卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109966287 A(43)申请公布日 2019.07.05

(21)申请号 201910290468.1(22)申请日 2019.04.11

(71)申请人 延安大学

地址 716000 陕西省延安市宝塔区圣地路

580号

申请人 遵义市第一人民医院

(72)发明人 岳昌武　李晓倩　吕玉红　刘铁　

田鹏　赵雯　孙心悦　崔相宜　党冬梅　田红英　(74)专利代理机构 西安弘理专利事务所 61214

代理人 宁文涛(51)Int.Cl.

A61K 31/357(2006.01)A61P 35/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图7页

(54)发明名称

卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用(57)摘要

本发明提供了卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用，整合素调控黑色素瘤生长、侵袭和转移，是黑色素瘤靶向药物治

卤化Ⅱ型聚酮类抗生素通过与黑疗的重要靶点，

色素瘤细胞表面受体整合素a亚基LFA-1a/ITGAL结合，激动整合素LFA-1，从而激活PI3K/Akt通路调控下游黑色素瘤细胞凋亡和分裂相关的通路的改变，从而抑制黑色素瘤细胞增殖。

CN 109966287 ACN 109966287 A

权　利　要　求　书

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1.卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的结构为：

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卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用

技术领域

[0001]本发明属于基因生物医药领域，具体涉及卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用。

背景技术

[0002]黑色素瘤是临床上常见的皮肤恶性黑色素瘤，是由起源于神经脊的黑素细胞发展而来的上皮恶性黑色素瘤，占所有恶性黑色素瘤的1％～3％，并以6％～7％的增长速度逐年递增，成为了发病率增长最快的恶性黑色素瘤之一。在我国，黑色素瘤每年的发病病例约2万，黑色素瘤已成为危害我国人民健康和生命的疾病之一。黑色素瘤进展快且转移早，对常规的放化疗敏感性低，尽管目前已经研发出多种生物靶向药物，可是快速耐药性的出现使得黑色素瘤，特别是晚期黑色素瘤的预后未得到有效改善，患者平均生存期只有6～9个月。所以需要进一步研究药物用以抑制黑色素瘤研究，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对黑色瘤细胞B16显示了较好的抑制作用，值得进一步开发，有可能为黑色素瘤治疗药物的研发指明方向，给黑色素瘤患者带来希望。发明内容

[0003]本发明的目的是提供卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用，对抑制黑色素瘤细胞增殖有显著的效果。[0004]本发明所采用的技术方案是，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用。

[0005]本发明的其他特征还在于，

[0006]卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的结构为：

[0007]

[0008]

本发明的有益效果为，通过将卤化Ⅱ型聚酮类抗生素用于临床治疗黑色素瘤疾

病，可以抑制黑色素瘤细胞增殖，为治疗黑色素瘤的临床研究提供了非常高的研究价值。

附图说明

[0009]图1为1.0μmol/L的a亚基LFA-1a/ITGAL与不同浓度卤化Ⅱ型聚酮类抗生素结合的荧光淬灭效果分析图；

[0010]图2为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对BAD基因表达影响情况分析图图；

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图3为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对m-TOR基因表达影响情况分析图图；

[0012]图4为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对FOXO3基因表达影响情况分析图图；[0013]图5为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对IKK-α基因表达影响情况分析图图；

[0014]图6为未加入卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；[0015]图7为加入浓度为2μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0016]图8为加入浓度为4μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0017]图9为加入浓度为8μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0018]图10为加入浓度为16μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0019]图11为加入浓度为32μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0020]图12为加入浓度为64μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0021]图13为加入浓度为128μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0022]图14为加入浓度为256μM/mL的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的黑色素瘤细胞显微镜下细胞数量图；

[0023]图15是黑色素瘤细胞中加入不同浓度卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的细胞存活率变化图。

具体实施方式

[0024]本发明基于卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对黑色素瘤细胞增殖抑制效应的分析，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。[0025]整合素调控黑色素瘤生长、侵袭和转移，是黑色素瘤靶向药物治疗的重要靶点，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素通过与黑色素瘤细胞表面受体整合素a亚基LFA-1a/ITGAL结合，激动整合素LFA-1，从而使PI3K/Akt通路调控下游黑色素瘤细胞凋亡和分裂相关的BAD基因、m-TOR基因、FOXO3基因、IKK-α基因的基因表达水平提高，加速黑色素瘤细胞的凋亡和分裂，达到抑制黑色素瘤细胞增殖的作用。[0026]如图1所示，图中的曲线从上到下依次代表1.0μmol/L的a亚基LFA-1a/ITGAL分别与0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9μmol/L的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的荧光淬灭效果分析，从图中可以看出，随着卤化Ⅱ型聚酮类抗生素浓度的增加，荧光强度越来越弱，因此，可以判断随着卤化Ⅱ型聚酮类抗生素浓度的增加，含有整合素a亚基LFA-1a/ITGAL的蛋白质被结合的越来越多，剩余的蛋白质含量越来越少，表明卤化Ⅱ型聚酮类抗生素与a亚基LFA-1a/ITGAL之间存在相互作用。[0027]如图2至5所示，Control代表不加卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的肝癌细胞对照；8h、12h、16h代表向肝癌细胞加入浓度为20μM/ml的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素孵育8h、12h、16h。

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BAD基因、m-TOR基因、FOXO3基因以及IKK-α基因均为PI3K/Akt通路的下游基因，且

BAD基因、m-TOR基因、IKK-α基因均是黑色素瘤细胞的促凋亡基因，FOXO3基因为抑癌基因，从图中可以看出，加入卤化Ⅱ型聚酮类抗生素后，BAD基因、m-TOR基因、FOXO3基因以及IKK-α基因的基因表达水平均有明显的提高，从而可以判断卤化Ⅱ型聚酮类抗生素可以提升BAD基因、m-TOR基因、FOXO3基因以及IKK-α基因的基因表达水平。[0029]为了更好的理解本发明的实质，下面将用卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的药理实验来说明其在抑制黑色素瘤细胞增殖中的应用。[0030](1)细胞复苏：取出-80℃冻存的人体黑色素瘤细胞株B16，迅速放入37℃水浴中解冻；将细胞悬液转移至含2mL的完全培养基的15mL离心管中，800rpm，离心3min。取1mL完全培养基重新悬浮沉淀的细胞，并转移至含3mL完全培养基的细胞培养瓶中吹散均匀，置于37℃CO2培养箱培养。[0031](2)细胞传代：弃去培养瓶中的培养基，PBS液清洗2次，加入1mL0.25％胰蛋白酶消化倒置显微镜下观察细胞形态，收缩变圆时用3mL完全培养培养基终止消化。轻轻吹散细胞培养瓶内的贴壁细胞，将细胞悬液转移至15mL离心管，800rpm，离心3min。取1mL完全培养基重新悬浮沉淀的细胞，并转移至含3mL完全培养基的细胞培养瓶中吹散均匀，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。[0032](3)细胞冻存：取出铺展至细胞培养瓶底部面积80％的细胞，PBS清洗2次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化倒置显微镜下观察细胞形态，收缩变圆时用3mL完全培养培养基终止消化。轻轻吹散细胞培养瓶内的贴壁细胞，将细胞悬液转移至15mL离心管，800rpm，离心3min。细胞沉淀用1mL冻存液重新悬浮后转移至1.8mL冻存管内，4℃放置30min，-20℃放置1h，置于-80℃保存。[0033](4)细胞给药：取出传代的细胞，弃掉培养瓶内的培养基，PBS清洗2次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化，当细胞收缩变圆时，3mL完全培养培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使细胞培养瓶内的贴壁细胞充分脱落，收集细胞悬液转移至15mL离心管，800rpm，离心3min。细胞沉淀用完全培养基调整细胞浓度为5×104个/mL，取100μL细胞悬液，分别加入96孔板培养孔，置于37℃CO2培养箱培养24h。待细胞生长至培养孔的80％时，取6μL的zunyimycin C母液加入到1.5mL离心管中，用完全培养基稀释至1mL。依次将该药物孔稀释成2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM、128μM、256μM等8个浓度作为测试浓度，每个药物组平行6个复孔，37℃、5％CO2培养箱作用24h后结束培养。[0034](5)吸光度测定：弃去96孔板内的液体，PBS清洗每个孔板至无残留，加入90μL完全培养基和10μL cck8试剂，37℃继续孵育4h后终止培养，酶标仪于490nm处测定OD值。[0035]不同浓度的卤化Ⅱ型聚酮类抗生素作用于黑色素瘤细胞24h后，观察黑色素瘤细胞的细胞数量变化，并使用cck8测定药物对细胞增殖的影响，与正常黑色素瘤细胞进行对比。

[0036]如图6至图14所示，可以看出，当药物浓度在2、4μM时，在倒置显微镜下观察细胞形态及数量上与对照组并无明显差异；但当药物浓度在8μM时，细胞不仅在数量上有所减少，而且形态发生变化，部分细胞崩解；当药物浓度增大至16μM时，细胞形态上出现变圆，细胞崩解较为明显；当药物浓度增大至32μM时，细胞数量明显减少，几乎看不到正常形态的活细胞；随着剂量的加大，细胞死亡数目增加，当药物浓度增加至64μM时，绝大部分细胞漂浮，细

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胞形态成透明圆球状。[0037]如图15所示，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素的浓度越大，黑色素瘤细胞的细胞存活率就越低，当卤化Ⅱ型聚酮类抗生素浓度足够大时，黑色素瘤细胞的存活率几乎为零。[0038]根据各组OD490值的平均值和标准差，按公式计算细胞生长抑制率。

[0039]

IC50(half maximal inhibitory concentration)是指药物的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序，如细胞死亡一半时的浓度或剂量，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。

[0041]实验数据处理采用SPSS18.0及GraphPadPrism6.0统计软件，计算药物的半抑制浓度IC50，见表1，表1为不同浓度卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对黑色素瘤细胞的细胞抑制率分析表，从表1中可以看出，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素浓度越高，对黑色素瘤细胞的抑制率则越高。

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[0044]

表1

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图3

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图5

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图15

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