瘦素基因敲除肥胖大鼠的血糖及病理长期观察

２０１４年３月　中国比较医学杂志　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　Ｍａｒｃｈ，２０１４　Ｖｏ１．２４　ＮＯ．３　第２４卷第３期　瘦素基因敲除肥胖大鼠的血糖及病理长期观察　张　丽，关菲菲，张　旭，陈　炜，孙彩显，张连峰　（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京１０００２１）　【摘要】　目的对Ｌｅｐｔｉｎ基因敲除ｓＤ大鼠血糖变化及病理表型进行长期分析，为使用该大鼠作为糖尿病和　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋大鼠和Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠肝脏中Ｌｅｐｔｉｎ的表达。利用称　脂代谢模型积累数据。方法量方法测定Ｌｅｐｔｉｎ基因敲除的ｓＤ大鼠（Ｌｅｐｔｉｎ一／一）１，３，６，８月龄的体重变化，利用稳豪血糖仪采尾血测定１，３，　６，８月龄Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠空腹血糖值。ＨＥ染色和免疫组织化学观察Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠胰腺及肝脏的病理学变化。　结果Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠肝脏中表达变短的功能异常的Ｌｅｐｔｉｎ蛋白。Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠从１月龄开始出现显著的体　重增加，８月龄时雌性体重为８８４　ｇ，雄性体重可以达到１２００　ｇ，是野生ｓＤ大鼠的２倍。自１月龄起，Ｌｅｐｔｉｎ一／一　雌鼠的空腹血糖值显著高于野生大鼠，在１月龄到６月龄之间差别明显（４０％～２６％），到８月龄和野生大鼠恢复　到近正常水平。８月龄Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠肝脏肝小叶中出现大量脂肪空泡，胰腺内较多脂肪细胞浸润、胰岛数量明　显增多，体积增大，胰岛素阳性Ｂ细胞增多。结论血糖。　Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠表型表现为肥胖，脂肪肝，胰岛增生和早期高　【关键词】　瘦素；基因敲除；空腹血糖；肥胖；大鼠　【中图分类号】Ｒ３３２　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７１．７８５６（２０１４）０３－００４５—０５　ｄｏｉ：１０．３９６９．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１．７８５６．２０１４．００３．０１０　Ｌｏｎｇ—ｔｉｍｅ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｌｅｐｔｉｎ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｏｂｅｓｅ　ｒａｔｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｌｉ，ＧＵＡＮ　Ｆｅｉ—ｆｅｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｕ，ＣＨＥＮ　Ｗｅｉ，ＳＵＮ　Ｃａｉ－ｘｉａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｌｉａｎ—ｆｅｎｇ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＭＳ）＆Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｃｅｎｔｒｅ，Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ（ＰＵＭＣ），　Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００２１，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｍｏｒｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄａｔａ　ｏｆ　Ｌｅｐｔｉｎ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ＳＤ　ｒａｔｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｕｓｅｒ，ｔｈｅ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｓｔｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　Ｌｅｐｔｉｎ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｒａｔｓ（Ｌｅｐｔｉｎ一／一）ａｎｄ　ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ｌｅａｎ　ｒａｔｓ（Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋）ｗｅｒｅ　ｗｅｉｇｈｅｄ　ｕｐ　ａｔ　１，３，６，８　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｆ　ａｇｅ．Ｆａｓｔｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｆ　Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋ｒａｔｓ　ａｎｄ　Ｌｅｐｔｉｎ一／一ｒａｔｓ　ａｔ　１，３，６，８　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｆ　ａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　Ｏｎｅ　Ｔｏｕｃｈ＠ｂｒａｎｄ　ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒｓ　ｏｆ　Ｌｅｐｔｉｎ一／一ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＨＣ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｓｈｏｒｔ　ｎｕｌｌ　Ｌｅｐｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｅｐｔｉｎ…／ｒａｔｓ．　Ｌｅｐｔｉｎ一／一ｒａｔｓ　ｂｅｃｏｍｅ　ｈｅａｖｉｅｒ　ｔｈａｎ　Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋ｒａｔｓ　ｓｉｎｃｅ　ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｏｎｅ　ｍｏｎｔｈ　ｏｌｄ．Ｔｈｅ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　Ｌｅｐｔｉｎ一／一　［基金项目］国家“重大新药创制”科技重大专项课题“啮齿类研发平台创新药物研究开发技术平台建设”（２０１１ＺＸ０９３０７—３０２）；国家科技　支撑计划课题“神经和代谢疾病基因工程模型的建立”（２０１２ＢＡＤ９Ｂ０２）．　［作者简介］张丽，女，博士，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｉｑｑ２００４＠１２６．ｔｏｍ。　［通讯作者］张连峰，Ｅ—ｍａｉｌ：Ｚｈａｎｇｌｆ＠ｃｎｉｌａｓ．ｏｒｇ。　４６　中国比较医学杂志２０１４年３月第２４卷第３期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ　２０１４，Ｖｏ１．２４．Ｎｏ．３　ｒａｔｓ　ａｔ　８　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｆ　ａｇｅ　ｗａｓ　ｔｗｉｃｅ　ａｓ　ｈｅａｖｙ　ａｓ　Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋ｒａｔｓ，ｆｅｍａｌｅ　Ｌｅｐｔｉｎ一／一ｒａｔｓ　ｗｅｉｇｈｉｎｇ　８８４ｇ，ａｎｄ　ｍａｌｅ　Ｌｅｐｔｉｎ　一／一ｒａｔｓ　ｗｅｉｇｈｉｎｇ　１２００ｇ．Ｏｖｅｒｔ　ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｍｏｎｔｈ　ａｆｔｅｒ　ｂｉｒｔｈ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｌｅｐｔｉｎ＋／　＋ｆｅｍａｌｅ　ｒａｔｓ，ｔｈｅ　ｆａｓｔｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｆ　Ｌｅｐｔｉｎ一／一ｆｅｍａｌｅ　ｒａｔｓ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　４０％一２６％ｆｒｏｍ　１　ｔｏ　６　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｌｄ．　Ａｆｔｅｒ　ｔｈａｔ，ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｖａｌｕｅｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ　ｂｅｃｏｍｅ　ｎｅａｒｌｙ　ｎｏｒｍａｌ　ａｔ　８　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｆ　ａｇｅ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ｌｅｐｔｉｎ一／一ｒａｔｓ　ａｔ　８　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｆ　ａｇｅ　ｈａｄ　ａ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ，ｍｏｒｅ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ｉｓｌｅｔｓ　ｗｉｔｈ　ｌａｇｅｒ　ｖｏｌｕｍｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ｂｅｔａ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌ　ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ　ａｎｄ　ｅａｒｌｙ　ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ．　Ｌｅｐｔｉｎ一／一ｒａｔ　ｗｅｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ，ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ，　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｌｅｐｔｉｎ；Ｋｎｏｃｋ　ｏｕｔ；Ｆａｓｔｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ；Ｏｂｅｓｉｔｙ；Ｒａｔ　瘦素（Ｌｅｐｔｉｎ）是一个主要由白色脂肪组织分泌　尿病等模型提供了基础数据。　的蛋白质类激素…，其与中枢神经系统的瘦素受体　结合能够启动调节摄食和机体能量平衡，当瘦素缺　失或者受体缺失，会导致肥胖发生　。　美国杰克逊实验室发现的一种隐性遗传的　Ｌｅｐｔｉｎ自发突变小鼠（ｏｂ／ｏｂ）　，表现为摄食过度、　肥胖、葡萄糖耐受、高血浆胰岛素水平、不孕不育，　因此被广泛地应用于糖尿病、肥胖、心血管和代谢　类疾病研究　。　尽管大鼠是使用量仅次于小鼠的实验动物，而　且相对于小鼠，大鼠与人类的关系近了大约４００—　５００万年　，其在生理、代谢、神经系统疾病等方面　比小鼠有更好的表现　。然而，传统基因打靶技术　受到大鼠的Ｅｓ细胞全能性局限，而一度未能实现　Ｌｅｐｔｉｎ敲除大鼠的建立。随着锌指酶（ＺＦＮ）和类转　录激活因子效应因子核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）等技术的不　断完善，使大鼠基因敲除实用化　。２０１２年，　Ｓｅｒｇｌｏ　Ｖａｌｒａ等　叫利用ＺＦＮ技术获得了一种Ｌｅｐｔｉｎ　敲除大鼠，是在该基因外显子１和内含子上发生了　１５１个碱基片断的缺失，Ｌｅｐｔｉｎ蛋白无法正常表达。　该纯合子大鼠出现摄食增加，肥胖，血清中总胆固　醇、高密度和低密度胆固醇显著增加，有明显的高　胰岛素血和糖耐受受损。　我们利用ＴＡＬＥＮｓ技术建立了Ｌｅｐｔｉｎ基因敲除　的ｓＤ大鼠品系（Ｌｅｐｔｉｎ一／一），并对年轻Ｌｅｐｔｉｎ　一／一大鼠的体重、脂肪含量、糖代谢等进行了初步　分析报，发现４月龄的Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠已经表现　出肥胖、高胰岛素血、高脂血和糖代谢异常…　。虽　然目前世界上几个实验室建立了Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠，　但是一方面敲除的区域不同¨　“　，另一方面，缺少　对Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠长期病理生理变化的分析数据，　影响了Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠的作为肥胖、糖尿病等疾病　模型的使用。本文对１一－８月龄Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠及　同窝瘦大鼠（Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋）的血糖变化及病理表型　进行了对比分析，为Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠作为肥胖、糖　１材料和方法　１．１　动物　Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠背景品系为ｓＤ，在本实验室　繁育（ＳＣＸＫ（京）２０１３—００２），选择基因敲除纯合子　Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠和同窝阴性大鼠（Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋）。　雌鼠：Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋（ｎ＝５）和Ｌｅｐｔｉｎ一／一（ｎ＝５）　各５只；雄鼠：Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋４只（ｎ＝４）和Ｌｅｐｔｉｎ　一／一２只（ｎ＝２）。本实验方案得到中国医学科学　院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员　会的批准，批准号为ＩＬＡＳ－ＧＣ．２０１２－００１。　１．２　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测Ｌｅｐｔｉｎ的表达　提取Ｌｅｐｔｉｎ一／一大鼠和同窝阴性Ｌｅｐｔｉｎ＋／＋　大鼠肝组织总蛋白，ＢＣＡ法测定浓度，进行ＳＤＳ—　ＰＡＧＥ凝胶电泳，将蛋白条带转移到０．４５　Ｉｘｍ硝酸　纤维素膜上，置于５％的脱脂奶粉封闭液中，室温　１　ｈ，加入ＴＢＳＴ稀释的兔抗Ｌｅｐｔｉｎ多克隆抗体（１：　５００）（ａｂｌ１７７５１，Ａｂｅａｍ，美国），４。Ｃ孵育过夜，用　ＴＢＳＴ洗膜三次，每次１０　ｒａｉｎ。然后加入１：１５０００辣　根过氧化物酶标记的山羊抗兔ＩｇＧ，室温杂交１　ｈ。　采用ＨＲＰ—ＧＡＰＤＨ（康成生物，中国）作为内参，将膜　置于化学发光剂中，用ｘ光胶片曝光、显影及定影。　１．３体重测定　从１月龄开始，分别于１、３、６、８月龄给待测大　鼠称重。　１．４空腹血糖测定　分别于１、３、６、８月龄，待测大鼠禁食过夜（不　禁水），次日上午八点采尾血稳豪血糖仪测定血　糖值。　１．５组织学观察　２％戊巴比妥钠麻醉牺牲大鼠，打开腹腔取出胰　腺及肝脏固定于１０％中性福尔马林中２４　ｈ，脱水，　石蜡包埋及切片ＨＥ染色，抗胰岛素（ｉｎｓｕｌｉｎ）多克　隆抗体行免疫组织化学（４５９０ｓ，１：１００，Ｃｅｌｌ　中国比较医学杂志２０１４年３月第２４卷第３期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ　２０１４，Ｖｏ１．２４．Ｎｏ．３　４９　３７２（６５０５）：４２５—４３２．　（７）：１１８３—１１９７．　［２］　Ｔｒｉｔｏｓ　ＮＡ，Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ　ＣＳ．Ｌｅｐｔｉｎ：ｉｔｓ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｏｂｅｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｂｅｙｏｎｄ　［１５］Ｇｅｎｕｔｈ　Ｓ，Ａｌｂｅｒｔｉ　ＫＧ，Ｂｅｎｎｅｔｔ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｆｏｌｌｏｗ—ｕｐ　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ，２００３，２６　（１１）：３ｌ６０～３ｌ６７．　［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１９９７，４０（１２）：１３７１—１３７９．　［３］　Ｉｎｇａｌｌｓ　ＡＭ，Ｄｉｃｋｉｅ　ＭＭ，Ｓｎｅｌｌ　ＧＤ．Ｏｂｅｓｅ，ａ　ｎｅｗ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｏｕｓｅ　ｍｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｈｅｒｏｄ，１９５０，４１（１２）：３１７—３１８．　［１６］Ｔａｂａｋ　ＡＧ，Ｈｅｒｄｅｒ　Ｃ，Ｒａｔｈｍａｎｎ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ　ｈｉｇｈ－　［４］　Ｌｉｎｄｓｔｒｉｆｍ　Ｐ．Ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｏｂｅｓｅ—ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ　ｍｉｃｅ［ｏｂ／　ｏｂ　ｍｉｃｅ］［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ　Ｗｏｒｌｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，２９（７）：６６６　ｒｉｓｋ　ｓｔａｔｅ　ｆｏｒ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，２０１　２，３７９　（９８３３）：２２７９—２２９０．　６８５．　［１７］Ｔｈｅ　Ｅｘｐｅ￣Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　［５］　Ｙａｎｇ　Ｓ，Ｓｍｉｔ　ＡＦ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ，ｍｏｕｓｅ，ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｇｅｎｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ，２００４，１４（４）：５１７—５２７．　Ｒｅｐｏｒｔ）［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ，１９９８，２１（Ｓｕｐｐ１．１）：ｓ５一Ｓ１９．　［６］　王贵利，张连峰．基因工程大鼠研究进展［Ｊ］．中国比较医　学杂志，２０１３，２３（３）：７１—７６．　［７］　Ｇｅｕｒｔｓ　ＡＭ，Ｃｏｓｔ　ＧＪ，Ｆｒｅｙｖｅｒｔ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｒａｔｓ　ｖｉａ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｚｉｎｃ—Ｆｉｎｇｅｒ　Ｎｕｅｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００９，３２５（５９３９）：４３３．　［８］　Ａｎｄｒｅｗ　Ｊ．Ｗｏｏｄ，Ｔｅ—Ｗｅｎ　Ｌｏ，Ｂｒｙａｎ　Ｚｅｉｔｌｅｒ，ｅｔ　ａ１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　Ａｃｒｏｓｓ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　ＺＦＮｓ　ａｎｄ　ＴＡＬＥＮｓ［Ｊ］．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｍａｇａｚｉｎｅ．２０１１，３３３（６０６０）：３０７．　［９］　Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｔ，Ｃｌａｉｒｅ　Ｕ，Ｓｅｖｅｒｉｎｅ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｒａｔｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｅｍｂｒｙｏ　ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＡＬＥＮｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，　２０１１，２９：６９５—６９６．　［１０］　Ｓｅｒｇｌｏ　Ｖ，Ｃｈａｎｇ　Ｙ，Ａａｒｏｎ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｅａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｌｅｐｔｉｎ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｒａｔ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，　２０１２，１５３（１１）：５６２２—５６２８．　［１１］　关菲菲，张旭，陈炜，等。利用ＴＡＬＥＮｓ技术制备瘦素基因　敲除的大鼠［Ｊ］。中国比较医学杂志，２０１３，２３（８）：３８　—４３．　ｃｌ２］　Ｊａｃｏｂ　Ｈｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｅｓ　ａｎｄ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ，１９９９，９（１１）：１０１３—１０１６．　［１３］　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ［Ｊ］，２０１０，３３　Ｓｕｐｐｌ　１：￥６２—　６９．　［１４］　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ，１９９７，２０　［１８］Ｗｅｓｔｍａｎ，Ｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｂｅｓｅ—ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１９６８，４（３）：１４１—１４９．　［１９］　Ｅｄｖｅｌｌ，Ａ．ａｎｄ　ＬｉｎｄｓｔｒＯｍ，Ｐ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｙｏｕｎｇ　ｏｂｅｓｅ　ｈｙｐｅｒｇｌｙｅｅｍｉｅ　ｍｉｃｅ（Ｕｍｅａ　ｏｂ／ｏｂ）［Ｊ］．　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１９９５，４４（７）：９０６—９１３．　［２０］　Ｅｄｖｅｌｌ，Ａ．ａｎｄ　Ｌｉｎｄｓｔｒｔｉｍ，Ｐ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｙｏｕｎｇ　ｎｏｒｍｏｇｌｙｅｅｍｉｅ　ｍｉｃｅ（ＵｍｅＡ　ｏｂ／ｏｂ）［Ｊ］．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１４０（２）：７７８—７８３．　［２１］　Ｗｅｓｔｍａｎ，Ｓ．Ｔｈｅ　ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ｏｆ　ｏｌｄ　ｏｂｅｓｅ—ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｍｅｄ．Ｕｐｓａｌ，１９６８，７３（１）：８１—８９．　［２２］　Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｏｂｅｓｅ　ａｎｄ　ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｔｗｏ　ｍｕｔａｎｔ　ｇｅｎｅｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｄｉａｂｅｔｅｓ－ｏｂｅｓｉｔｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１９７８，１４　（３）：１４１—１４８．　［２３］　Ｇａｒｒｉｓ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ　Ｇａｒｒｉｓ，Ｂ．Ｌ．Ｃｙｔｏｅｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｉｓｌｅｔ　ｈｙｐｅｒｃｙｔ０ｌｉｐｉｄｅｍｉａ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｄｉａｂｅｔｅｓ（ｄｂ／ｄｂ）　ａｎｄ　ｏｂｅｓｅ（ｏｂ／ｏｂ）ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，７１（５）：２３１—２４０．　［２４］Ｍａｔｈｕｒ　Ａ，Ｍａｒｉｎｅ　Ｍ，Ｌｕ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ），２００７，９（４）：３ｌ２—３１８．　［２５］Ｔｕｓｈｕｉｚｅｎ　ＭＥ，Ｂｕｎｃｋ　ＭＣ，Ｐｏｕｗｅｌｓ　ＰＪ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｆａｔｅｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｂｅｔａ—ｃｅｌｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｅｎ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ，２００７，３０（１１）：２９１６—２９２１．　［修回日期］２０１４－０２－１４