌｅ２—２ＲｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍＯｆ１６ＳｒＩｔＮＡ－ＰＣＲｌ０×ＰＣＲＢｕｎｅｒ５¨Ｌ４ｕＬ３¨Ｌ１“Ｌ１¨ＬｄＮＴＰｓ（各２．５ｍｍ０１）ＭｇＣｌ２（２５ｍｍ０１）Ｐｒｉｍｅｒ２７Ｆ（１０岬０１）Ｕ／灿）Ｐ血ｎｅｒｌ４９２Ｒ（１０岬０１）Ｔａｐ酶（５ｄｄＨ２０（已灭菌）模板ＤＮＡ共计：０．５“Ｌ３３．５¨Ｌ２斗Ｌ５０¨Ｌ③１６ＳｒＲＮＡ．ＰＣＲ反应的程序：９４℃预变性３９４℃变性１ｍｉｎ；ｍｉｎ；＋—］５５℃退火３０ｓ；７２℃延伸１ｍｉｎ；ｆｌ（共３０个循环）７２℃延伸ｌＯｍｉｎ，４℃保温。④ＰＣＲ产物以１．Ｏ％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增是否正确、污染。电泳缓冲液为新配置的１×ＴＡＥ，电压１００Ｖ，电泳约２０．３０ｍｉｎ。紫外灯下检测查看条带在１５００ｂｐ左右，将正确的条带切下来进行凝胶纯化，方法由ＴｉａｌｌＧｅｎ的凝胶纯化试剂盒提供（如上（２））。ＰＣＲ扩增产物的纯化和测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果用ＢＬＡＳＴ软件于ＧｅｌｌＢａＩｌｌ（中的１６ＳｒＲＮＡ序列进行同源性比较，用Ｃｌｕｓｔａｌｘ软件进行系统发育树分析，并用ＭＥＧＡ４．１构建系统发育树。２．２结果与讨论２．２．１菌株的筛选结果经过初步得筛选得到单菌落菌株１０株，按照上述方法在缺、富磷液体培养基内培养后，选出除磷率在５０％以上的８株菌，经硝酸盐还原产气试验、异染颗粒染色及ＰＨＢ颗粒染色试验，结果见表２—３。由表２．３得只有菌株Ｐ１。１有异染颗粒、ＰＨＢ（聚一ｐ一羟基丁酸）颗粒和反硝化产气能力，分别如图２—５、２—６、２・７。查竺奎堂堡主兰垡笙塞反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究—————————————————————————————————————————————————————二二：：：：：：：：：：＝二：：：＝：＝：＝：＝：：：二：表２－３菌株的筛选结果７１１ａｂｌｅ２－３】［ｋｓｕｌｔｓｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎ２ｓｔｒａｉｎｓ————————————————————————————————————————————————————一Ｐ１—１９８％有、大有、大有、小有、大有、小有、小有、大有、小有、明显Ｐ１—２Ｐ２—１Ｐ２－２Ｐ２－３Ｐ３－１堕堡鱼整除磷率／％异染颗粒ＰＨＢ反硝化能力：：：二：：二：：有无无无无无无无９９％９９％９９％９１％７５％９９％有、不明显未观察到有、明显有、不明显无有、不明显无Ｐ３－２』！：１２鱼％图２—５菌株Ｐ１．１异染颗粒染色结果Ｆｉｇ．２—５ＲｅｓｕｌｔｏｆｓｔａｉｌＩｅｄ图２—６菌株Ｐ１．１ＰＨＢ染色结果Ｆｉｇ．２－６ＲｅｓｕｌｔｏｆｓｔａｉｌＩｅｄＰＨＢＯｆｓｔｒａｉｎＰ１．１ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃｇａｎｕｌｅｓｏｆｓｔｒａｉｎＰ１．１２３东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究图２．７菌株Ｐ１．１反硝化产气试验结果Ｆｉｇ．２—７ＲｅｓｕｌｔｏｆｇａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｅｄｂｙｓｔｒａｉｎＰ１・１２．２．２反硝化聚磷茵的脱氮除磷试验经过２４小时缺氧培养后测定Ｎ０３。．Ｎ和Ｐ０４３。一Ｐ的含量变化，发现菌株Ｐ１—１除磷率达到７２．４％，脱氮率达到９１．４％。根据马放等【４７Ｊ所报道的高效反硝化聚磷菌的除磷和脱氮效果，本试验筛选到的菌株已经表现出了较好的反硝化除磷能力。虽然菌株Ｐ１．１在缺氧条件下具有反硝化过量吸磷的能力，但是缺氧条件下磷的去除效果没有像好氧条件下那么好，这是由于利用硝态氮吸磷时可能不如利用分子氧效率高【５４｜。２．２．３菌株Ｐ１．１形态特征与生理生化特性菌株Ｐ１．１革兰氏染色反应呈阴性，光学显微镜和扫描电镜显示该菌为典型的短杆状，大小０．３～Ｏ．４岬×１．２～２．Ｏ岬（见图２．１０）。在固体牛肉膏蛋白胨培养基上培养２４ｈ菌落直径小于１ｍｍ，４８小时菌落可以基本长成，菌落直径１～２ｍｍ，不透明，米黄色，拱顶球状，表面光滑湿润，边缘整齐，易挑起。菌株Ｐ１．１主要生化特性为兼氧，氧化酶阳性，接触酶阳性，其基本生理生化特性与假单胞菌属（ＲＰ“如聊Ｄ以口ｓ）很相似（见表２—４）。２４黪。；｜；黻凰黛躺‰ｋ黧图２．９菌株Ｐ１．１显微镜照片（ｘ１０００）ｉｎ图２－８菌株Ｐ１一ｌ菌落形态Ｆｉｇ．２－８ＣｏＰ１－１（×１０００）图２・ｌＯ菌体的扫描电镜照片Ｆｉｇ．２—１０ＳＥＭｉｍａｇｅｏｆｓｔｒａｉｎＤ）（．Ｔ３．Ｏｌ鼍坐兰．三－４Ｉｄｅｎｔｉｆ．ｙｉＩｌｇ接触酶塑生化试验————■＿＿■■—■————————————————————————————一一菌株Ｐ１．１＋ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｔｒａｉｎＰ１．１生理生化试验革兰氏染色菌株Ｐ１．１：：：：二注ａ：＋：阳性：．：阴性。、、亏雪，ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ；；ｉ２５Ｎｏｔｅａ：＋：ＰｏｓｉｔｉＶｉｔｙ；一：Ｎｅｇａｔｉｖｉｔｙ．东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究２．２．４菌株Ｐ１—１Ｂｉｏｌｏｇ碳源利用分析Ｂｉｏｌｏｇ碳源利用分析结果：将Ｂｉｏｌｏｇ系统鉴定结果与数据库进行匹配，如图２－１１，地址栏显示最佳匹配名称为风ｅ“如聊Ｄ刀口ｓ／玩ｏＭｃｅ刀ｓ，系统得到的３个重要参数均比较理想，分别为：ＳＩＭ值＝０．５１４，ＤＩＳＴ＝４．３５５，ＰＲＯＢ＝６７．２％。Ｂｉｏｌｏｇ分析结果说明该菌株与ＡＰ甜如聊Ｄ胛以ｓ∥甜Ｄ陀，ｃＰ船ｓ匹配度最高且达可信程度。ＲｅａｄＴｉ帕ｅＤａｔａｂ酣ｅ蕈ｏＳｅ羽ｃｈＡ甜１２２０１１３．３３ＰＭ８ｂｌｏ∞８Ｂｉｏｂｇ沁ＤＢ¨ｌ料ｌＤｂＢ￡’、Ｐｔ喇ａｍ＃ｉｊｅ耄、Ｂｉ。ｊ。日蝣０∞。蒲袖｝ａ幻辨￥增ｉ。均Ｓ￡¨捌∞．１骗Ｐ只ｏＢｌｓ瀚旺５１４往｛Ｏａ旺时０ＤＩｓｆｌｏ｝９ａ—ｌｍＴ弭滩６Ｎ・Ｎ￡Ｎ１Ｇ刘．Ｎ￡ＮＴＧ釉．Ｎ￡Ｎ下Ｇ釉Ｗ￡ＮＴＳ口ｏｃｉｅ军ｌ－・）１ｆ２Ｂ６７２Ｇ１４９４、３晒４．８姻Ｓｆ。５３５；１１３Ｐ零亭岫ｍ∞｛蹲｝ＩｔＩ口４ｅ￥ｏｅｒ嚣Ｐ窜ｅｕｄ口ｍｏｎａ霉ｍａ田ｉｎａ缸１３４Ｄ∞７Ｏ，嘴２矗嘲。镑喇洲嘲狮嘲坼｛口罩ｅ喃ｍ∞融配珀ａ蛹图２－ｌｌ菌株Ｂｉｏｌｏｇ系统鉴定结果Ｆｉｇ．２—１１ＩｋｓｕｌｔｓｏｆＢｉＯｌｏｇ２．２．５菌株Ｐｌ一１１６ｓｒＲＮＡ基因序列分析测定菌株Ｐ１．１的１６ＳｒＲＮＡ序列长度为１４４０ｂｐ，在ＧｅｎＢａｎｋ中的序列登录号为ＪＮ０３０４９８。序列如下：ＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＣＴＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＡＧＧＴＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡ久ｎ奸ＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡＧＧＴＧＧＴＴＡＧＴＴＡＡＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧ２６东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究ＡＣＴＡＧＡＧＴＡＴＧＧＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡｎ虹ＡＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧ』钢［、ＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧ芦０ＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＡＧＣＣＧＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＧＧＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＴＧＡ椰ＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＩ、ＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＧＡＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＴＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＴＡＣＡＧＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＧＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＩＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＣＴＡＧＴＣＴＡＡＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＡＣＧＴＡＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧ采用１６ｓｒＲＮＡ序列分析法进行同源性比较发现，１６ＳｒＲＮＡ基因序列与ＧｅＩｌＢａｎｋ中已有的多株风ｅ扰如ｍｏ豫ｎｓ伽。比ｓｃｅ以ｓ菌株相似性都在９９％。图２．１２所示为使用ＭＥＧＡ３．１软件构建的基于１６ＳｒＲＮＡ序列的系统发育树。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉｎｃｏｎｆＧＵ９６８ｉ８４，ＰｓｅｕｄｏｍｏｎｎＳｓｐ．Ｎｚ０２４‘ＡＹｏｌ４８０６）ＰｓｅｕｄｏｍｏｎＱＳｍｄｒ昏ｎｎｌｉｓｓ打ｎｉｎＮｚＣＸ２７（ＡＦ３６４０９８）Ｐｓｅｌｌｄｏｍｏｎｎｓｖｅｒｏｎｉ｛ｌＡＢ４９４４４５）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＰＴ《ＦＪｌ６９４９４）ＰｓｅｔｌｄｏｍｏｎｄｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｓｔｒｎｉｎＰｃ２ｌ（】＿）０ｊ７８２２７）ＰｓｅｕｄｏｍｏｎｎｓｖｅｒｏｎｉｉｓｔｒｎｉｎｃＡ．４厶４Ｙ０８ｌ８ｌ４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎｓｓｐ．Ｕ２—４ｆＥＵ８４９ｌｏｏ）Ｐｓｅｕｄ０＂ｌｏｎ口ｓｎｕｏｒｅｓｃｅｎＳｂｖ．Ｇ（ＡＦ２２８３６６）ｓ护ｎ协Ｐ１．Ｉ渊０３０４９８ｌ图２．１２菌株Ｐ１．１１６ＳｒＲＮＡ序列的系统发育树Ｆｉｇ．２－１２ＰｈｙｌｏｇｅｎｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄＯｎ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓＯｆｓｔｒａｉｎＰ１－１．注ａ：图中分支上的数字表示树形可信度，括号内数字为菌株ＧｅｎＢａｌｌｌ（登录号Ｎｏｔｅａ：ＴｈｅｎｕｎｌｂｅｒｏｎｂｒａｌｌｃｈｓＩａｎｄｆｏｒｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ，ｌｈｅｆｉｇｕｒｅｓｉｎｔｈｅｂｒａｃｋｅｔｄｅｎｏｔｅｓｔｈｅＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ．２７东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究２．３本章小结（１）对水样采用稀释涂布平板法和平板划线法进行聚磷菌的分离纯化，共得菌株１０株，其中有５株除磷率超过５０％，分别记为Ｐ１—１、Ｐ１—２、Ｐ２—１、Ｐ２－２、Ｐ２—３、Ｐ３—１、Ｐ３—２、Ｐ４．１；（２）对除磷率超过５０％的菌株进行异染颗粒染色、ＰＨＢ颗粒染色染色和反硝化产气试验，确定只有菌株Ｐ１—１是高效反硝化聚磷菌；（３）通过生理生化试验、Ｂｉ０１０９碳源利用分析试验以及１６ＳｒＲＮＡ试验，鉴定菌株为鉴定该菌株为荧光假单胞菌，命名为ｎｅ“如聊ｏ，２以ｓ∥“Ｄ煳ｃｅ玎ｓｓｔｒａｉｎＰｌ－ｌ。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究第三章反硝化聚磷茵Ｐ１—１的生长条件与脱氮除磷性能研究微生物生长繁殖是需要通过和体外环境进行能量与物质的交换来实现，因此，微生物的生长会不同程度地受到外部环境条件的影响。当外部环境比较适宜的时候，微生物的生长繁殖良好；当外部环境不适宜的时候，微生物的生长繁殖就会受到抑制，有可能导致细胞死亡。在同一环境条件下，不同种类微生物的适应能力也不相同。一种对某些微生物来说比较适宜的环境条件，但是对另外一些微生物来说可能不适宜甚至有害；另外，对同一种微生物来说，它们对不同外部环境的适应能力也不尽相同，而外部环境的改变则会对它们造成不同程度的影响［５５】。本章试验主要内容为研究在各影响因素条件下反硝化聚磷菌的生长特性及其脱氮除磷效果，从而找出反硝化聚磷菌最适合的生长条件及脱氮除磷条件，为后期的微生物处理废水做参考。３．１试验材料３．１．１试验菌株菌株Ｐｌ—ｌ筛选自内蒙古乌梁素海，由实验室分离、筛选、鉴定并保存。３．１．２培养基牛肉膏蛋白胨培养基（Ｌ．１）：牛肉膏５ｇ、ＮａＣｌ５昏蛋白胨１０ｇ，ｐＨ值为７．Ｏ；作为活化培养基；１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。富磷培养基（Ｌ‘１）阿４８１：３．３２９ＮＨ４Ｃｌ、９１．２６ｍｇＭｇＳ０４’７Ｈ２０、ＣＨ３ＣＯｏＮａ・３Ｈ２０、２５ｍｇＫＨ２Ｐ０４、３０５．５２ｍｇ２５．６８ｍｇＣａＣｌ２。２Ｈ２０、４３２．８５ｍｇＫＮ０３、８．５９ＰＩＰＥＳ缓冲液和２ｍＬ的微量元素，ｐＨ７．０；作为模拟生活废水。微量元素溶液（Ｌ’１）阶４８１：５９ＥＤＴＡ、５９ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、１．６９ＣｕＳ０４・５Ｈ２０、５９Ｈ３８０３、１０ｍｇＭｎＣｌ２。４Ｈ２０、５０ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍ０７０２４‘４Ｈ２０、５０ｒｎｇＣｏＣｌ７・６Ｈ７０。ＫＩ和５０ｍｇ３．１．３主要仪器ＨＩＴＡｃＨＩｕ一２９ｌＯ型紫外可见分光光度计，雷磁ＰＨＳ．３ｃ型ｐＨ计，Ｏｎ７ＭＰＵＳＣＸ３１双目微生物学显微镜。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究３．２试验方法３．２．１细菌生长量的测定采用光电比浊法，当光线通过微生物菌体悬浮液时，由于菌体对光线的散射及吸收作用使光线的透过率下降。在一定波长范围内，微生物菌体浓度与光密度（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ）成正比，与透光度成反比，而光密度或透光度可以用光电池精确测量出来。光波长的选择范围通常在４００．７００啪之间，对于某种微生物需要采用多少波长还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来进行确定。一般情况下，６００１１Ｈ１测细菌、５６０衄测酵母、５０５ｎｍ测菌丝菌体【５５Ｊ。所以，选取６００ｎｍ光波作为测定试验中反硝化聚磷菌菌悬液的ＯＤ值的波长，以此来反应菌株的生长情况。（１）用接种环轻轻挑取斜面培养基上已保存的菌株，并接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，置于３０℃，１４０“ｍｉｎ的恒温振荡培养箱中培养１８小时，这时的菌种培养液作为试验所需的活化液。可以适当多培养一些活化液，在４℃冰箱保存备用。（２）将活化液摇匀后，准确移取１０ｍＬ菌液，以１×１０４ｒ／ｍｉｎ速度离心２ｍｉｎ，倾去上清液，并用无菌水洗涤２次，之后将菌液悬浮在富磷培养液中。以上操作过程都需要在无菌操作台上来进行。（３）接种以后的三角瓶都在恒温隔水式培养箱或者恒温摇床中来进行扩大培养。适当取样，置于４℃冰箱冷藏待测。（４）同时以未接种的富磷培养液作为空白对照，用紫外可见分光光度计在６００ｍ波长下来测定待测菌液中的０Ｄ值，每个数据平行测定三次，以减少试验误差。３．２．２脱氮除磷效果的测定光密度０Ｄ伽值可以用来反映细菌的生长情况，同时细菌生长也消耗了培养液中的磷和氮元素，而且磷和氮元素的消耗量与细菌的生长量呈现出一定的正相关性，但是∞６∞值还是不能准确说明氮磷的去除率，所以还需要对反硝化聚磷菌的脱氮除磷效果进行定量测定，根据脱氮除磷效果再对生长条件进行调控，寻求菌株的最佳脱氮除磷条件。利用钼锑抗分光光度法１４９Ｊ测定富磷培养基培养前后溶液中Ｐ０４３。．Ｐ的浓度：利用紫外分光光度法【４９Ｊ测定富磷培养基培养前后溶液中Ｎ０３一．Ｎ的浓度。３０东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究本章试验主要检测内容及相关分析方法见表３．１。表３．１试验检测内容及分析方法１１ａｂｌｅ３。ｌＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｅｓｔｓ检测内容菌体生长量Ｐ０４孓一Ｐ的浓度Ｎ０３一．Ｎ的浓度分析方法光电比浊法钼锑抗分光光度法紫外分光光度法３．３试验内容３．３．１菌株生长曲线的测定微生物的生长繁殖是它们在内外不同的环境条件相互作用以后的综合反映，相对来说，大部分微生物的生长繁殖速率相当快。将一定含量的微生物转接入新鲜的液体培养基中，并且条件适宜的情况下培养，培养基中的细胞生长繁殖过程将经历延滞期、对数期、稳定期和衰亡期这四个阶段。以培养时间作为横坐标，以菌体生长量或者菌数的对数为纵坐标作图所绘制的曲线可以称作这种微生物的生长曲线【５５｜。定时测定培养过程中反硝化聚磷菌菌株的含量，并绘制出反硝化聚磷菌的生长曲线，从而可以了解反硝化聚磷菌菌株的生长规律，对研究反硝化聚磷菌的生长条件控制有重要的意义。生长曲线测定试验步骤如下：（１）取活化菌液ｌｍＬ接种于１３只装有２０ｍＬ牛肉膏蛋白胨培养液的５０ｍＬ三角瓶中，摇匀；（２）接种以后的１３只三角瓶在３０℃，１４０ｒ／ｍｉｎ恒温摇床中来进行扩大培养，分别培养０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４ｈ，取样以后，４℃冷藏待测；（３）细菌生长量的测定：以蒸馏水作为空白对照，用ＨＩＴＡｃＨＩｕ一２９１０型紫外可见分光光度计在６００ｍｎ波长下测定待测菌液的０Ｄ值，每个数据测定三个平行样，以减少试验误差。３．３．２ｐＨ影响ｐＨ对微生物生命活动的影响很大，具体来说包括以下三个方面：一是ｐＨ３１东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究能使核酸、蛋白质等生物大分子所带的电荷发生改变，从而影响微生物的生物活性；二是ｐＨ能引起细胞膜电荷改变，从而改变微生物细胞吸收营养物质的能力；三是ｐＨ会改变微生物生长环境中营养物质的性质以及有害有毒物质的毒性。对不同微生物来说，它们对ｐＨ条件的要求也各不相同。某种特定的微生物只能生长在一定的ｐＨ范围内，不同微生物的ｐＨ范围，有的宽、有的窄，但是对于某种微生物的最佳生长ｐＨ常常限制在一个较窄的ｐＨ范围。另外，从微生物对ｐＨ条件的不同要求来看，ｐＨ条件在某种意义反映出了微生物对外界环境的适应能力。对于大部分细菌来说，在ｐＨ４～９范围内可以正常生长，生长最适ｐＨ一般会在６．５～７．５。ｐＨ影响试验步骤如下：（１）对配制好的富磷培养液，用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ和１ｍｏｌ／Ｌ的Ｈｃｌ将溶液ｐＨ值分别到４、５、６、７、８、９、１０，然后以５０ｍＬ分装入各１００ｍＬ三角瓶中，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ后，冷却至室温用于接种；（２）移取５ｍＬ反硝化聚磷菌Ｐ１．１活化液，以１×１０４ｒ／ｍｉｎ速度离心２ｍｉｎ，倾去上清液，并用无菌水洗涤２次，接种于装有ｐＨ值不同的富磷培养液中；（３）在培养温度３０℃条件下，置于恒温隔水式培养箱中，密闭恒温培养２４ｈ；（４）测定菌液的∞伽，以及培养前后培养液中氮磷的浓度变化。３．３．３温度影响温度不仅可以影响细胞中的核酸、蛋白质等生物大分子的功能与结构，还可以影响细胞膜的流动性和完整性，改变细胞的结构，导致微生物的生长、繁殖和新陈代谢受到抑制。环境温度过高，蛋白质和核酸就会变性失活，但是环境温度过低，也会抑制酶活力，从而使细胞的新陈代谢活动减弱。对于不同的微生物，其生长繁殖的最适温度各不相同，根据微生物生长要求的最适温度范围，往往可以将微生物分成低温菌、中温菌和高温菌，自然界中绝大多数的微生物是属于中温菌。其中低温菌的最高生长温度不会超过２０℃，中温菌的最高生长温度在４５℃以下，而高温菌则可以在４５℃以上的温度条件下正常生长繁殖，还有一些极端高温菌甚至可以在１００℃以上的温度条件下正常生长。微生物生长繁殖最快的温度视为其最佳生长温度，本节试验主要通过测定不同温度条件下反硝化聚磷菌Ｐ１．１的生长情况和脱氮除磷效果，来找出其最佳生长温度和最佳脱氮除磷温度。具体的试验步骤如下：（１）移取５ｍＬ反硝化聚磷菌Ｐ１．１活化液，１×１０４ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，倒去上清液，用无菌水再洗２次，然后接种于装有５０ｍＬ富磷培养液的１００ｍＬ三角瓶中：（２）在１５、２０、２５、３０、３５、４０℃条件下，置于恒温隔水式培养箱中，密闭恒温培养２４ｈ；３２东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究（３）测定菌液的ＤＤ俐，以及培养前后富磷培养基中氮磷的浓度变化。３．３．４接种量影响接种量是指向新鲜培养液中接种微生物的含量。接种量的大小会影响微生物生长过程中延滞期的长短，通常情况下，接种量大，那么延迟期就短，反之亦然。延滞期过长对研究和工程应用都不利，所以要掌握菌株的合适接种量。一般来说，如果菌株生长迅速的话，那么可以适当减少接种量，但是如果菌株生长缓慢的话，那么应该适当加大接种量。具体试验步骤如下：（１）分别各移取０．５、２．５、５、７．５、１０ｍＬ反硝化聚磷菌Ｐ１—１活化液，１×１０４ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，倒去上清液，用无菌水再洗２次，然后接种于装有５０ｍＬ富磷培养液的三角瓶中；（２）在３０℃条件下，置于恒温隔水式培养箱中，密闭恒温培养２４ｈ；（３）测定菌液的∞伽，以及培养前后富磷培养基中氮磷浓度的变化。３．３．５摇床转速影响摇床的转速大小一定程度上决定了摇瓶内培养液中溶解氧的多少，本节试验通过改变摇床转速的大小来模拟不同溶解氧对反硝化聚磷菌Ｐ１．１的生长和脱氮除磷的影响。如果摇床转速过慢，菌株容易出现聚集，使菌株生长速率下降；当摇床转速提高时，培养液中的通风得到改善，菌株生长也会加快。如果摇床转速过快时，摇瓶内的培养液摇动会很剧烈，容易造成培养液溢出，造成污染，不利于试验研究。具体试验步骤如下：（１）移去５ｍＬ反硝化聚磷菌Ｐ１．１活化液，１×１０４ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，倒去上清液，用无菌水再洗２次，然后接种于装有５０ｍＬ富磷培养液的三角瓶中；（２）在３０℃条件下，分别置于转数为０、６０、１００、１４０、１８０ｎ／ｍｉｎ的摇床中，恒温培养２４ｈ；（３）测定菌液的∞６００，以及培养前后培养液中氮磷浓度的变化。３－３．６碳源影响取不含碳源的富磷培养基３０ｍＬ于１００ｍＬ的锥形瓶中，分别配制成乙酸钠浓度为０ｍ∥Ｌ、２００ｍ∥Ｌ、４００ｍ∥Ｌ、６００ｍ∥Ｌ、８００ｍ∥Ｌ、１０００ｍ∥Ｌ、１２００ｍ∥Ｌ的培养基，在最佳脱氮除磷条件下，密闭培养箱中恒温培养２４ｈ，取样测∞６００、磷酸盐磷浓度和硝酸盐氮浓度。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究３．３．７不同初始磷酸盐磷浓度影响取活化１８小时（ＤＤ６０俨１．４土Ｏ．１）的菌株，分别接入磷酸盐磷初始浓度为６ｍ∥Ｌ、９ｍ∥Ｌ、１２ｍ∥Ｌ、１５ｍ∥Ｌ、１８ｍｇ／Ｌ、２１ｍ∥Ｌ的富磷培养基（无硝酸盐）中，在３０℃、１４∞，ｍｉｎ条件下进行培养，每四小时取样，测量不同初始浓度条件下菌液ＤＤ６∞和磷酸盐磷浓度。３．４试验结果３．４．１生长曲线的测定菌株Ｐ１一ｌ的生长特性如图３．１所示，从图中可以看出，菌株的延滞期不足２小时，说明接种的菌株都处在生长旺盛期，４小时以后菌株进入对数生长期，而在１６小时以后菌株开始进入了稳定期，说明菌株Ｐ１．１易于培养。处于稳定期的时间／ｈ图３．１菌株Ｐ１．１的生长曲线Ｆｉｇ．３—１ＧｒｏｗｔｈｃｕｒＶｅＯｆｓｔｒａｉｎＰｌ－１微生物代谢活力虽然与对数生长期相比要差一些，但是还有相当不错的代谢活力，并且去除有机物的效果也相对要好。稳定期最大特点是体内积累了大量贮存物，像异染颗粒、粘液层、聚一Ｂ一羟基丁酸和荚膜等，同时强化了微生物的生物吸附能力，并且自我絮凝、聚合能力强，在后续处理中出水水质也不错【３１。因此选择１８小时作为本试验中该菌株的活化时间。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究３．４．２ｐＨ影晌以ｐＨ为横坐标，以菌株Ｐ１—１在富磷培养基中培养２４ｈ后的∞卯ｌ，为纵坐标，如图３—２所示，考察了ｐＨ对该菌株生长的影响。从图３－２可得，菌株Ｐ１．１适合生长在中性或者偏碱性的环境中，在酸性环境中不适合该菌株生长。在ｐＨ＝８．０时菌株生长最好。ｐＨ图３－２不同ｐＨ对菌株Ｐ１．１生长的影响Ｆｉｇ．３—２Ｔｈｅｅｆ＆ｃｔｏｆｄｉｆｋＩ．ｅｎｔｐＨｏｎｓｔｒａｉｎＰｌ—ｌ９１．ｏｗｔｈ以ｐＨ为横坐标，以富磷培养基中菌株Ｐ１一ｌ培养２４ｈ后的除磷率和脱氮率为纵坐标，如图３－３所示，考察了不同ｐＨ对该菌株的除磷效果和脱氮效果的影响。有图３．３可得，菌株Ｐ１．１在中性或者偏碱性环境中除磷率和脱氮率都达到较高水平，尤其在ｐＨ＝７．０时该菌株的除磷率为７２．１％，脱氮率为９１．６％。零＼瓣溪葵餐静攀淡ｐＨ图３．３不同ｐＨ对菌株脱氮除磷效果的影响Ｆｉｇ．３．３Ｔｈｅｅｆｆ亡ｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨＯｎｓｔｒａｉｎＰ１—１ｎｉｔｒＯｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏＶａｌ综合考虑菌株的生长和脱氮除磷效果所需的ｐＨ条件，选择ｐＨ７．０作为今后菌株Ｐ１—１的培养条件。３．４．３温度影响８‘ｏＱｏ温度，℃图３－４温度对菌株Ｐ１．１生长的影响Ｆｉｇ．３．４ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｓｔｒａｉｎＰ１－１ｇｒｏｗｔｈ３６东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究以温度作为横坐标，以菌株Ｐ１．１在富磷培养基中培养２４ｈ后的∞删为纵坐标，如图３．４，考察了温度对菌株Ｐ１．１生长的影响。从图３—４可得，菌株Ｐ１一ｌ在１５～３５℃生长较好，在４０℃菌株不能生长，而该菌株最佳生长温度为３０℃。以温度为横坐标，以富磷培养基中菌株Ｐ１．１培养２４ｈ后的除磷率和脱氮率为纵坐标，如图３．５所示，考察了不同温度对该菌株的除磷效果和脱氮效果的影零瓣憾婆餐辩誉鳞温度／℃图３－５温度对菌株Ｐ１．１脱氮除磷效果的影响Ｆｉｇ．３－５ＴｈｅｅｆｋｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｌｌｒｅｏｎｓｔａｉｌＩＰ１－１ｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏｖａｌ响。有图３—５可得，温度１５．３５℃时，菌株Ｐ１．１表现出较好的除磷效果和脱氮效果，而在３０℃时效果最好，除磷率达到７３％，脱氮率达到９２．８％。综合考虑菌株的生长与脱氮除磷效果，选取３０℃作为菌株Ｐｌ一１的最佳培养温度。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究３．４．４接种量影响８∞Ｑｏ接种量／％图３．６接种量对菌株Ｐ１．１生长的影响Ｆｉｇ．３—６ＴｈｅｅｆｋｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎａｍｏｕｎｔｏｎｓｔｒａｉｌＩＰ１－１ｇｒｏｗｔｈ零、瓣酶鎏镫瓣蓬筮接种遂／％图３．７接种量对菌株Ｐ１一ｌ脱氮除磷效果的影响Ｆｉｇ．３－７Ｔｈｅｅｆ．ｆｅｃｔＯｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎａｍｏｕｎｔｏｎｓｔｒａｉｎＰ１—１ｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏＶａｌ由于在恒温培养箱中，处于静止状态，延滞期相对较长，而接种量的多少也影响了延滞期的长短。以接种量为横坐标，以菌株Ｐ１．１在富磷培养基中培养２４ｈ后的∞黝为纵坐标，如图３—６，考察了接种量对菌株Ｐ１—１生长的影响。有图３．６东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究可得，菌株Ｐ１．１在接种量＞＝１０％以上生长效果较好。以接种量为横坐标，以富磷培养基中菌株Ｐ１．１培养２４ｈ后的除磷率和脱氮率为纵坐标，如图３．７所示，考察了不同接种量对该菌株的除磷效果和脱氮效果的影响。在接种量为１０％时，菌株Ｐ１．１的除磷率和脱氮率效果最佳，除磷率到达７２．６％，脱氮率到达９２．１％。３．４．５摇床转速影响以摇床转速为横坐标，以菌株Ｐ１—１在富磷培养基中培养２４ｈ后的∞删为纵坐标，如图３．８，考察了摇床转速对菌株Ｐ１．１生长的影响。有图３—８可得，菌株Ｐ１．１经过２４小时的培养，在摇床转速Ｏ～１４０ｒ／ｍｉｎ时，菌株Ｐ１．１的生长量随着摇床转速的增加而增加。而当摇床转速到达１８０ｒ／ｍｉｎ时，菌株的生长量反而比在１４０ｒ／ｍｉｎ时要低。据报道，反硝化聚磷菌是兼性厌氧菌，对所需的溶解氧可能要求不是很高，溶解氧越高，反硝化聚磷菌的生长不一定越好，本试验的结果也符合了相关报道【３Ｊ。摇床转速／ｒ・ｍｉｎ－１图３．８摇床转速对菌株Ｐ１．１生长的影响Ｆｉｇ．３—８ＴｈｅｅｆｌｌｅｃｔｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｅｄＯｎｓｔａｉｎＰｌ－１ｇｒｏｗｔｈ东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究零瓣慈娃÷ｏ芸锰瓣蕊婚图３－９摇床转速对菌株Ｐ１．１脱氮除磷效果的影响Ｆｉｇ．３－９Ｔｈｅｅｆ．ｆｅｃｔｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｅｄｏｎｓｔｒａｉｎＰｌ—ｌｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏＶａｌ以摇床转速为横坐标，以富磷培养基中菌株Ｐ１．１培养２４ｈ后的除磷率和脱氮率为纵坐标，如图３．９所示，考察了不同摇床转速对该菌株的除磷效果和脱氮效果的影响。有图３．９可得，菌株Ｐ１—１的除磷率基本随着摇床转速的提高而提高，而脱氮率随着摇床转速的提高反而有所下降，这是因为当摇床转速提高时体系中的溶解氧会增加，那么菌株利用氧进行除磷就会增加，此时利用硝态氮进行除磷就会减少，脱氮率自然就会下降。另一方面，虽然菌株Ｐ１．１既能利用氧进行除磷也能利用硝态氮进行除磷，但是利用硝态氮进行除磷的效果没有像利用氧那么好，这也与利用硝态氮除磷时可能不如利用分子氧效率高的报道相符１５４１。３．４．６碳源影响补充碳源，投加外碳源或易降解碳源是解决脱氮除磷系统中碳源问题的方法之一【５引。本试验通过研究发现，模拟生活废水中碳源的含量对菌株生长和脱氮除磷都有影响，试验还得出了菌株在处理模拟生活时所需的最低碳源浓度，为今后的废水处理提供了一定的理论支持。由图３．１０可得，在接种量１０％、温度３０℃、ｐＨ７．０条件下，密闭环境中恒温静止２４小时，菌株Ｐ１．１需要乙酸钠１０００ｍ∥Ｌ才能有良好的生长和较好的脱氮除磷效果，而在１０００ｍｇ／Ｌ以上菌株的生长和脱氮除磷效果基本没有再提高。４００恩ＯＯＯ７∞Ｏ６Ｏ５∞Ｏ４◇３如ｎ２幻醪纛胬媾墓越器＼零ｃ；１良ＯＯ乙酸钠浓度／ｍｇ・ｒ图３—１０．不同乙酸钠浓度对菌株Ｐ１．１的生长及脱氮除磷影响Ｆｉｇ．３－１０ＴｈｅｅＩ！ｆ．ｅｃｔｓｏｆｄｉｆｋｒｅｎｔｃＨ３ｃｏｏＮａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｓｔｒａｉｌｌＰ１．１ｇｒｏｗｔｈａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍＯｖａｌａ：彻跏ｂ：除磷率ｃ：脱氮率３．４．７不同初始磷酸盐磷浓度影响謇Ｑｏ时间／ｈ图３一ｌｌ不同初始浓度磷对菌株Ｐ１．１生长的影响Ｆｉｇ３－１１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｌｌｉｔｉａｌＰｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｓｔｒａｉｎＰ１．１ｇｒｏｗｔｈ４１东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究从图３—１１中可以看出，当培养基中没有Ｐ存在时，菌株经过２４小时的培养，基本没有生长或者生长很缓慢，这说明菌株Ｐ１．１的生长时需要一定的磷。而当培养基中Ｐ的浓度达到６ｍ∥Ｌ及以上时，菌株都能较好得生长，而经过２４小时以后含有高浓度Ｐ的培养基和含有低浓度Ｐ的培养基他们的ＤＤ删都在１．０左右，这表明此时菌株的生长可能受到了培养基中碳源和微量元素不足的限制。有图３．１２可得，在磷浓度为６ｍ∥Ｌ、９ｍ∥Ｌ、１２ｍ∥Ｌ时，菌株Ｐ１．１经过２４小时的培养，磷的去除率都达到９０％以上。在磷浓度为１５ｍ∥Ｌ、１８ｍ∥Ｌ、２１ｍ∥Ｌ时，菌２４２０＿Ｊ西１６Ｅ’、、越１２避篓８篷ｄ楚ｑ时间／ｈ图３．１２．不同初始浓度磷的去除过程Ｆｉｇ．３・１２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｉｔｉａｌＰｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏＶａｌ株Ｐ１．１经过２４小时的培养，磷的去除率分别为８５．３％、７１．４％、５９．７％，这说明菌株Ｐ１．１在Ｐ浓度较高的条件下，对磷也有较好的去除。对比图３－１ｌ和图３－１２可以看出，１２小时以后菌株生长进入对数期，而１２小时以后菌株除磷速度明显加快，这表现了菌株的生长与除磷过程具有一定的同步性。４２东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究３．４．８不同初始磷酸盐磷浓度下菌株Ｐ１．１的动力学研究动力学研究可以优化生化处理的工艺条件及调控方式，并通过建立相应的降解动力学模型，模拟最适当的工艺流程和工艺参数，预测微生物降解废水的趋势【５７１。在生物降解系统中，应用最广泛的基质降解动力学模式为Ｍｏｎｏｄ方程［５８１，底物浓度（Ｃ）和时间（ｔ）的关系如下：Ｃ＝‰什ＡｌｎＣ＝Ｋ】ｔ＋Ｂ（１）零级反应方程（２）一级反应方程Ａ、Ｂ为常数。式中：Ｋｏ和Ｋ１分别为零级和一级降解速率常数；利用这两种方程形式分别对图３．１２中初始Ｐ浓度（Ｃ）为６ｍ∥Ｌ～２１ｍ∥Ｌ随时间变化的数据进行拟合。结果表明菌株Ｐ１—１除磷率按照Ｍｏｎｏｄ方程，表观上与零级反应方程吻合较好，拟合方程及相关系数见表３．２。由表３．２可以看出，用Ｍｏｎｏｄ零级反应方程拟合具有较高的相关性，说明零级反应方程能够较好地描述该浓度下磷酸盐磷的去除过程，即磷酸盐磷能以较为恒定的速率被除去。表３．２菌株Ｐｌ一１除磷的动力学方程Ｔｈｂｌｅ３—２ＦｉｔｔｉｎｇｄｙｎａｍｉｃｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎＰｌ一１ｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏｖａｌ初始浓度／（ｍｇ・Ｌ－１）６动力学方程ｃ＝．０．２８０ｔ＋６．２５５速率常数／（ｍｇ・Ｌ～．ｈＪ）相关系数Ｒ２Ｏ．２８０Ｏ．９６７９１２ｌ５１８２１ｃ＝一０．３９４ｔ＋９．５８３ｃ＝一０．５１９ｔ＋１３．０９０ｃ＝一０．５４８ｔ＋１６．５７０ｃ＝一Ｏ．５４２ｔ＋１８．９００ｃ＝一Ｏ．５５４ｔ＋２２．５１０Ｏ．３９４Ｏ．５１９Ｏ．５４８０．５４２Ｏ．５５４Ｏ．９８８Ｏ．９７４Ｏ．９３２０．９７６０．９３５４３东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究３．５本章小结本章主要到筛选到的反硝化聚磷菌Ｐ１．１进行生长特性和脱氮除磷效果的研究。首先从生长曲线的测定，找出菌株Ｐ１．１最佳的活化时间，接着又从ｐＨ、温度、接种量、摇床转速和碳源等五个方面考察这些因素对菌株Ｐ１．１生长和脱氮除磷的影响。根据培养体系中初始磷酸盐磷浓度的不同，考察了磷酸盐磷对菌株生长和除磷效果的影响，同时进行了菌株Ｐ１—１对磷酸盐磷的动力学研究。试验结果如下：（１）菌株Ｐ１．１在牛肉膏蛋白胨培养基中４小时开始进入对数期，１６小时左右开始进入对数生长期，因此选择１８小时作为该菌株活化时间。（２）综合考察菌株Ｐ１．１的生长和脱氮除磷效果，选择ｐＨ７．Ｏ、温度３０℃和接种量１０％作为菌株的最佳培养条件。（３）由于反硝化聚磷菌Ｐ１．１既能利用氧进行除磷也能利用硝态氮进行除磷，因此摇床转速的不同对除磷率和脱氮率产生不同的影响；在静止条件下，菌株Ｐ１．１的脱氮率最好，达到９２．６％，而在１４０ｒ／ｍｉｎ条件下，菌株Ｐ１．１的除磷率最高，到达９８．９％；同时菌株Ｐ１一ｌ生长最好时摇床转速为１４０ｒ／ｍｉｎ（４）在接种量１０％、温度３０℃、ｐＨ７．０条件下，密闭环境中恒温静止２４小时，菌株Ｐ１．１需要乙酸钠１０００ｍ∥Ｌ才能有良好的生长和较好的脱氮除磷效果。（５）菌株生长需要一定的磷酸盐磷；用Ｍｏｎｏｄ零级反应方程拟合具有较高的相关性，说明零级反应方程能够较好地描述该浓度下磷酸盐磷的去除过程，即磷酸盐磷能以较为恒定的速率被除去。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究第四章反硝化聚磷菌Ｐ１．１的固定化研究微生物修复是指利用优势菌来降解或转化污染物从而达到去除污染物的目的，但是关于游离菌群的应用，出现了一些不足之处，比如菌体容易流失、与土著菌竞争处于弱势、单位体积内有效菌浓度偏低、抗侵害能力差等。２０世纪７０年代以来，水污染问题日益严重，固定化微生物技术的开发与应用引起了人们的普遍关注。固定化微生物技术是利用物理或化学的手段与方法将游离菌限制在某一特定的空间范围内，并且使菌株保留它固有的催化活性，而且可以被重复和连续使用的一种现代生物工程技术。固定化微生物技术的优点是快速、高效、污泥产量少、微生物密度高和耐受性强等。现在这项技术已经越来越多的被用于水处理领域。但是在实际的应用中，已有的固定化方法都有各自的局限性，所以固定化方法的选择很关键。４．１试验材料（１）试验菌株：第二章中筛选保存的反硝化菌聚磷菌株Ｐ１．１；（２）包埋剂：海藻酸钠、聚乙烯醇（聚合度为１７５０±５０）；（３）无机载体：沸石（６０～８０目）；（４）交联剂：质量分数为４％的氯化钙饱和硼酸溶液（ｐＨ＝７．０）；（５）牛肉膏蛋白胨培养基（Ｌ．１）：牛肉膏５７．Ｏ；作为菌株活化培养基；１２１℃灭菌２０ｇ、ＮａＣｌ５９、蛋白胨１０ｇ，ｐＨ值为ｍｉｎ。（６）富磷培养基（Ｌ。１）【４７、４８】：３．３２９ＣＨ３ＣＯＯＮａ－３Ｈ２０、４３２．８５ｍｇＫＮ０３、３０５．５２ｍｇＮＨ４Ｃ１、２５ｍｇＫＨ２Ｐ０４、２５．６８ｍｇＣａＣｌ２‘２Ｈ２０、９１．２６ｍｇＭｇＳ０４・７Ｈ２０、８．５９ＰＩＰＥＳ缓冲液和２ｍＬ的微量元素，ｐＨ７．０；作为模拟生活废水。（７）微量元素溶液（Ｌ。１）［４７、４８】：５９ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、５９ＥＤＴＡ、１．６９ＣｕＳ０４．５Ｈ２０、５９ＭｎＣｌ２．４Ｈ２０、５０ｍｇＨ３８０３、５０ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍ０７０２４‘４Ｈ２０、１０ｍｇＫＩ和５０ｍｇＣｏＣｌ，・６Ｈ，Ｏ。４．２试验方法东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究４．２．１菌株Ｐ１—１活化及固定化微生物颗粒的制备将菌株Ｐ１—１接入２５０ｍＬ装有１００ｍＬ牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，３０℃，１４０ｒ／ｍｉｎ培养１８ｈ（培养后的∞删＝１．４０±Ｏ．１０）。１８ｈ后，取锥形瓶中的培养液５０ｍＬ在低温冷冻离心机中１×１０４ｒ／ｍｉｎ下离心２ｍｉｎ，去除上清液，用无菌水洗涤菌体沉淀并离心两次，最后浓缩收集菌体至５ｍＬ备用。用海藻酸钠和聚乙烯醇同时作为包埋载体，添加一定量的沸石作为吸附剂，使微生物的固定化作用同时具有包埋和吸附的双重特点。将聚乙烯醇、海藻酸钠分别加入到９０℃的水中，充分搅拌混匀后制成２０ｍＬ含有一定量的聚乙烯醇和海藻酸钠的包埋液，用水浴锅将包埋液控制在３５℃。另一方面，用少量的沸石吸附的浓缩菌液５ｍＬ，然后将包埋液和沸石吸附的浓缩菌液混和均匀，为使制成的固定化小球颗粒均匀，包埋液和沸石吸附的浓缩菌液的混合液通过一次性注射器要按照一定速度滴入６０ｍＬ交联剂中。其中交联剂是由４％氯化钙和饱和硼酸组成的，ｐＨ要预先调至７．Ｏ。交联固定一定时间以后，使之形成直径较为均匀的小球，用生理盐水冲洗２～３次后并于４℃保存备用。４．２．２固定化微生物小球的质量评价本试验主要从物理特性和化学效能两方面来评价固定化微生物小球的质量。其中物理特性主要考察固定化小球成球的难易程度、成球后的粘连状况、固定化小球弹性以及稳定性这四个方面，而化学效能主要考察了固定化微生物小球的除磷能力。４．２．２．１固定化微生物小球的物理特性和化学效能评价表４．１固定化小球制备过程中各因素对小球物理特性的影响１■ｂ．４．１Ｔｈｅｅｆｆｌｅｃｔｏｆｄｉｆｆｂｒｅｎｔｆａｃｔｏｒｓｏｎｔｈｅｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｉｍｍｏｂｎｉｚｅｄｇｒａｎｕｌｅｓ试验编号影响因素海藻酸钠浓度／％ＰＶＡ浓度／％８６、８、１０沸石浓度／％２２２、３、４Ｖ交联时间／１１１８１８ｌ２３４海藻酸钠浓度ＰＶＡ浓度沸石浓度交联时间ｌ、２、３童童膏★★１８１２、１８、２４注ａ：试验按照１至４顺序进行，２、３、４中的“专”表示固定化小球物理特性相对较好好时海藻酸钠的浓度；３、４中的“★”表示同定化小球物理特性相对较好时ＰｖＡ的浓度；４中的“Ｖ”表示固定化小球物理特性较好时沸石的浓度。４６东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究研究固定化微生物小球制备方法中各因素（如海藻酸钠浓度、ＰＶＡ浓度、沸石浓度和交联时间）对小球物理特性的影响，如表４．１所示，评价指标包括小球成球难易、成球后粘连状况、固定化小球弹性以及稳定性。设计正交试验，采用四因素三水平的正交表进行试验，试验中选取的四个因素分别为浓缩菌液（ｍＬ）、海藻酸钠浓度（％）、聚乙烯醇的浓度（％）和沸石浓度（％）。将这九组不同配方制成的小球各取５ｍＬ放置于５０ｍＬ模拟生活废水中，３０℃、１４０ｒ／ｍｉｎ，培养２４ｈ后测定磷酸盐磷浓度变化，计算磷酸盐磷的去除率。采用常规的数理统计方法进行数据处理，分析各个因素对菌株除磷效果的影响程度，并确定使磷酸盐磷的去除率达到最高时的各因素水平，见表４．２。评价固定化小球质量要从以下四个物理指标出发：（１）固定化小球成球难易程度，是指固定化小球是否容易形成大小一致的球状，是否出现拖尾现象；（２）固定化小球粘连状况，是指固定化小球在滴入交联剂以后是否迅速发生固定化，并且颗粒之间不易形成粘连现象为佳；（３）固定化小球弹性，指挤压固定化小球以后可以到恢复原状并且恢复速度较快：（４）固定化小球稳定性是指将固定化小球置于无菌水中，３０℃、１４叫ｍｉｎ连续振荡２４ｈ以后，固定化小球不易破碎，并且仍然能保持原状。表４．２正交试验Ｔａｂ．４．２ＴｈｅＯｒｔｌｌＯｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｌｎｅｎｔ因素水平浓缩茵液海藻酸钠浓度聚乙烯醇的浓度沸石浓度｜硒Ｌ｜‰｜％｜％１２３１３５０．５１．Ｏ１．５６０１２８１０４．２．３盐度与重金属对游离菌体和固定化菌体除磷能力的影晌在废水处理过程中应用固定化技术，有效菌菌株经过包埋固定以后，不仅可以保持系统中较高的生物浓度，而且也可以提高菌体抵御外部环境的能力。曹桂萍等【５９】在研究中发现，适当的包埋载体可以为微生物提供了一个良好的生存环境，而且还可以帮助反硝化聚磷菌提高抵御高盐度和重金属铬的能力，并保持较强的除磷能力。因此，将研究固定化技术对于反硝化聚磷菌的应用很有推动作用。４７东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究４．２．３．１盐度对游离菌和固定化菌体除磷效果的影响工业废水往往含盐量较高，其中无机盐主要是指ＮａＣｌ和Ｎａ２Ｓ０４，含量可以高达１５％～２０％【６…。盐度会影响细胞的渗透压，当盐度过低或过高时都会抑制微生物对营养物质的吸收。生化处理高盐度工业废水往往比较困难，容易造成微生物大批死亡、出水悬浮物增加、污泥解体等现象【６卜６２Ｊ。配制Ｎａｃｌ浓度分别为０．５％、１％、２％、４％、６％、８％的模拟生活废水，分别加入活化的游离菌体和包埋等量活化菌的固定化菌体，稳定运行２４ｈ以后取样分析这两种菌体的除磷效果。４．２．３．２Ｃｕ２＋对游离菌和固定化菌体除磷效果的影响外界环境因素会影响微生物的生长以及污水处理的效果，其中一个比较重要的因素是重金属元素。在污水当中，重金属污染主要是指铜、锌、镉、铅和汞等【６３、矧。在张恩栋等［６５］研究中发现，低浓度的铜是生物生长必须的微量元素，但是高浓度的铜就会对生物产生毒害作用。李川等【６６】也在研究中发现，铜会抑制小球藻的除氮能力，尤其对那些悬浮态的小球藻来说，其除氮能力被较大的抑制，而对那些被固定化处理后的小球藻来说，固定化处理一定程度上减弱了铜对其除氮能力的影响。本试验配制成Ｃｕ２＋浓度分别为ｏ．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１３ｍｍ０１／Ｌ、４ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍ０１／Ｌ、ｍｍ０１／Ｌ的模拟生活废水，分别加入活化的游离菌体和包埋等量活化菌的固定化菌体，稳定运行２４ｈ以后取样分析两种菌体的除磷效果。４－３试验结果与分析４．３．１固定化微生物小球的物理特性评价影响固定化小球质量的因素有很多，试验中首先考虑小球制备的配方，通过优化配方来提高小球的质量。以下为主要的试验结果：４．３．１．１海藻酸钠的浓度对固定化小球物理特性的影响表４．３海藻酸钠浓度对固定化小球质量的影响１’ａｂ．４．３ＴｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｔｈｅｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒａｎｕｌｅｓｏｎｔｈｅｑｕａⅡｔｙｏｆ廿ｌｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ编号ｌ２海藻酸钠浓度／％１２３成球难易易粘连状况不易一般一般弹性好好一般稳定性好好一般一般不易３结果表明见表４．３，海藻酸钠的浓度与小球的粘连状况、成球难易有一定关４８东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究系。如果试验中添加含量较高的海藻酸钠，小球的粘连状况会比较严重并且不容易形成小球。这个试验表明海藻酸钠的浓度对固定化小球的物理特性有影响，今后选取１％左右作为海藻酸钠的试验浓度。４．３．１．２ＰＶＡ浓度对固定化小球物理特性的影响表４．４ＰｖＡ浓度对固定化小球质量的影响ｏｎ１１ａｂｌｅ４．４ＴｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｔｈｅｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｈｅｑｕａＫｔｙｏｆｔｈｅｉｍｍＯｂｉｌｉｚｅｄｇｒａｎｕｌｅｓ编号１２３ＰＶＡ浓度／％６成球难易易易易粘连状况一般不易不易弹性一般一般好稳定性好好好８１０试验结果见表４．４。当ＰＶＡ浓度为１０％时，固定化小球容易形成球状，并且没有粘连现象出现，弹性也较好。但是据报道如果再增加ＰＶＡ的浓度，ＰＶＡ胶体的粘度就会随之增大，同时会使微生物的代谢产物扩散以及氧气传递都受到不同程度的影响，进而来影响细胞活性【６‘”。４．３．１．３沸石浓度对固定化小球物理特性的影响结果见表４．５，添加沸石可能会影响固定化小球的成球难易、粘连状况以及弹性。当沸石含量较多时，不容易形成小球，弹性也会比较差。当沸石含量相对较小时，容易形成小球，弹性也比较好。所以，经过综合考虑，试验选择沸石浓度为２％以下作为适宜的浓度。表４．５不同沸石浓度对固定化小球质量的影响ＴＩａｂｌｅ４．５ＴｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｔｈｅｚｅｏｌｉｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｑｕａＨ够ｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｎｉｚｅｄｇｒａｎｕｌｅｓ编号１２３沸石浓度／％２成球难易易一般不易粘连状况不易不易一般弹性好一般不好稳定性好好一般３４４．３．１．４交联时间对固定化颗粒的影响交联时问的长短会在一定程度上影响固定化小球的稳定性。当交联时间是１８ｈ的时候，固定化小球的物理特性相对较好，试验结果如表４．５。因此试验采４９东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究用１８ｈ作为试验的交联时间。表４．６交联时间对固定化小球质量的影响ＴＡｂｌｅ４．６ＴｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｃｒｏｓｓＵｎｌ‘ｉｎｇｔｉｍｅｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｎｉｚｅｄｇｒａｎｕｌｅｓ编号１２３交联时间／ｈ１２１８２４成球难易易易易粘连状况不易不易不易弹性好好好稳定性一般好好４．３．２正交试验结果表４．７正交试验与结果Ｔｈｂｌｅ４．７ＴｈｅｏｒｔｈｏｇＯｎａＩｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｕｌｔｓ因素浓缩菌液／ｍＬ聚乙烯醇／％６８海藻酸钠／％Ｏ．５沸石浓度／％０●２２除磷率／％５４．９８６０８２２６７实验１实验２实验３实验４实验５实验６实验７实验８实验９ＫＤｌＫＤ２ＫＤ３ＲＤ１。。３３３５５ｍＯ５Ｏ５５ｍ６Ｏ●０３引曰＆匀臼６３ｌ６８８６８９８加６８５，２１５幻，一５５５锨飧１，眠３７．２ｍ㈨㈣伽１．６Ｊ６０＆ｎ７６王９５．４Ｍ加”吣”晒加邮㈨眦Ｋ１．４注ａ：Ｉ①和ＲＤ分别为同一因素除磷率平均值和除磷率极差。Ｎｏｔｅａ：ＫＤａｎｄＲＤｍｅａｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙａｖｅｒａｇｅａｎｄｒａｎｇｅｏｆｐｈｏｓｐｈｏｌｌｌｓｒｅｍｏＶａｌｒａｔｅａｔｅａｃｈｆ－ａｃｔｏＬ运用Ｌ９（３４）进行正交实验的过程中，按表４—７制备９组固定化小球，每组平行制备２份，其中一份包埋富集的反硝化聚磷菌Ｐ１－１，另一份不包埋反硝化聚５０东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究磷菌Ｐ１－１，在扣除小球载体吸附除磷的空白值后，求得每组固定化小球除磷率。包埋条件的正交实验结果见表４．７。黼６４∞６２弱卯６０！。萎５８鏊５６嫌５４５２５０式》嚣簦藩～∞筠∞浓缩蕊滚，ｍＬ海藻酸钠浓度，％聚乙烯薛浓腹，％灞彳ｉ浓度，％图４．１四因素趋势图Ｆｉｇ．４．１ＴｈｅｔｒｅｎｄｇｒａｐｈｓｏｆｆｉＤｕｒｆａｃｔｏｒｓ由正交试验结果表４．７和图４．１的趋势分析可知：（１）各因素最优水平分别是浓缩菌液５ｍＬ，海藻酸钠浓度是１．Ｏ％，聚乙烯醇浓度为１０％，沸石浓度２％。（２）根据极差大小分析可知，影响固定化菌体除磷率的各因素作用大小顺序依次是：浓缩菌液量＞沸石浓度＞聚乙烯醇浓度＞海藻酸钠浓度东华大学硕二Ｅ学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究图４．２固定化茵体Ｐ１．１颗粒Ｆｉｇ．４．２ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｇｒａｎｕｌｅｓｏｆｓｔｒａｉｎＰ１—１参照以上结果，选取浓缩菌液５ｍＬ，海藻酸钠浓度是１．０％，聚乙烯醇浓度为１０％，沸石浓度２％以及固定１８小时作为固定化菌体制备的配方，制成的固定化小球如图４．２。４．３．３盐度与重金属对游离菌体和固定化菌体除磷能力的影响４．３．３．１盐度对游离菌和固定化菌体除磷效果的影响以ＮａＣｌ浓度为横坐标，以培养２４ｈ后游离菌体和固定化菌体的除磷率为纵坐标，如图４—３所示，考察了ＮａＣｌ浓度对游离菌体和固定化菌体除磷效率的影响。有图４．３可得，在低浓度（２％以下）条件下，对游离菌体和固定化菌体的除磷率影响较小，而在高浓度（４％及其以上）条件下，游离菌体的除磷效果基本没有，相对于游离菌体，固定化菌体还表现出一定的除磷效果，说明本试验所用的固定化技术在高盐度废水中可能有一定的应用前景。１００８０琴－’、．６０憾蕊篮２０ＯＮａＣＩ浓度／％图４－３ＮａＣｌ浓度对游离菌体和固定化菌体除磷效果的影响Ｆｉｇ・４－３Ｔｈｅｅ仃ｅｃｔｏｆＮａＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏ川ｓｒｅｍｏｖａｌｂｙｆｒｅｅｃｅｌｌｓａｎｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｅｌｌｓ４．３．３．２重金属对游离菌体和固定化菌体除磷能力的影响阳Ｄ∞Ｏ∞０∞Ｏ∞０零．／博鼙餐扣０他Ｑ。ＤＣｕ２＋浓度／ｍｍ０１．Ｌ‘１图４－４ｃｕ２＋浓度对游离菌体和固定化菌体除磷效果的影响Ｆｉｇ．４－４ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＣｕ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｌｌｌｓｒｅｍｏｖａｌｂｙｆｒｅｅｃｅｌｌｓａｎｄｉｍｍｏｂｉＨｚｅｄｃｅ¨ｓ５３东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究微量的铜元素存在，有利于微生物的生长，而高浓度的铜元素的存在会抑制菌株的生长，同时也影响了菌株的降解效果。以ｃｕ２＋浓度为横坐标，以培养２４ｈ后游离菌体和固定化菌体的除磷率为纵坐标，如图４．４所示，考察了Ｃｕ２＋浓度对游离菌体和固定化菌体除磷效果的影响。有图４—４可得，Ｃ∥＋浓度达到０．５ｍｍ０１／Ｌ以上，游离菌体的除磷效果就明显下降，而当Ｃｕ’２＋浓度到达２ｍｍ０１／Ｌ时，游离菌体已经基本没有除磷效果。另一方面，在Ｃｕ２＋浓度Ｏ．５～１．０ｍｍ０１／Ｌ时，固定化菌体表现出较好的除磷效果，而当Ｃｕ２＋浓度到达２～８ｍｍ０１／Ｌ时，固定化菌体的除磷效果有所下降。总之，从图４—４可得，在不同Ｃｕ２＋浓度条件下，固定化菌体比游离菌体表现出更好的除磷效果。４．４本章小结本章试验用沸石吸附以反硝化聚磷菌Ｐ１．１后，再用聚乙烯醇和海藻酸钠作为包埋剂，用４％氯化钙和饱和硼酸作为交联剂，使微生物固定化具有吸附和包埋双重特性。制成的固定化微生物小球，以物理特性和化学效能（除磷率）作为主要指标，确定固定化制备的最佳条件，为今后固定化微生物小球的除磷工艺研究奠定一定的基础。通过本章试验，在２０ｍＬ体系中，选取浓缩菌液５ｍＬ，海藻酸钠浓度是１．Ｏ％，聚乙烯醇浓度为１０％，沸石浓度２％以及固定１８小时作为固定化的最佳条件。同时研究了ＮａＣｌ浓度和ｃｕ２＋对游离菌株和固定化菌体除磷效果的影响，结果反映出固定化菌体比游离菌体更具有耐受性，更稳定。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究第五章反硝化聚磷茵Ｐ１．１在模拟反应器中的脱氮除磷效果研究把试验中筛选到的反硝化聚磷菌Ｐ１．１用未固定化和固定化的两种方式在模拟反应器中处理合成废水。５．１试验材料与仪器牛肉膏蛋白胨培养基（Ｌ’１）：牛肉膏５作为活化培养基；１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。模拟废水配方（Ｌ－１）：２９ＣＨ３ＣＯｏＮａ・３Ｈ２０、５０ｍｇＫＨ２Ｐ０４、３００ｍｇＮＨ４Ｃ１、ｇ、ＮａＣｌ５９、蛋白胨１０ｇ，ｐＨ值为７．Ｏ；９０ｍｇＭｇＳ０４‘７Ｈ２０、３０ｍｇＣａＣｌ２’２Ｈ２０、４３０ｍｇＫＮ０３和２ｍＬ的微量元素，ｐＨ７．Ｏ；微量元素溶液（Ｌ。１）№６７１：５９ＥＤＴＡ、５９ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、１．６９ＣｕＳ０４・５Ｈ２０、５９Ｈ３８０３、１０ｍｇＭｎＣｌ２‘４Ｈ２０、５０ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍ０７０２４．４Ｈ２０、５０ｍｇＣＯＣｌ２‘６Ｈ２０。ＫＩ和５０ｍｇ仪器：２Ｌ大烧杯、小型潜水泵（创星ＡＩＴ－３０１，２３０Ｌ／１１）、ＨＩＴＡＣＨＩＵ．２９１０型紫外可见分光光度计、雷磁ＰＨＳ．３Ｃ型ｐＨ计。５．２模拟反应器中游离菌体处理模拟废水时的脱氮除磷效果取筛选保存的反硝化聚磷菌Ｐ１．１，先用牛肉膏蛋白胨培养基活化１８小时后，取５０ｍＬ活化液，在高速冷冻离心机中１×１０４ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，倒去上清液，用无菌水洗涤菌体两次，然后将菌液导入装有２Ｌ合成废水的大烧杯中，并用小型潜水泵使液体不断循环流动，如图５．１所示。在整个试验中，每隔２小时取一次少量水样，放入４℃冰箱中保存待测（刚开始试验时的水样也要保存），过２４小时以后，将１３个水样用紫外可见分光光度计分别测出ＤＤ卯Ｄ、磷酸盐磷和硝酸盐氮浓度，将测定结果记录在图５．２和图５．３。有图５．２，菌株Ｐ１—１在前６小时生长缓慢，而进入８小时以后，该菌株生长速度开始加快，到２０小时以后，系统中的生物量就维持在一定水平。有图５．３可得，菌株Ｐ１．１在前六小时的除磷和脱氮速率比不快，说明菌株还处在适应期，随着菌株的生长速度加快，脱氮除东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究图５．１游离菌体的模拟反应装置ｒｅａｃｔｏｒＦｉｇ．５－１ＦｒｅｅｃｅＵｓｉｎｓｉｍｕｌａｎｔ磷速率也开始加快，过了２０小时以后，体系中的磷酸盐磷和硝酸盐氮都不在改变，这与菌株进入稳定期和衰亡期有关。从图５．２和图５－３可以看出，菌株Ｐ１—１的脱氮除磷效果与其生长速率具有一定的同步性。ｎ８０７Ｏ６Ｏ５０４Ｏ３Ｏ２０１ＯＯＯ２４６８１Ｏ１２１４１６１８２０２２２４２６时问】／ｈ图５．２模拟反应器中菌株Ｐ１．１的生长曲线Ｆｉｇ．５－２ＧｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆｓｔａｉｎＰ１－ｌｉｎｓｔｉｍｕｌａｎｔｒｅａｃｔｏｒ５６东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究伪Ｅ’、《镅漤；跫囊躁孝黧－、暑‘Ｑ漆时间／ｈ图５－３游离菌体处理模拟废水时硝酸盐氮和磷酸盐磷的变化Ｆｉｇ．５—３ｃｈａｎｇｅｏｆＮｏｉ—ＮａｎｄＰｏ；一一Ｐｉｎａｒｔｉ６ｃｉａｌｗａｓｔｅｗａｔｅｒｂｙｆｒｅｅｃｅｎｓ５．３模拟反应器中固定化菌体处理模拟废水时的脱氮除磷效果按照第四章中的方法（２０ｍＬ体系中，选取浓缩菌液５ｍＬ，海藻酸钠浓度是１．０％，聚乙烯醇浓度为１０％，沸石浓度２％以及固定１８小时作为固定化的最佳条件）制成４０ｍＬ固定化微生物小球，然后将固定化微生物颗粒投入到装有２Ｌ合成废水的大烧杯中，并用小型潜水泵使液体不断循环流动，如图５．３所示。在整个试验中，每隔２小时取一次少量水样，放入４℃冰箱中保存待测（刚开始试验时的水样也要保存一份），过２４小时以后，将１３个水样用紫外可见分光光度计分别测出磷酸盐磷和硝酸盐氮浓度，将测定结果记录在图５．４。有图５—４可得，固定化微生物颗粒在８～１６小时这个时间段脱氮除磷效果最好，而在１６小时以后体系中的磷酸盐磷和硝酸盐氮浓度基本没有变化。５７东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究图５－４固定化菌体的模拟反应装置Ｆｉｇ．５－４Ｉｍｍｏｂｎ娩ｅｄｃｅｌｌｓｉｎｓｉｍｕｌａｎｔｒｅａｃｔｏｒ熏嚣＝Ｌ・；７嚣ｉ：杖暴‘～ｊ（Ｑ叫们Ｊ／ｈ图５—５固定化菌体处理模拟废水时硝酸盐氮和磷酸盐磷的变化Ｆｉｇ．５—５ｃｈａｎｇｅｏｆＮｏｉ—ＮａｎｄＰｏ；一一ＰｉｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｗａｓｔｅｗａｔｅｒｂｙｉｍｍｏｂｉＨｚｅｄｃｅｕｓ５８东华大学硕二｝学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究５．４本章小结本章试验是利用分离筛选出来的反硝化聚磷菌Ｐ１．１对模拟反应器中的模拟废水进行处理，研究游离菌体和固定化菌体的脱氮除磷效果。试验结果表明经过２４小时的处理，固定化菌体除磷率为８６．４％，脱氮率９４％；游离菌体的除磷率为７１．４％，脱氮率为９２．２％。因此，可以得出菌株Ｐ１．１有不错的脱氮除磷效果，有一定的应用前景，同时表明本研究所采用的固定化技术在脱氮除磷工艺中应用的可行性。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究第六章结论本研究利用传统平板分离技术，结合除磷试验、反硝化产气试验以及异染颗粒和聚－Ｂ一羟基丁酸（ＰＨＢ）颗粒染色试验，从内蒙古湖泊水样中筛选出一株反硝化聚磷菌株，命名为Ｐ１．１。以该菌株为研究对象，经过形态、生理生化试验、Ｂｉｏｌｏｇ碳源利用分析以及１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析，对该菌株进行了鉴定，同时研究其生长特性、脱氮除磷特性以及进行微生物固定化研究。６．１主要结论（１）经过２４小时缺氧培养后测定Ｎ０３一．Ｎ和Ｐ０４３。．Ｐ的含量变化，发现菌株Ｐ１一ｌ除磷率达到７２．４％，脱氮率达到９１．４％。根据马放等【４７】所报道的高效反硝化聚磷菌的除磷和脱氮效果，本试验筛选到的菌株已经表现出了较好的反硝化除磷能力。（２）经过４８小时固体培养基活化后，菌株Ｐ１．１的菌落基本长成，菌落直径１～２ｍｍ，不透明，米黄色，拱顶球状，表面光滑湿润，边缘规则整齐，易挑起；显微镜和扫描电镜观察显示，菌株Ｐ１．１为短杆菌，大小０．３～Ｏ．４岬×１．２～２．Ｏ儿ｍ；通生理生化试验、Ｂｉｏｌｏｇ碳源利用分析试验以及１６ｓｒＤＮＡ试验，鉴定菌株为鉴定该菌株为荧光假单胞菌，命名为ＡＰ“如聊伽娜．∥“Ｄ陀，ｃＰ玎ｓ（３）ＲＰ“如ｍＤ，ｌ口Ｊ／７“Ｄ陀ｓｃ阴ｓｓｔｒａｉｎｓｔｒａｉｎＰ１—１。Ｐ１．１最佳生长条件为ｐＨ８．Ｏ，温度３０℃，接种量１０％，摇床转速１４叽／ｍｉｎ；最佳除磷条件为ｐＨ７．Ｏ，温度３０℃，接种量ｌＯ％，摇床转速１４洲ｍｉｎ；最佳脱氮条件：ｐＨ７．Ｏ，温度３０℃，接种量１０％，摇床转速Ｏｒ／ｍｉｎ。（４）用海藻酸钠和聚乙烯醇同时作为包埋载体，添加一定量的沸石作为吸附剂，使微生物的固定化作用同时具有包埋和吸附的双重特点。通过正交试验确定了固定化条件为５ｍＬ浓缩菌液，１．Ｏ％的海藻酸钠，１０％的聚乙烯醇，２％的沸石时菌株Ｐ１．１的除磷效果最好。在高盐度和重金属条件下，研究发现固定化菌体比游离菌体有更好的除磷效果，体现了固定化微生物更具有耐盐和耐重金属性。（５）在模拟反应器中，利用固定化菌体与游离菌体对模拟废水进行处理，２４小时后，固定化菌体除磷率为８６．４％，脱氮率９４．ｏ％；游离菌体的除磷率为７１．４％，脱氮率为９２．２％。因此，可以得出菌株Ｐ１．１有不错的脱氮除磷效果，有一定的应用前景，同时表明本研究所采用的固定化技术在脱氮除磷工艺中应用的可行性。６０东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究６．２存在不足及研究展望总的来说，本文对反硝化聚磷菌的生长条件与脱氮除磷特性进行了深入研究，同时关于反硝化聚磷菌固定化技术的应用也进行了适当探讨，为今后脱氮除磷工艺的实际应用积累了大量的理论知识与数据支持。不过，关于菌株Ｐ１．１的其他特性的研究尚未涉及，固定化应用研究也有待进一步深入，还有反硝化聚磷菌的工程应用有待实际考验。今后可以再从以下三方面进行研究：（１）在试验中发现菌株Ｐ１．１在恒温１５℃时也表现出不错的脱氮除磷特性，猜想该菌株有一定的耐低温能力，将来可以利用温度更低的培养箱进行试验。（２）虽然利用本固定化方法制成的固定化微生物小球表现出一定耐盐性与抵抗重金属的能力，但是更好的固定化方法与固定化材料有待研究发明。（３）一套利用该菌株进行高效脱氮除磷的工艺有待研究设计。东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究参考文献【１】国家环保总局．２００９年中国环境状况公报［Ｒ】．北京：中国环境科学出版社，２０１０．［２］万金保，王建永．反硝化除磷理论及运用现状［Ｊ］．水处理技术，２００８，３４（３）：７．１０．［３］李孝坤．印染废水中反硝化聚磷菌的筛选及其脱氮除磷特性的研究［Ｄ］．江苏：苏州科技学院，２００９．［４］陈华．化学沉淀法除磷和生物法除磷的比较［Ｊ］．上海环境科学，１９９７，１６（６）：３３—３５．［５］陈琳，王宝贞．废水生物处理新技术［Ｍ】．北京：中国建筑一ｆ：业出版社，２０００．［６］ＫｕｂａＴ，ＶａｎＬｏｏｓｄｒｅｃｈｔＭＣＭ，ＢｒａｎｄｓｅＦＡ，鲥订正Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｄｅｎｉｔｒｉｆ弧ｎｇｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｅｍｏＶｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｎｍｏｄｉｆｉｅｄＵＣＴ’ｔｙｐｅｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ７７７．７８６．ｒ．ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ｗａｔ．Ｒｅｓ．，１９９７，３ｌ（４）：［７］郑兴灿，李亚新．污水除磷脱氮技术［Ｍ】．北京：中国建筑：ｌ：业出版社，１９９８．【８］章非娟．生物脱氮技术【Ｍ］．北京：中国环境科学出版社，１９９２．［９］罗志腾．污染控制工程微生物学［Ｍ］．北京：北京科学技术出版社，１９８８．【１０】沈耀良，王宝贞．废水生物处理新技术一理论与应用［Ｍ】．北京：中国环境科学出版社，１９９９．【１１］周群英，高廷耀．环境工程微生物学（第二版）［Ｍ］。北京：高等教育出版社，２０００．［１２】高廷耀．城市污水生物脱氮除磷：［艺评述［Ｊ］．环境科学，１９９９，（１）：１１０一１１２．［１３］ＭｉｎｏＴ．Ｍｉｃｒｏｂｉ０１０９ｙａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓ时ｏｆｔｈｅｅｎｈａｎｃｅｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｒｅｍｏＶａｌｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．Ｗａｔ．Ｉ沁ｓ．，１９９７，（３２）：３１９３—３２０７．［１４】邹华，阮文权，陈坚．硝酸盐作为生物除磷电子受体研究［Ｊ］．环境科学研究，２００２，１５（３）：３８－４１．［１５】ＫｕｂａＴ，ＳｍｏｌｄｅｒＧ，ＶａｎＬｏｏｓｄｒｅｃｈｔＭＣＭ，甜口，．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈｏＳｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏＶａｌｆｒｏｍｗａｓｌｅ、Ｖａｔｅｒｂｙａｎａｅｒｏｂｉｃ－ａｎｏｘｉｃｓｅｑｕｅｌｌｃｉｎｇｂａｔｃｈｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｗａｔ．Ｓｃｉ．１Ｋｈ．，１９９３，２７（５－６）：２４ｌ・ｏｆ２５２．【ｌ６】ＪｏｈｗａｎＡ，ＴｏｍｏｔａｋａＤ，ＳａｔｏｓｈｉＴ，酣ａ，．Ｃｈａｒａｃｔ谢ｚａｔｉｏｎｄｅｎ确研ｎｇｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿ａｃｃｕｍ－ｕｌａｔｉＩｌｇｏ玛ａｎｉｓｍｓｃｕｌｔｉＶａｔｅｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆ．ｅｒｅｎｔｅｌｅｃ口ｏｎａｃｃ印ｔｏｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｌｌｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃ仃ｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｓｓａｙ［Ｊ】．Ｗａｔ．Ｒｅｓ．，２００２，（３６）：４０３＿４１２．【１７】ＫｕｂａＴ，、，觚ＬｏｏｓｄｒｅｃｈｔＭＣＭ，ＨｅｉｊｎｅｎＪＪ．ＰｈｏｓｐｈｏｎｌｓａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎＣＯＤｄｇｅＩＩ咖ｏＶａｌｗｉｔｈａｍｉｎｉｍａｌＴｗｏ・Ｓ１ｕ—ｒｅｑｕｉ獭ｎｅｎｔｂｙｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｎｉｔｒｉ匆ｄ印ｈｏｓｐｈａｔａｔｉｏｎａｎｄｄｅｎｉｔｒｉ６℃ａｔｉｏｎｉｎＳｙｓｔｅｍ［Ｊ］．、№ｔ．Ｉ沁ｓ．，１９９６，３０（７）：１７０２—１７１０．［１８】ＭｅｒｚｏｕｋｉＭ，Ｂ锄ｅｔＮ，ＤｅｌｇｅｎｅｓＪＰ，鲥以ＢｉｏｌｏｉｃａｌｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅｍｏＶａｌｉｎＳＢＲ：Ｅ娲ｃｔｏｆａｄｄｅｄｎｉ仃ａｔｅｃｏｎｃｅｌｌｔｒａｔｉｏｎａｎｄｓｌｕｄｇｅｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅｍＷａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，２００１，ｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅｍｏＶａｌｈＤｍ４３（３）：１９ｌ一１９４．【ｌ９】ＨａｓｃｏｅｔＭＣ，ＦｌｏｒｅｎｔｚＭ．Ｉｎｎｕｅｎｃｅｏｆｎｉｔｒａｔｅｓｏｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｗａｓｔｅ—ｗａｔｅｒ【Ｊ】．Ｗａｔ．Ｓ．Ａ．，１９８５，１ｌ（１）：２３－２６．［２０】ＧｅｒｂｅｒＡ，ＶｉｌｌｉｅｒｓＲＨ，ＭｏｓｔｅｒｔＥＳ，引口，．ＴｈｅｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｏｆｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓｕｐｔａｋｅａｎｄｒｅｌｅａｓｅａｎｄｉｔｓｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｕｔｒｉｅｎｔｒｅｍｏＶａｌｉｎ：ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｒｅｍｏＶａｌｆ－ｒｏｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒｓ［Ｍ］．ｏｘｆ’ｏｒｄ：Ｐｅ唱ａｍｏｎＰｒｅｓｓ，１９８７．ａｓｓａｙｆｏｒ［２１】ＷａｃｈｔｌｌｌｅｊｓｔｅｒＡ，ＫｕｂａＴ，ＶａｎＬｏｏｓｄｒｅｃｈｔＭＣＭ，甜口，．Ａｓｌｕｄｇｅｃｈａｒａｃｔｅ—ｚａｌｉｏｎａｅｒｏｂｉｃａｎｄｄｅｎｉ耐弭ｎｇｐｈｏｓｐｈｏｎｌｓｂｙｕｓｉｎｇｔｈｒｅｅｒｅｍｏｖｉｎｇｓｌｕｄｇｅ【Ｊ】．Ｗａｔ．Ｒｅｓ．，１９９７，３１（３）：４７１．４７８．ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ【２２］ＨｕＪＹ，ｏｎｇＳＬ，ＮｇｗＪ，酣口，．ＡｒｅＩｎｏＶａｌｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｎｚｉｎｇｔｙｐｅｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｎｂａｃｔ甜ａｄｉ虢ｒｅｎｔａｃｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｗａｔ．Ｒｅｓ．，２００３，３７：６２东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究，３４６３－３４’７１．［２３］ＶｌｅｋｋｅｏｘｙｇｅｎｏｒＧＪＦＭ，ＣｏｍｅａｕＹＯＷＫ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｒｅｍｏｖａｌｆ而ｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒｗｉｍｎｉｔｒａｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂａｔｃｈｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＥｎＶｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｅＸｐｅｒｉｅｎｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒ’ｌ９８８，９：７９１．７９６．［２４］１＇ａｋｅｓｈｉｔａＭ，ＳｏｕｄＨＦＧＤ．Ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅｏｎｃｏａｌ一ｎｒｅｄｐｌａｎｔｓ【Ｍ］．Ｌｏｎｄｏｎ：ＩＥＡＣｏａｌＲｅｓｅａｒｃｈ．１９９３．［２５］杨永哲，王蔚蔚，王磊，等．反硝化聚磷诱导过程中聚磷速率的变化特性分析［Ｊ】．砖安建筑科技大学学报，２００３，３５（３）：２５１—２５３．［２６］ＢｏｒｔｏｎｅＧ，Ｍａｒｓｉｌｉ［２７］Ｋｅｍ卜Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ１２５３．１２５５．Ｌｓ，ＴｉｌｃｈｅＡ，Ｐｆ口，．Ａｎｏｘｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｕｐｔａｋｅｉｎｔｈｅｄ印ｈａｎｏｘｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，１９９９，４０（４—５）：１７７—１８３．ＪＰ，ＭｏｇｅｎｓＨ，ＲｕｎｅＳ．Ｂｉｏｌｏ百ｃａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｒｅｌｅａｓｅａｎｄｕｐｔａｋｅｕｎｄｅｒａｌｔｅｍａｔｉｎｇａｎａｅｒｏｂｉｃａｎｄａｎｏｘｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｆｉｘｅｄ—ｆｉｌｍｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｗａｔ．Ｒｅｓ．，１９９４，２８（５）：ａｎａｅｒｏｂｉｃ／ａｎｏＸｉｃｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［２８】ＮｇＷＪ，ＯｎｇＳＬ，ＨｕＪＹ．Ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｎｌｓｒｅｍｏｖａｌｂｙｂａｔｃｈｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ】．Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，２００１，４３（３）：１３９．１４６．［２９】中国市政工程华北设计研究院．泰安市污水处理试验研究报告［Ｒ】．天津，１９８９．［３０］张波，高廷耀．倒置Ａ２／Ｏ工艺的原理与特点研究［Ｊ】．中国给水排水，２０００，１６（７）：１１—１５．［３１］ＭｉｎｏＴ，ＡｍｎＶＴｓｕｚｕｋｉＹ刃口，．Ｅ髓ｃｔｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｏｎａｃｅｔａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｔｈｅｂｉ０１０９ｉｃａｌｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅｍｏｖａｌｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎａｄｖａｎｃｅｄｉｎｗａｔｅｒｐｏｌｌｕｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ：Ｂｉｏｌｏ画ｃａｌ９８７．ｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅｍｏＶａｌ矗Ｄｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒｓ［Ｍ】．Ｏｘｆｏｒｄ：Ｐｅ曙ａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ｌ【３２】ＬｏｔｔｅｒＬＨ．１１１ｅｒｏｌｅｏｆｂａｃｔ甜ａ１ｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｅｔａｂ０１ｉｓｍｉｎｅｎｈａｎｃｅｄｐｈｏｓｐｈｏｍｓｒｅＩｎｏｖａｌｆｉｏｍｔｈｅａｃｔｉＶｅｓｌｕｄｇｅｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎ０１．，１９８５，１７（１１）：１２７—１３８．ＲＥＣ，酣口，．Ａｓｔｕｄｙｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ［３３】ＬｏｔｔｅｒＬＨ，ＷｅｎｔｚｅｌＭＣ，Ｌｏｅｗｅｎｔｈａｌａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐｐ．ｉｓｏｌａｔｅｄ丘ＤｍａｃｔｉＶｅｓｌｕｄｇｅｉｎａｎａｅｒｏｂｉｃ／ａｎｏｘｉｃ／ａｅｒｏｂｉｃａｎｄａｅｒｏｂｉｃｓｙｓｔｅｍｓｆＪ］．Ｗａｔ．Ｓ．Ａ．，１９８６，（１２）：２０３—２０８．［３４］罗宁，罗固源，徐晓毅．从细菌的生化特性看脱氮除磷的关系［Ｊ】．重庆环境科学，２００３，２５（５）：３３－３５．【３５】ＯｓｈｉＮＴ．ＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉＶａｔｅｄｓｌｕｄｇｅｆｏｒｍｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＰｈｅｌｌｏｌ［Ｊ］．ＥｎＶｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｈｅａｌｔｈ．，１９９９，３４８：１６８９．１７００．（３６】ＥｒｓｃｈｌＡ．Ｃｏｎｔｉｎｕｅｒｓｄｅ黟ａｄａｔｉｏｎｏｆ３－ｈｌｏｒｏａｎｉｌｉｎｅｂｙＣａｌｃｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅ．ｅｎ仃ａｐｐｅｄｃｅｌｌｓｏｆＢｉｏｔｅｃｌⅡｌｏｌ，风Ｐ“如朋Ｄ胛娜口ｃ泐ＶＤｎ岱ＣＡ２８：ｉｎｎｕｅｎｃｅ１９９１。３５：５４４—５５０．ｏｆａｄｄｉｔｉｏｎａｌｓｕｂｓ仃ａｔｅｓ［Ｊ］．ＡｐｌｌＭｉｃｍｂｉａｌ［３７］ＨｙｕｎｇＳＹＮｉｔｒｏｇｅｎｒｅｍｏｖａｌ疗ＤｍｓｙｎｍｅｔｉｃｗａｓｔｅｗａｔｅｒｂｙＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＮＤ）啊ａｎｉｔｒｉｔｅｉｎａｉｎｔｅｍｉｔｔｅｎｔｌｙ－ａｅｒａｔｅｄｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ】．Ｗａｔ．Ｒｅｓ．，１９９９，３３（１）：１４５．１５４．［３８］ＴｈｍｐｅｒＪ．ＧｒｏｏｔｊｅｎＥｎｚｙｍｅ［Ｊ】．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎ０１．，１９８６，８：４７２４７６．［３９】中村．固定化生物脱氮研究［Ｊ］．公害与对策，１９８７，２２（２）：２７．３０．【４０】赵兴利．固定化硝化菌去除废水中氨氮工艺的研究【Ｊ］．环境科学，１９９９，２０（１）：３９４２．［４１】曹国民．新型刖定化细胞膜反应器脱氮研究［Ｊ】．环境科学学报，２００ｌ，２ｌ（２）：１８９．１９３．［４２】杜刚，王京伟．共固定化微生物对养殖水体脱氮的研究【Ｊ］．山西大学学报，２００７，３０（４）：５５０—５５３．［４３］郑平，徐向阳，冯孝善．吲定化硝化细菌耐低温机理的研究［Ｊ】．生物工程学报，１９９７，１３（３）：３３４．３３８．［４４］尚十友，杜建氏，李旭英，等．乌梁素海富营养化及其防治研究［Ｊ】．内蒙古农业大学学报，２００３，２４（４）：７—１２．６３东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究［４５】孙惠民，何江，高兴东，等．乌梁素海沉积物中全磷的分布特征［Ｊ］．沉积学报，２００６，２４（４）：５７９．５８４．［４６】杨志愿，邱业先，李孝坤，等．几株反硝化聚磷菌的筛选及其生理生化特性的鉴定［Ｊ】．苏州科技学院学报，２００９，２６（３）：４２４８．［４７］马放，王春丽，王立立．高效反硝化聚磷菌株的筛选及其生物学特性［Ｊ］．哈尔滨工程大学学报，２００７，２８（６）：６３１．６３５．［４８］ＭｏｈａｍｅｄＭ，ＪｅａｎＰｈｉｌｉｐｐｅＤ，Ｎｉｃ０１ａｓＢ，甜口，．Ｐ０１ｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇａｎｄｄｅＩｌ确助ｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｎａｅｒｏｂｉｃ－ａｎｏｘｉｃａｎｄａｎａｅｒｏｂｉｃ—ａｅｒｏｂｉｃｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂａｔｃｈｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉ０１０９ｙ，１９９９，３（８）：９—１７．【４９】国家环境保护总局编．水和废水监测分析方法（第四版）［Ｍ］．北京：中国环境科学出版社，２００２，［５０】东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１．【５ｌ】布坎南ＲＥ，吉本斯ＮＥ．伯杰细菌鉴定手册（第８版）［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８４．［５２］奥斯伯Ｆ，布伦特Ｒ，金斯敦ＲＥ．精编分子生物学实验指南［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１．［５３】ＬａｎｅＤＪ．１６ｓ／２３ＳｒＥ｝ＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＩｎＥ．ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔａｎｄＭ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ（ｅｄ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ１．ａｃｉｄｔｅｃｔｕｌｉｑｕｅｓｉｎｂａｃｔ谢ａ１ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ［Ｍ］．Ｅｎｇｌａｎｄ：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ｌ９９Ｋ．Ｂｉｏｌｏ西ｃａｌｉｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂａｔｃｈ【５４】Ｖｌｅｌｄ（ｅＧ诵ｔｈｏｘｙｇｅｎｏｒＪＦＭ，ＣｏｍｅａｕＹ，ＯｌｄｈａｍｗｐｈｏｓｐｈａｔｅｒｅｍｏＶａｌ仔ｏｍｗａｓｔｅｗａｔｅｒＬｅｔｔｅｒｓ，ｌ９９８，９：ｎｉ昀ｔｅｒｅａｃｔｏｒＳ阴．ＥｎＶｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎ０１０９ｙ７９１—７９６．［５５】杜连祥，路福平．微生物学实验技术［Ｍ】．北京：中国轻工业出版社，２００５．【５６】张杰，臧景红，杨宏，等．Ａ２／ｏ工艺的同有缺欠和对策研究［Ｊ］．给水排水，２００３，２９（３）：２２—２６．［５７］姜和，曾虹燕，夏葵，等．高效复合菌群ＪＨＤ降解苯酚的特性及其动力学研究［Ｊ】．环境科学学报，２００９，２９（６）：１１８４—１１８９．［５８】马溪平，艾娇，徐成斌，等．耐低温苯酚降解菌的降解动力学研究［Ｊ】．生态环境学报，２００９，１８（２）：４１８＿４２１．［５９】曹桂萍，刘宝亮，陆继来，等．固定化反硝化聚磷菌除磷性能的研究【Ｊ】．节水灌溉，２０１０（３）：４２＿４５．【６０】李博，熊小京，赵志新，等．包埋固定化ＣＫ３脱色菌对偶氮染料Ｒｅａｃｔｉｖｅ性【Ｊ】．水处理技术，２００９，３５（６）：ｌ９．２３．Ｒｅｄ１８０的脱色特【６ｌ】王志霞，王志岩，武周虎．高盐度废水生物处理现状与前景展望【Ｊ】．工业水处理，２００２，２２（１１）：１．４．［６２】Ｗａｎｇ儿，ｚｈａｎＸＭ，ＦｅｎｇａｃｔｉＶａｔｅｄｓｌｕｄｇｅＹＣ，ｅｆｄ，．Ｅ髓ｃｔｏｆｓａｌｉＩｌｉｔｙｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｐｅ怕ｍａｎｃｅｏｆｓｙｓｔｅｍ［Ｊ】．ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌａｎｄＥｎＶｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅＳ，２００５，ｌ８：５－８．ｔｏａ【６３】ＷａｎｇＺ５３（１）：５０－５６．Ｓ，ＫｏｎｇＨＮ，Ｗ、ｌＤＹ．ＡｃｕｔｅａｎｄｃｈｒｏｎｉｃｃｏｐｐｅｒｔｏｘｉｃｉｔｙｓａｌｔｗａｔｅｒｃｌａｄｏｃｅｒａｎＭｏｉｎａｍｏｎｏｇｏｌｉｃａｄａｄａｙ［Ｊ】．ＡｒｃｈｉＶｅｓｏｆＥｎ啊ｒｏｎｍｅｎｔａｌＣｏｎｔ锄ｉｎａｔｉｏｎａｎｄ１’ｏＸｉｃｏｌｏｇｙ＇２００７，［６４】ＧａｅｔｋｅＬＭ，ＣｈｏｗＣＫ．ｃｏｐｐｅｒｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｏｘｉｄａｔｉＶｅｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｎｕｔｒｉｅｎｔｓ［Ｊ】．Ｔｏｘｉｃ０１０９ｙ２００３，１８９（１／２）：１４７—１６３．【６５】张恩栋，王冰，杨宝灵，等．Ｃｕ２＋对固定化小球藻深度除磷及其生理指标的影ｕ向［Ｊ】．广东化工，２００６，３３（７）：８７—８９．［６６】李川，薛建辉，苏莹莹，等．不同ｐＨ条件一卜．铜对Ｉ匍定化小球藻除氮效果的影响［Ｊ】．南京林业大学学报，２００９，３３（４）：１０５—１０８．【６７】王建龙．生物固定化技术与水污染控制［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究硕士期间发表的论文与申请的专利硕士期间已发表的论文１．洪武林，谢学辉，于文娟，张武刚，柳建设．假单胞菌Ｐ１．１脱氮除磷特性及其动力学研究，环境科学与技术，２０１２，９～１１．２．于文娟，谢学辉，洪武林，范风霞，柳建设．嗜水气单胞菌ＲＢ５．Ｍ１的分离鉴定及脱色条件研究．微生物学通报，２０１２，２．３．于文娟，谢学辉，洪武林，柳建设．菌株ＲＢ５一Ｍ１脱色活性黑５的动力学及固定化条件研究．环境工程学报，２０１２，４．４．张武刚，王兆慧，王焕丽，张诚，洪武林，郭耀广，柳建设．Ｆｅｎｔｏｎ氧化高浓度泥浆法处理矿山废水中试研究，环境工程学报．己申请的专利１．柳建设，张诚，王兆慧，付瑾，王慧萍，张萌，袁瑞霞，张武刚，洪武林，叶洁琼，吴根英．发明专利“一种新的矿山废水治理方法”，专利申请号２０１０１０５８９０８２．Ｘ．２．柳建设，于文娟，谢学辉，王兆慧，许贺，洪武林，张武刚．发明专利“一种脱色多种活性染料的细菌筛选方法”，专利申请号２０１１１０１７０４２６．８．东华大学硕士学位论文反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究致谢本论文是在导师柳建设教授的悉心指导下完成的。在过去的２年半以来，无论在科研上还是为人处事方面导师都给了我很大的帮助。导师渊博的学识、严谨的科研态度、谦虚的师者风范以及忘我的工作作风都给我留下了深刻的印象，是我将来工作学习的楷模。感谢柳老师多年来的谆谆教诲，特别感谢他从开题到撰写论文为我倾注的心血与智慧！由衷地感谢课题组谢学辉、王兆慧、许贺等老师在过去的两年多给予我莫大的帮助，特别要感谢谢学辉老师在科研上给我的支持与指导。老师们脚踏实地的工作作风、执着的科研态度以及专业的科研水平都给我留下了深刻的印象，让我受益良多。在此，向他们表示最真诚的谢意！感谢课题组钱林博士、袁瑞霞博士、郑春丽博士、ＮａｚｙａｄＳＲａｍｊａｕｎ博士、郭耀广博士、翟平博士、王焕丽博士、肖冬雪博士以及已经毕业的各位师兄师姐的关照与支持。感谢那些两年多来与我一起奋斗的同学们——张武刚、于文娟、叶洁琼、郑巧丽和杨萍，谢谢你们的理解与无私帮助。同时要感谢袁学武、黄鹏、范凤霞、徐蕾、吴根英、许双姐、刘仁兰等师弟师妹们给予的帮助！感谢韩少华、白舟、祁明亮、王恩强、谭小旺、薛冰、康丹妮、方敏、林长青等好友给予我生活上与学习上的帮助！最后感谢自己的家人给予我的无限支持与关照！洪武林２０１２年１月反硝化聚磷菌的分离鉴定及其固定化应用研究

作者：

学位授予单位：

洪武林东华大学

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